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Developmental Biology

मानव प्राथमिक ट्रोफोब्लास्ट खिलाफ हाइपोक्सिया मेलाटोनिन के सुरक्षात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति मॉडल / reoxygenation प्रेरित विघटन

Published: July 30, 2016 doi: 10.3791/54228
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1INRS-Institut Armand-Frappier
* These authors contributed equally

Introduction

मानव गर्भावस्था के दौरान, अपरा कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं है, जो स्टेम कोशिकाओं mononucleated कर रहे हैं, तेजी से पैदा और या तो विलस या extravillous कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं में अंतर। Extravillous cytotrophoblasts आक्रमण और गर्भाशय की दीवार की सर्पिल धमनियों फिर से तैयार करना। विलस cytotrophoblasts, दूसरे हाथ पर, पैदा अंतर और फ्यूज multinucleated syncytiotrophoblast (संकोश) 1 के रूप में करने के लिए जारी है। विलस trophoblast homeostasis के रखरखाव के लिए भ्रूण भलाई और स्वस्थ गर्भावस्था के लिए आवश्यक है। वास्तव में, विलस trophoblasts ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की मातृ-भ्रूण विनिमय की अनुमति, और गर्भावस्था के लिए आवश्यक हार्मोन का उत्पादन। इसके अलावा, syncytiotrophoblast मातृ रक्त परिसंचरण के साथ सीधे संपर्क में केवल सेल प्रकार है और एक आवश्यक शारीरिक और प्रतिरक्षा बाधा प्रदान करता है। इसलिए, syncytiotrophoblast होमियोस्टैटिक रखरखाव के लिए apoptosis और प्रतिस्थापन से गुजरना होगा और avo करने के लिएआईडी अपरा 2-5 विकृतियों।

तकनीक 1986 में Kliman एट अल। 6 द्वारा विकसित मानव गर्भनालों से प्राथमिक विलस cytotrophoblasts को अलग-थलग करने के लिए आणविक विलस trophoblast भेदभाव में शामिल तंत्र के अध्ययन की अनुमति से अपरा अनुसंधान के क्षेत्र में एक क्रांति का कारण बना। यह शास्त्रीय तकनीक, trypsin और DNase के साथ अनुक्रमिक एंजाइमी digestions के आधार पर, घनत्व centrifugation मीडिया में अलगाव के बाद (कोलाइडयन सिलिका के कण polyvinylpyrrolidone से लेपित, या Percoll) अब विलस कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं को अलग करने के लिए स्वर्ण मानक के रूप में मान्यता प्राप्त है। तकनीक चुंबकीय immunopurification, एक प्रक्रिया है कि इन कोशिकाओं की सतह पर विशिष्ट एंटीजन का अंतर अभिव्यक्ति के आधार पर गैर-trophoblastic कोशिकाओं से विलस cytotrophoblasts को अलग से अनुकूलित किया जा सकता। हम trophoblastic सेल membran पर अपनी अभिव्यक्ति के अभाव के कारण मानव ल्युकोसैट प्रतिजन एबीसी (एचएलए-एबीसी) चुनाई 7.8।

