Introduction
Los telómeros protege extremos cromosómicos de fusión aberrante y la degradación. los telómeros de los mamíferos está compuesto por G-ricos repite hexameric, TTAGGG, y complejos shelterin. La secuencia de los telómeros de repetición del nematodo es similar a los de los mamíferos (TTAGGC). La mayoría de los eucariotas utilizan telomerasa añadir repeticiones teloméricas a sus extremos cromosómicos. Sin embargo, 10 - 15% de las células cancerosas utilizan telomerasa mecanismo independiente, conocido como alternativa alargamiento de los telómeros (ALT) 3. Anteriormente, se informó de que las repeticiones de los telómeros y sus secuencias asociadas, nombradas como TALT, se amplificaron en los telómeros de las líneas mutantes de telomerasa que sobrevivieron a la esterilidad crítico 2.
Longitud de los telómeros se midió por PCR cuantitativa o por transferencia de Southern, que proporciona duración media de los telómeros totales 4,5,6,7. Leer recuento de repetición del telómero en toda la secuenciación del genoma de datos es también un indicador del contenido de los telómeros en total 8. Aunque el pecadoGLE Análisis de la longitud del telómero (ESTELA) podría proporcionar la longitud de los telómeros una sola, no puede proporcionar la información espacial de los telómeros 9. Mientras POT-1 :: proteína indicadora mCherry proporciona la información espacial de los telómeros in vivo, no se representan las longitudes de los telómeros de doble cadena, como POT-1 es una proteína de una sola hebra de unión 10 de los telómeros.
Mientras que los métodos antes mencionados proporcionan la información promediada de secuencias repetitivas, hibridación in situ fluorescente (FISH) permite observar la cantidad y el patrón espacial de las secuencias individuales de interés en una escala cromosómica. En lugar de la purificación del ADN, los tejidos o las células se fijan para preservar la información espacial nativa en FISH. Por lo tanto, el pescado es una herramienta cuantitativa y cualitativa para la observación de secuencias repetidas individuales, tales como repeticiones de los telómeros.
Este protocolo proporciona un método eficiente para la detección simultánea de ambos telomeros y otras repeticiones por motivos de mejora de los métodos descritos anteriormente 11,12. C. elegans larvas o adultos organismo multicelular con células altamente diferenciadas. La heterogeneidad de las células impide en el análisis cuantitativo de un gran número de puntos de los telómeros. Para maximizar el número de células analizadas, los embriones se aíslan y se extendió sobre los portaobjetos recubiertos con polilisina para los peces. Además, este protocolo también se puede combinar con inmunofluorescencia.
Como prueba de que funciona el protocolo, se muestra que es posible observar y cuantificar dos secuencias repetitivas diferentes. sonda de ADN contra TALT1 se generó con PCR simple incorporación de digoxigenina-dUTP. A continuación, esta sonda TALT1 y la sonda PNA telómero marcado con fluorescencia se hibridaron simultáneamente. Posteriormente, digoxigenina se detectó mediante métodos de inmunofluorescencia canónicas. Presentamos aquí las imágenes representativas cuando las TALT1 colocalized con el telómero en TRT-1
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Protocol
1. Las sondas de etiquetado con digoxigenina-dUTP por PCR
- Realizar etiquetado PCR con 10x mezcla de dNTP que contiene digoxigenina-dUTP como se describió anteriormente 13.
- Se purifica el producto de PCR con la purificación spin-columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Si la sonda es más corta que 200 pares de bases, eliminar libre digoxigenina-dUTP con cromatografía de columna de spin-de la mezcla de reacción en lugar de purificación spin-columna.
2. Preparación de portaobjetos revestidos de polilisina
Nota: El procedimiento completo dura aproximadamente 2 horas. La mayor parte de los pasos se ejecutan desde la temperatura ambiente a excepción de la etapa de secado.
- Limpieza de las diapositivas
- Colocar los portaobjetos en un recipiente de plástico y enjuague brevemente los portaobjetos con agua destilada (DW). Eliminar el agua y llenar el recipiente con DW contiene un limpiador de vidrio 1%.
- Agitar las diapositivas de 15 min a 50 rpm a temperatura ambiente (RT). Se lavan los portas con DW 3veces durante 5 min cada uno a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos con etanol al 70% durante 15 minutos con agitación. Desechar el 70% de etanol y colocar los portaobjetos en un bloque seco de 65 ° C y secar al aire durante 15 minutos.
- polilisina recubrimiento de láminas de vidrio de múltiples pocillos
Nota: La polilisina recubrimiento de vidrio deslizante es un paso importante, ya que proporciona la adherencia de la muestra a lo largo del procedimiento de tinción. Mal de diapositivas recubierto dará lugar a la pérdida de muestra.- Diluir la solución de polilisina de stock a 0,01% (w / v) en agua destilada. Añadir 20 l de la diluido 0,01% (w / v) de polilisina a los pocillos de un portaobjetos de vidrio limpio.
- Incubar el portaobjetos de vidrio durante 5 min a RT.
- Colocar los portaobjetos en un bloque seco de 65 ° C y secar al aire durante 1 hora.
- Almacenar las diapositivas polilisina en la casilla libre de polvo.
3. Fijación de Worms en el portaobjetos de vidrio (Figura 1)
- Preparación de embriones para FISH
Nota: gusanos de la cosecha antes de que todo tél alimentaria bacteriana es consumido por observación de los medios de cultivo bajo el microscopio. El hambre reduce la producción de huevos de gusanos adultos y aumenta la eclosión de los huevos. Métodos detallados se describen en 14,15.- Crecer los gusanos en 50 mm placa de Petri de acuerdo con métodos estándar 14.
- Después de todo la comida bacteriana se consume, cortar los medios de agar en el trimestre con una espátula. Esterilizar la espátula antes de cortar para evitar la contaminación.
- Poner todo el trozo de agar en la placa de 100 mm de medios de cultivo de nematodos (NGM). Girar la pieza de agar revés para los gusanos para llegar a la comida fresca bacteriana.
- Después de 48 a 72 horas, recoger los gusanos con tampón M9. Añadir 3 - 5 ml de tampón de M9 en la placa de NGM. tampón M9 pipeta en la superficie de NGM para lavar los gusanos.
- Recoger el líquido con gusanos y añadir a un tubo de 15 ml.
Nota: Si hay restos de agar después de la cosecha, centrifugue los gusanos en una solución de sacarosa al 30%. Mientras que los desechos se sedimentan, gusanos flotan enla superficie. - Añadir M9 buffer para compensar el volumen a 15 ml. Se precipitan los gusanos por centrifugación a 300 xg durante 3 min y eliminar la mayor parte del tampón de M9. Repita este paso 2 veces más.
Nota: Si los gusanos todavía están flotando después de la centrifugación, establecer el nivel de freno de la centrífuga para valorar = 1. - tampón M9 aspirado. Añadir solución de blanqueo a los gusanos. Per 0,5 ml de gusanos, añadir 6,5 ml de DW, 2 ml de hipoclorito, 1 ml de 5 M KOH.
- Incubar los gusanos con balanceo a temperatura ambiente durante 3 min a 50 rpm. gusanos vórtice durante 15 segundos para cizalla mecánicamente los gusanos y exponen los huevos.
- Observe el tubo bajo un microscopio de disección durante el blanqueo. Asegúrese de que los gusanos se cortan por la mitad y los óvulos son liberados. Cuando la mayor parte del cuerpo de un adulto se disuelve, añadir M9 buffer para compensar el volumen a 15 ml.
- Centrifugar a 300 g durante 3 min. Aspirar la mayor parte de la M9 y M9 añadir tampón fresca para compensar el volumen a 15 ml. Repita el paso de lavado 3 veces.
Nota:Evitar el uso de una cantidad excesiva de gusanos, en que obstaculizan el proceso de blanqueo. Mantenga el tiempo de reacción total de menos de 8 minutos hasta que el lavado. Más de blanqueado por los huevos producen fuertes autofluorescencia. - Añadir PBS con polisorbato-20 (PBST) hasta 200 ly 200 l de paraformaldehído al 4% (PFA) para hacer que el 2% PFA.
Precaución: Desde PFA es cancerígeno, llevar ropa protectora, guantes y protección para los ojos antes de usar PFA. - Añadir 40 l de los huevos en 2% PFA en el pozo de la corredera revestido de polilisina.
- Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda y se incuba durante 15 min a TA. Cierre la cámara húmeda justo después de las diapositivas se colocan en el interior.