अपरा एक अंग है कि गर्भावस्था के दौरान ऑक्सीजन के स्तर में नाटकीय बदलाव कर आए। पहली तिमाही में, ऑक्सीजन अनुपात physiologically बहुत कम (2% ओ 2), लेकिन दूसरी और तीसरी तिमाही में ऑक्सीजन के हल्के स्तर (8% 2 हे) के लिए बढ़ जाती है। टुली एट अल। 9 में वर्णित है कि अपरा विल्ली अंदर trophoblast पर्यावरण की इन विट्रो प्रजनन एक चुनौती है और ऑक्सीजन के स्तर में बदलाव के भी phenotypical परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते है। यह इसलिए, normoxia के रूप में ऑक्सीजन तनाव हमल 8,9 की तीसरी तिमाही के दौरान अपरा विल्ली में पाया नकल करने के लिए 8% ऑक्सीजन को अपनाने का सुझाव दिया है। चेन एट अल। 10 बड़े पैमाने पर trophoblast सेल संस्कृति में ऑक्सीजन तनाव से संबंधित कई चर का अध्ययन किया और एक pericellular वातावरण में ऑक्सीजन के स्तर को निर्धारित करने के महत्व का प्रदर्शन किया। विल्ली में ऑक्सीजन के स्तर को बढ़ाने के लिए करते हैंvasculogenesis की वजह से। अपरा विल्ली बढ़ जाती लगातार रक्त प्रवाह और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के स्तर (एक प्रचुर मात्रा में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों) एक महत्वपूर्ण संकेत है कि vasculogenesis 11,12 को नियंत्रित करता है। गर्भावस्था की जटिलताओं में, vasculogenesis की कमी हाइपोक्सिया, और अधिक महत्वपूर्ण बात, ऑक्सीजन की रुक-रुक कर रूपों (बुलाया हाइपोक्सिया / reoxygenation) उत्पन्न करता है। इन शर्तों ऑक्सीडेटिव तनाव में एक असामान्य वृद्धि है, जो अपरा और भ्रूण व्यवहार्यता 13,14 समझौता करने के लिए नेतृत्व। परिवर्तन है कि trophoblast कोशिकाओं हाइपोक्सिया / reoxygenation के प्रकरणों के दौरान vivo में इन विट्रो में से गुजरना मजाक उड़ाया जा सकता है इस प्रकार है: विलस cytotrophoblasts normoxic शर्तों (8% ओ 2) जब तक वे syncytiotrophoblast में अंतर के तहत रखा जाता है। वे तो 4 घंटे के लिए कमी वाली स्थिति (0.5% ओ 2) के अधीन हैं, normoxia (reoxygenation) के एक अतिरिक्त 18 घंटा के द्वारा पीछा किया। इस हाइपोक्सिया / reoxygenation दृष्टिकोण का प्रयोग, पूर्व trophoblastshibit, redox स्थिति और आंतरिक apoptosis 8 के स्तर में वृद्धि के रूप में कुछ नियंत्रण मुक्त गर्भावस्था जटिलताओं में देखा गया है। इसलिए, इस गर्भावस्था अपरा हाइपोक्सिया / reoxygenation से संबंधित जटिलताओं से निपटने के लिए नई निवारक और उपचारात्मक दृष्टिकोण का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयोगी है।

अपरा कोशिकाओं मेलाटोनिन, जो इस तरह के ऑक्सीडेटिव तनाव और अपरा शिथिलता 15 का निराकरण करने की क्षमता के रूप में कई महत्वपूर्ण कार्य किया है उत्पादन। यहाँ, हम आणविक, सेलुलर और कार्यात्मक स्तर 8 बजे अपरा trophoblast कोशिकाओं में मेलाटोनिन की सुरक्षात्मक प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल प्रयोगात्मक दृष्टिकोण और सेल मॉडल प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

गर्भनालों तुरंत सीएचयूएम-सेंट ल्यूक अस्पताल, मॉन्ट्रियल, QC, कनाडा में सीधी गर्भधारण से सहज योनि प्रसव के बाद प्राप्त किया गया, सूचित सहमति के रोगी और नैतिक समितियों (सीएचयूएम-सेंट ल्यूक अस्पताल और INRS-Institut आर्मंड-Frappier के अनुमोदन के साथ, Laval, क्यूसी, कनाडा)।

1. अलगाव और विलस कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं की शुद्धि