Nota: Los huevos se depositan en la parte inferior de la corredera mientras que se fija.
- Preparación gónadas disecados para FISH
- gusanos adultos cosecha cultivadas en 50 mm placa de NGM con la pipeta 1 ml de tampón M9. gusanos antes de la cosecha alimentaria bacteriana se agota.
- Lavar los gusanos de cualquier bacteria ingenioh tampón M9, 2 veces.
Nota: las bacterias residuales pueden interferir con las gónadas disecados se pegue a portaobjetos recubiertos con polilisina. - Se precipitan los gusanos por centrifugación a 300 x g. Retire M9 y transferir los gusanos a la placa de NGM vacío por micropipeta.
- Añadir 30 l de tampón M9 que contiene levamisol 2 mM en un pozo de polilisina tratado de diapositivas.
- Añadir 500 l de tampón M9 a un tubo de 1 ml. Utilice este tampón para transferir los gusanos mediante una pipeta boca.
- Llene la punta de la pipeta boca con tampón M9 mediante la colocación de un capilar en el tubo de 1 ml que contiene el tampón M9.
- Bajo el microscopio de disección, coloque la punta de la pipeta de boca justo delante de la cabeza del gusano adulto y arrastre boca pipeta de manera que la cabeza de gusanos entra en la pipeta de boca. Una vez que el jefe de gusanos entra en la punta, todo el cuerpo del gusano se introduce en la punta.
- La transferencia de los gusanos a la diapositiva revestido de polilisina con una pipeta boca.
- El uso de una maquinilla de afeitar, cortar def la cabeza o en la punta de la cola de los gusanos de la diapositiva. Cuando se corta el gusano, las gónadas se saltará. Las gónadas se adhieren a las diapositivas.
- Preparar al menos 30 gusanos en un pozo. Más pozos pueden ser utilizados por otros 30 gusanos.
- Ponga el portaobjetos en la cámara húmeda y aspirar fuera el buffer M9 con pipeta de boca.
- Fijar la muestra mediante la adición de 20 l de 2% PFA a TA durante 15 min en la cámara húmeda.
4. Fijación y permeabilización
- Coloque un bloque de aluminio en hielo seco y almacenarla en un congelador (-80 ° C). metanol y acetona en la tienda -20 ° C.
- Después de PFA etapa de fijación 3.1.15 o 3.2.11, eliminar el uso de fijador micropipeta dejando ~ 5 l de la fijador.
- Dicho de otro portaobjetos recubiertos con polilisina en la diapositiva muestra. Retire el fijador con toalla de papel si la solución es excesiva. No mover las diapositivas una vez que están adheridos entre sí.
- Congelar las diapositivasen el bloque de aluminio durante al menos 15 min.
Nota: Las muestras se pueden almacenar durante al menos 2 - 3 días. - Mientras que las diapositivas se están congelados, poner los frascos que contienen metanol y acetona fría en hielo.
- Tome las diapositivas y los tuercen para congelar-romper la muestra. Desechar la corredera superior. Inmediatamente empapar la diapositiva en el helado de metanol durante 5 min.
- La transferencia de los toboganes de hielo-acetona fría durante 5 minutos.
- Lavar los portaobjetos 3 veces con PBST durante 5 minutos para eliminar el fijador residual. Continuar con la siguiente etapa o almacenar los portaobjetos en etanol al 100% a 4 ° C.
Nota: Las muestras se pueden almacenar durante al menos 2 - 3 días.
5. La hibridación de células fijadas
- Añadir 20 l de solución de RNasa (PBST que contenía 10 mg / ml de RNasa A). Incubar el portaobjetos en la cámara húmeda a 37 ° C durante 1 hora.
- Lavar el portaobjetos dos veces en solución salina 2x y citrato de sodio con polisorbato-20 (2x SSCT) durante 15 min cada uno.
- Añadir 20l de solución de hibridación y se puso la cámara húmeda en la incubadora a 37ºC. Después de 1 hora, se retira la solución de hibridación mediante pipeteo.
- Antes de retirar la solución de hibridación, preparar la sonda. Si la sonda es de doble hebra de ADN, desnaturalizar las sondas por calentamiento a 95 ° C durante 5 minutos en un bloque seco. Después de calentar, enfriar la sonda en hielo brevemente.
- Añadir 10 l de solución de hibridación que contiene las sondas a la muestra. Por sonda de PNA, la concentración de uso en una proporción de 1: 2000 y para la sonda DIG-etiquetados, concentración de uso en una proporción de 1: 200. Cubrir la muestra con cubierta de vidrio.
- Coloque una toalla de papel empapada con agua en el bloque de calor (80 ° C). Ponga una tapa de la caja de plástico del bloque de calor para conservar la humedad y la temperatura.
- Después de que la temperatura del bloque de calor se ha estabilizado (a 80 ° C), colocar la placa de la muestra en la toalla de papel climatizada y cubrir las muestras con la tapa de la caja de plástico. Desnaturalizar la muestra durante 3 min.
- CªUbaté los portaobjetos en una cámara húmeda durante la noche a 37 ° C.
6. Se lava y de inmunofluorescencia
- Calentar la solución de lavado de hibridación (2x SSC, formamida al 50%) a 37 ° C.
- Lavar la muestra en el PBST dos veces a temperatura ambiente durante 5 min. Retire la cubierta de vidrio.
- Lavar la muestra con solución de lavado de hibridación a 37 ° C durante 30 minutos.
- Lavar el portaobjetos de la muestra en PBST 3 veces a temperatura ambiente. Nota: Realizar todos los pasos subsiguientes en cámara húmeda a temperatura ambiente.
- Añadir 20 l de solución de bloqueo y se incuba durante 1 hora a RT en la cámara húmeda.
- Retire la solución de bloqueo y añadir solución de anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con FITC (1: 200) durante 3 horas a RT o durante la noche a 4 ° C.
7. Montaje y Observación
- Lavar la diapositiva muestra con PBST 2 veces durante 15 minutos cada uno.
- Añadir 10 l de solución de montaje con DAPI. Ponga la cubierta de vidrio y presione suavemente. Retire cualquier exceso de solucióncon una toalla de papel.
- Para evitar la evaporación de la solución de montaje, sellar los bordes de la cubierta de vidrio con esmalte de uñas.
- Observar al microscopio confocal. Excluir los embriones con alto fondo. Centrarse en un campo con 4 - 20 núcleos.
- Toma de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante con la lente del objetivo de 100X.
Nota: Excite muestra con 405 nm láser para DAPI, con 555 nm láser para Cy3, con 488 nm láser para FITC.
8. Cuantificación de los telómeros de la señal
Nota: La cuantificación se realiza como se ha descrito previamente 16. Todas las imágenes que se van a comparar deben tomarse con mismo ajuste incluyendo el tiempo de exposición y la fuente de luz.
- Exportar la imagen en formato TIF.
- Descargar e instalar el software de análisis de imágenes.
- Ejecutar el software de análisis de imagen y haga clic en el botón de acuerdo.
- Haga clic en el botón de apertura. Abrir las imágenes con los pescados de los telómeros haciendo doble clic en el archivo de imagen.
- Hacer clic[Editar] - [seleccionar región de procesamiento], seleccione región de interés por clic izquierdo y arrastrando. Excluir toda la tinción no específica.
- Haga clic en [medida] - [Espacio en densidades ópticas], seleccione el canal con señal de los telómeros y escriba el nombre del archivo para guardar los resultados en el archivo .txt.
Nota: La columna de los resultados se encuentran en el siguiente orden: La fluorescencia de la mancha, la intensidad de fondo de la mancha y el área de la mancha. - Copiar los valores y restar la intensidad de fondo de la mancha de la fluorescencia de la mancha. Los valores ahora pueden ser analizados estadísticamente.
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Representative Results
Se informó anteriormente que la sobreviviente ALT puede surgir de la telomerasa mutante deficiente, TRT-1 (ok410), en baja frecuencia mediante la replicación internamente localizada 'Plantilla de ALT' (TALT) secuencias para el mantenimiento de los telómeros 2. El uso de sonda de APN, hemos sido capaces de visualizar los telómeros en las gónadas disecados (Figura 2A). La señal débil de los telómeros se detectó tanto en TRT-1 (ok410) y sobreviviente ALT. La señal difusa se solapó solamente con DAPI, lo que sugiere que pueden no ser autofluorescencia. Intersticial repetición del telómero-como (ITR) se observó consistentemente en el ensayo TRF en el estudio de C. elegans telómero 4,10. Teniendo en cuenta una alta especificidad de la sonda PNA, es probable que sea el ITR dispersa por todo el genoma.