  1. समाधान और मीडिया
    1. सप्लीमेंट द्वारा परिवहन मीडिया तैयार Dulbecco के ईगल मध्यम उच्च ग्लूकोज 1% खंड / खंड एंटीबायोटिक के साथ (DMEM-पारा) (10,000 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन जी, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट) और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर संशोधित।
    2. 10% खंड / खंड भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 25 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 1% खंड / खंड एंटीबायोटिक (10,000 इकाइयों / साथ DMEM-पारा सप्लीमेंट द्वारा प्राथमिक संस्कृति मीडिया तैयार एमएल पेनिसिलिन जी, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट) और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म मीडिया के सामनेउपयोग।
    3. नमकीन घोल (0.9% वजन / खंड सोडियम क्लोराइड) के 4 एल तैयार करें।
    4. HBSS (7.4 पीएच) 1x करने के लिए 25 मिमी HEPES जोड़कर हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) संशोधित तैयार करते हैं।
    5. संशोधित HBSS (1.1.4 में तैयार), मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO 4), कैल्शियम क्लोराइड (2 CaCl), ट्रिप्सिन, deoxyribonuclease चतुर्थ (DNase चतुर्थ), और 1% खंड / खंड एंटीबायोटिक के साथ नए सिरे से, पाचन समाधान की चार बोतलें तैयार ( 10,000 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन जी, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट) के रूप में तालिका 1 में दिखाया गया है।
    6. घनत्व centrifugation मीडिया ढाल तैयार
      1. 10% खंड / खंड HBSS 10x साथ घनत्व centrifugation मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा घनत्व centrifugation मीडिया समाधान तैयार है।
      2. घनत्व centrifugation मीडिया समाधान और संशोधित HBSS के साथ 14 परख ट्यूब, 2 टेबल में वर्णित के रूप में तैयार करें।
      3. सख्ती ढाल करने के लिए अपनी सामग्री को जोड़ने से पहले प्रत्येक घनत्व समाधान (कदम 1.1.6.2) मिक्स। धीरेएक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (1 मिलीग्राम / मिनट) के साथ एक 50 मिलीलीटर गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब घनत्व समाधान जोड़ने के लिए, सर्वोच्च एकाग्रता (70%) के साथ शुरुआत की। ट्यूब दीवार के खिलाफ समाधान draining ढाल के प्रत्येक परत के उचित जुदाई बनाए रखने के द्वारा बूंदों से बचें।
        1. एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के अभाव में, पाश्चर pipettes के साथ बहुत धीरे परतें लागू होते हैं।
    7. चल बफर सप्लीमेंट द्वारा अंतिम चल बफर तैयार 2% खंड / खंड एंटीबायोटिक / कवकनाशी के साथ (10,000 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन जी, 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट) (सामग्री की तालिका देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. विलस कोशिकापोषकप्रसू अलगाव
    नोट: उपयोग बाँझ सर्जिकल उपकरण, कांच के बने पदार्थ, pipettes, बोतल, आदि
    1. विलस कोशिकापोषकप्रसू अलगाव के दिन, एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में, और FBS की 70 मिलीलीटर (कदम 1.1.5 से) digestions समाधान गर्म है। नोट: FBS की 50 मिलीलीटर उपयोग digestions और बाधित करने के लिएठंड कदम (1.2.22) जो बर्फ पर रखा जा सकता है एक बार thawed के लिए 20 मिलीलीटर शेष।
    2. प्रसव के बाद, ठंडा परिवहन माध्यम (कदम 1.1.1 से) में प्रयोगशाला को अपरा लाने के रूप में जल्दी संभव हो (कम से कम 1 घंटा) के रूप में।
    3. त्यागें परिवहन मध्यम और तरल कचरे के डिब्बे में अपरा खून। नाल वजन और ठंड नमकीन घोल में विसर्जित कर दिया।
    4. उपाय और निम्न सुविधाओं का विश्लेषण: गर्भनाल लंबाई; गर्भनाल स्थानीयकरण; अपरा लंबाई, चौड़ाई, आकृति (अंडाकार, थाली के आकार का); झिल्ली रंग; अंकुर संरचना विकृतियों। नोट: डाटा परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत कर रहे हैं।
    5. (हड्डी के आसपास एक अतिरिक्त 1 सेमी त्रिज्या चक्र के साथ यानी, इसके आधार पर) अपनी अपरा प्रविष्टि के साथ गर्भनाल को काट। बाद में ऊतकीय विश्लेषण के लिए ऊतकीय ऊतक लगानेवाला समाधान (formalin 10%) की 300 मिलीलीटर में विसर्जित कर दिया।
    6. के 5 एक्स 5 एक्स 5 सेमी क्यूब्स में पूरे नाल कट। अच्छी तरह से धोने (4 बार एक्स ~ 1 मिनट) खारा सोल मेंसंविधान (0.9%) रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए जब तक खारा समाधान स्पष्ट है। तरल rinsing त्यागें।