El número de manchas de los telómeros fue de aproximadamente 9 por núcleo pachytene en trt-1 (ok410).En el estudio anterior, 12 focos se observó por POT-1 :: proteína mCherry, que se une al ADN de una sola hebra del telómero 10. Se observó máximo de 24 focos por núcleo en los embriones de tipo salvaje 17. El resultado sugiere que el método reportero mCherry es mejor para el experimento en el que se debe contar el número de los telómeros. Sin embargo PNA FISH es capaz de detectar el ADN de doble cadena de los telómeros, así como DNA de cadena sencilla de los telómeros en proporción con la longitud de los telómeros. Por el contrario, el número de puntos de los telómeros fue de aproximadamente 7 en superviviente ALT, que han fusionado cromosomas (N = 3) 2. Este resultado es coherente con la predicción de que los puntos de los telómeros serían 6 en superviviente ALT. Llegamos a la conclusión de que la intensidad de la señal de la ALT sobreviviente fue suficiente para ser observado.
señal de los telómeros se colocalized con TALT1 en el sobreviviente ALT, lo que sugiere que TALT1 se utilizó como molde para la copia de los telómeros en ausencia de telode la polimerasa (Figura 3). Señal de los telómeros de los sobrevivientes de ALT aumentó en comparación con la de 1-trt mutante parental (ok410), lo que indica que los telómeros se mantiene sólidamente en los supervivientes de ALT y sin telomerasa (Figura 4). La señal de la sonda de PNA fue mayor que la de la sonda marcada con digoxigenina (Figura 4). El diseño de sondas con oligómeros de PNA podrían resultar en señal más fuerte que digoxigenina-etiquetado.
Figura 1:. Visión general de FISH Experimento Los huevos son cosechados por el blanqueamiento de los gusanos adultos y se fija en el 2% PFA en un portaobjetos recubiertos con polilisina. Las muestras se congele-agrietados y se permeabilizaron con metanol y acetona para la penetración de la sonda. Las sondas se añaden a la muestra y se hibridaron durante la noche a 37 ° C. sonda marcada con digoxigenina se detectó por inmunofluorescencia. Las muestras están estudiando y después quantified hacia el software de análisis de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Telómeros FISH en las gónadas diseccionado (A) de los telómeros (rojo) fue detectado por Cy3-PNA-(TTAGGC) 3 en la punta distal de las gónadas (punta de flecha). La intensidad de superviviente ALT es mayor que la de trt-1 (ok410). Imagen pila Z se representa con proyección máxima. Los núcleos indicados por la flecha blanca se sopla-para arriba en la esquina superior derecha. Barra de escala, 10 micras. (B) Número de puntos de los telómeros por núcleo en fase pachytene se midió mediante inspección visual. N = 50. Las barras de error, SEM. Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Telómeros y TALT1 FISH en los embriones Una imagen representativa de los telómeros (rojo) y TALT1 FISH (verde). Los telómeros y la sonda se hibridó con TALT1 embriones simultáneamente. ADN se contratinción con DAPI (azul). Barra de escala, 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. La cuantificación de los peces de datos de los telómeros y la intensidad TALT1 partir de la figura 3 se cuantificaron en el software de análisis de imágenes (un regalo del doctor Peter Lansdorp). Cada mancha se cuantificó con ov nivel de umbraler 15 para excluir de fondo no específica. se utilizó la prueba T para evaluar la significación estadística. (* P <0,001). Las barras de error, SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La principal ventaja de nuestro protocolo es la sencillez del procedimiento sin daño perceptible a la morfología de la estructura celular. Varias medidas han sido optimizados para C. FISH elegans en este protocolo. Los pasos críticos para el éxito FISH incluyen el etiquetado de las sondas, la fijación de los embriones y la penetración. método de marcaje con digoxigenina-dUTP proporciona un método fácil de usar etiquetado por PCR o de la mella. Para etiquetar secuencia diana de largo, se prefiere la mella. En este caso, las sondas deben ser digeridos con la enzima de restricción apropiada para facilitar la penetración de las sondas. etiqueta de biotina-dUTP no es recomendable porque sondas marcadas con biotina producen exceso de cantidad de señal de fondo del citoplasma. Aunque reactivo de bloqueo de biotina endógena está disponible comercialmente, no se intentó.