    7. एक घड़ी गिलास में, रक्त वाहिकाओं और calcifications दूर करने के लिए अपरा झिल्ली और कीमा ऊतकों को हटा दें। संदंश के साथ मजबूती से रक्त वाहिकाओं को पकड़ो और Metzenbaum कैंची की पीठ का उपयोग कर ऊतकों को हटा दें।
      1. एक Büchner कीप में कीमा नाल रखें। खारा बफर के लगभग 100 मिलीलीटर के साथ कुल्ला। कीमा बनाया हुआ ऊतक के 35 ग्राम (उपयोग प्लास्टिक नाव और तराजू) प्राप्त की है - क़ीमा तक 30 बढ़ें। 35 ग्राम की तैयारी - यदि आवश्यक हो, तीन अतिरिक्त 30 से ऊपर प्राप्त करने के लिए नाल के शेष कीमा। इस समय के दौरान, बर्फ पर एक वजन नाव में कीमा बनाया हुआ ऊतक डाल दिया।
        नोट: यह कदम 1 घंटा 45 मिनट का समय लगेगा।
    8. एक trypsinizing कुप्पी के लिए 35 ग्राम कीमा अपरा ऊतक - 30 जोड़ें। स्थानांतरण trypsinizing कुप्पी के लिए तैयार पाचन समाधान 1 (1 टेबल) की 150 मिलीलीटर और मिश्रण अच्छी तरह से।
    9. trypsinizing कुप्पी में रखेंएक नहीं, 50 से अधिक चक्र / मिनट की गति से 30 मिनट के लिए पानी के स्नान मिलाते और मैन्युअल trypsinizing कुप्पी मिश्रण समरूप पाचन के लिए हर 5 मिनट।
    10. पहले पाचन के अंत में, पानी से स्नान trypsinizing कुप्पी हटा दें और इसे (45 डिग्री) 1 मिनट के लिए झुकाव अपरा ऊतक तलछट के लिए। एक 10 मिलीलीटर बाँझ विंदुक के साथ, हटाने और सतह पर तैरनेवाला के लगभग 80 मिलीलीटर त्यागें। ऊतक aspirating से बचें।
    11. स्थानांतरण trypsinizing फ्लास्क पाचन समाधान की 100 मिलीलीटर 2 (1 टेबल); अच्छी तरह मिक्स और कदम 1.2.9 दोहराएँ।
    12. दूसरी पाचन के अंत में, पानी से स्नान trypsinizing फ्लास्क को हटाने और 1 मिनट के लिए यह 45 डिग्री झुकाव। एक 10 मिलीलीटर बाँझ विंदुक के साथ, 80 मिलीलीटर तैरनेवाला निकालें और धीरे से एक सेल झरनी (100 माइक्रोन जाल) के साथ एक अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण। एक बीकर हर बार अपकेंद्रित्र ट्यूब भरा है FBS के 2 मिलीग्राम से युक्त करने के लिए फ़िल्टर सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
    13. के रूप में वर्णित के लिए तीसरे पाचन प्रदर्शन करनादूसरी पाचन (1.2.11 और 1.2.12) 75 एमएल पाचन समाधान 3 का उपयोग समानांतर में, कदम पाचन 2 के लिए 1.2.16.1 के लिए 1.2.15 प्रदर्शन करते हैं।
    14. तीसरे पाचन पाचन समाधान 4 (75 एमएल) का उपयोग कर के रूप में बिल्कुल चौथे पाचन प्रदर्शन करना है, लेकिन सतह पर तैरनेवाला की एक अधिकतम राशि इकट्ठा। कदम पाचन 3 के लिए समानांतर में 1.2.16.1 के लिए 1.2.15 को पूरा करें, और अंत में पाचन 4 के लिए।
    15. (Digestions 2, 3 और 4) सतह पर तैरनेवाला 13.5 मिलीलीटर भागों में, एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्रत्येक भाग विभाज्य। एक 22.8 सेमी लंबे गिलास पाश्चर विंदुक के साथ, बहुत धीरे और धीरे धीरे FBS के 1.5 मिलीलीटर प्रत्येक ट्यूब के नीचे के क्रम में एक अलग परत बनाने के लिए जगह है। FBS और सतह पर तैरनेवाला मिश्रण नहीं है। कमरे के तापमान पर 1250 XG पर 20 मिनट के लिए ब्रेक के बिना ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
      नोट: centrifugation के बाद, 4 परतें दिखाई ट्यूब में, के रूप में चित्रा 1 में दिखाया जाता है trypsin और trophoblast कोशिकाओं की जुदाई अत्यधिक सेलुलर पाचन से बचा जाता है।।
    16. एक वैक्यूम पंप, aspir के साथखाया और सतह पर तैरनेवाला (पाचन समाधान) और FBS परतों, दो परतों के बीच श्वेताभ फिल्म सहित त्यागें। गर्म सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ गोली (trophoblasts और लाल रक्त कोशिका परतों) Resuspend (कदम 1.1.2, कोई FBS और कोई HEPES के साथ)।
      1. सभी ट्यूबों से resuspended कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें 1 ट्यूब में गठबंधन। ट्यूब सभी digestions के अंत तक कमरे के तापमान पर खड़े हो जाओ। नोट: सभी digestions के बाद, सामान्य उपज resuspended कोशिकाओं (पाचन प्रति एक) के 3 ट्यूबों है।
    17. गर्म सेल संस्कृति के माध्यम से 15 मिलीलीटर मात्रा अप करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1250 XG पर अपकेंद्रित्र। एक वैक्यूम पंप के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें। गोली aspirating से बचें।
    18. धीरे गोली गर्म सेल संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ 3 ट्यूब से प्राप्त resuspend। 1 ट्यूब में अपनी सामग्री पूल। 8 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए, गर्म सेल संस्कृति के माध्यम से की मात्रा को पूरा करें।
    19. बहुत धीरे से एक जुदाई ग्रैड पर सेल निलंबन परतपाश्चर विंदुक के साथ ient। कमरे के तापमान पर 507 XG पर 30 मिनट के लिए ब्रेक के बिना अपकेंद्रित्र।
    20. Centrifugation के बाद, वापस प्रकाश व्यवस्था के साथ ढाल में कोशिकाओं के विभिन्न परतों की पहचान। घनत्व centrifugation माध्यम के 50% - परतों trophoblast युक्त और 40 के बीच कोशिकाओं को दूषित लगाएँ। एक वैक्यूम पंप के साथ, ऊपरी परतों (> 50%) को हटा दें।
    21. एक पाश्चर विंदुक के साथ ब्याज की परतों में स्थित कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण। सेल संस्कृति के माध्यम से 50 मिलीलीटर मात्रा अप करें। कमरे के तापमान पर 1250 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    22. बाँझ शर्तों के तहत, तैरनेवाला त्यागें FBS की 20 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या गिनती। बर्फ पर, बाँझ डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 2.22 मिलीलीटर जोड़ने और flipping द्वारा धीरे मिश्रण। क्रायोजेनिक शीशियों में सेल निलंबन के अशेष 1.5 मिलीलीटर, -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फ्रीज और एक तरल नाइट्रोजन टैंक को हस्तांतरण।
    3. <li> ट्रोफोब्लास्ट शुद्धि
    1. rinsing और चल buffers और निर्माता के निर्देशों के अनुसार चुंबकीय शुद्धि उपकरण पर एक नया फिल्टर स्तंभ स्थापित करें। "साफ-सुथरा कार्यक्रम 'नकारात्मक 1, सकारात्मक 1 और 2 बंदरगाहों सकारात्मक साफ है, और फिर निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक बंदरगाह के तहत 50 मिलीलीटर ट्यूबों लागू करने के लिए प्रदर्शन करना।
    2. कोशिकाओं है कि एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी कदम 1.2.22 में जमे हुए थे गला लें। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और resuspend ठंडा चल रहा बफर समाधान के 20 मिलीलीटर के साथ धीरे कोशिकाओं। 450 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। ठंडा चल रहा बफर के साथ धोने कदम दोहराएँ। व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। centrifugation दोहराएँ (5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 XG के लिए)। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटा दें। ठंडा चल रहा 1% वॉल / माउस विरोधी एचएलए-एबीसी एंटीबॉडी के खंड युक्त बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, मिक्सीधीरे एनजी हर 5 मिनट।
    4. ठंडा चल रहा बफर के 6 मिलीलीटर जोड़ें। 450 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और इस चरण को दोहराएँ। ठंडा चल रहा 10% वॉल / विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी युग्मित चुंबकीय मोतियों की खंड युक्त बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend। 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, धीरे मिश्रण हर 5 मिनट।
    5. ठंडा चल रहा बफर के 6 मिलीलीटर जोड़ें। 450 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। तैरनेवाला और 5 मिलीलीटर ठंडा चल रहा बफर में resuspend त्यागें।
    6. चुंबकीय शुद्धि उपकरण का उपयोग कर trophoblast कोशिकाओं को अलग। नकारात्मक बंदरगाह पर कोशिकाओं को इकट्ठा और ठंडा चल रहा बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं जटिल एचएलए-एबीसी शामिल नहीं है, और इस तरह के अन्य प्रकार की कोशिकाओं से अलग कर दिया और नकारात्मक 1 बंदरगाह की ओर निर्देशित कर रहे हैं।
    7. 450 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे 20 मिलीलीटर गर्म प्राथमिक संस्कृति के माध्यम में कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं usin गणनागा hemocytometer व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए।
    8. प्लेट निम्न घनत्व में कोशिकाओं: 0.15 x 10 6 कोशिकाओं / में अच्छी तरह से 96 अच्छी तरह प्लेटें, 1.6 x 10 6 कोशिकाओं / में अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह प्लेटें और 4.5 x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से में 6 अच्छी तरह प्लेटें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर प्लेटें सेते हैं।
    9. 16,17 cytometry और / या 18 immunocytochemistry द्वारा प्रवाह से ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं की शुद्धता की पुष्टि करें।
      नोट: immunopurified कोशिकाओं की पवित्रता cytokeratin-7 और vimentin 17-19 के खिलाफ FITC संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग निर्धारित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में अच्छी तरह से Lanoix एट अल में विस्तृत है।, 2008 7।
    10. कम से कम 4 घंटे के बाद, स्वाधीन कोशिकाओं को हटाने और फिर normoxia कक्ष है, जो 8% ओ 2 (चित्रा 2 और धारा 2 देखें) से बना है प्लेटों हस्तांतरण करने के लिए गर्म संस्कृति के माध्यम से कोशिकाओं को दो बार कुल्ला।