Este protocolo utiliza embriones aislados para aumentar la densidad de las células para la cuantificación eficiente. Núcleos intestinal de C. elegans son de tamaño grande y son poliploides, que contribuyen excesivo número y la intensidad de las manchas de los telómeros en comparación con el resto de los núcleos somáticos. Por esta razón, gusano conjunto no es adecuado para la cuantificación de los telómeros en C. elegans. Por el contrario, los embriones son apropiados para la evaluación de la longitud del telómero, ya que proporcionan células homogéneas sin efecto de poliploidía.
Este protocolo utiliza el 2% PFA fijador que funcionaba bien para FISH de los telómeros. Aunque se informa de glutaraldehído para dar lugar a una señal de fondo más baja y fijación más difícil en el ARN de hibridación in situ, glutaraldehído aumentó significativamente autofluorescencia 18. Este exceso de fondo no fue abolida después del tratamiento de borohidruro de sodio, que reduce grupo aldehído sin reaccionar. Por esta razón, no se usó glutaraldehído. Si la relación señal-ruido es bajo, el tiempo de pre-hibridación se puede extender hasta varias horas para bloquear los sitios de unión no específica. EnAdemás, el tiempo de lavado rigurosas se puede aumentar para disminuir el nivel de fondo.
técnica de tinción de C. elegans puede ser un desafío para el tratamiento adecuado de permeabilización. C. elegans contiene exoesqueleto cuticular gruesa que inhibe la penetración de los anticuerpos y sondas. método de tinción de anticuerpo tradicional implica el tratamiento de la colagenasa, que requiere mucho tiempo y proceso de optimización. El método de penetración enzimática también daña la morfología de los gusanos a cambio de la eficiencia de penetración. Freeze-grieta y tratamiento con metanol-acetona se utilizan para facilitar la penetración de la sonda. Freeze-grieta es simple y rápida en comparación con la quitinasa o yatalase tratamiento 19. No parecían deshidratación o la rehidratación de la serie de metanol para afectar a la calidad del pescado. Estos pasos se han simplificado en este protocolo. Aunque se informó de que se requiere digestión con proteinasa K para el ARN de hibridación in situNo se observó 19, obvia diferencia entre los resultados de los telómeros de FISH con y sin tratamiento con proteinasa K. Además, la congelación de craqueo de embriones proporciona un método fácil de usar para la visualización de muchas células simultáneamente en un único plano focal para el análisis cuantitativo de gran tamaño.
Mediante el uso de la sonda PNA, la señal de los telómeros se incrementó significativamente en comparación con la obtenida con una sonda de ADN. Esto podría ser debido a una mayor afinidad de unión por su diana complementaria y su tamaño más pequeño (3 repetición en comparación con 4 repetición). sonda de PNA marcado con fluorescencia también se une directamente a su objetivo, minimizando los pasos subsiguientes. fuerte afinidad mantenido en los siguientes pasos de inmunofluorescencia hace que el post-fijación innecesario, que puede evitar el ruido de fondo.
Sin embargo, existen algunas limitaciones en esta técnica. Una es que la permeabilización de paso ligeramente daña la morfología a costa de la penetración de la sonda eficiente. El tratamiento de la gónadas y embriones con metanol y acetona distorsionados circularidad de los núcleos en comparación con el control sin tratar. Para los experimentos que requieren la morfología perfectamente conservada, diverso método de permeabilización debe intentarse. Otra es que la señal de los telómeros se cuantifica en unidades arbitrarias. Esto se debe principalmente a las variaciones entre experimentos independientes. ADN ribosomal se puede considerar como un control interno para normalizar cada muestra. Más métodos útiles se pueden encontrar en la referencia 20.
Un protocolo simple pescado telómeros se describe aquí, que requiere un mínimo de pasos. Muchos pasos se reducen para el análisis de grandes cantidades de embriones. Sin embargo, la modificación adicional se puede hacer para la señal más fuerte, como el tratamiento de quitinasa para la penetración, y otros ensayos innovadores. En combinación con el método de cultivo de células, formación de imágenes de super-resolución puede ser posible. Este protocolo puede ayudar a descubrir el nuevo mecanismo de mantenimiento de los telómeros en C. elegans.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