2. इन विट्रो inductioNormoxia के एन और hypoxia / Reoxygenation

  1. इनक्यूबेटर चैम्बर ऑपरेशन (सेट अप के लिए चित्रा 2A देखें)।
    1. एक लामिना का प्रवाह हुड में, इनक्यूबेटर चैम्बर सूखापन से बचने के लिए के तल पर बाँझ पानी युक्त एक पेट्री डिश जगह; तो चैम्बर के बेहतर अलमारियों पर पहले से तैयार सेल संस्कृति प्लेटों या बोतल (कदम 1.3.10) जगह है।
    2. हुड के बाहर, गैस नली के लिए चैम्बर (इनलेट बंदरगाह) देते हैं (चित्रा 2A: 5 ए, बी और सी) गैस (8% ओ 2 या 0.5% ओ 2) की ट्यूब तक पहुँचने के लिए (2A चित्रा: 7)। चैम्बर के दोनों इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों खोलें। इस पल में, गैस नियामक (2A चित्रा: 4) बंद रहेगा चाहिए।
    3. ध्यान से गैस नियामक वाल्व खोलने (2A चित्रा: 4)। 25 एल की एक हवा के प्रवाह के साथ 4 मिनट के लिए फ्लश / मिनट पूरी तरह से सदन के अंदर हवा को बदलने के लिए।
    4. चैम्बर निस्तब्धता के बाद, गैस नियामक तो इनलेट और कहां बंदचैम्बर के tlet बंदरगाहों।
    5. हाल चलाना फ्लो मीटर आउटलेट नली (2A चित्रा: 5C) चैम्बर के प्रवेश बंदरगाह से और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में चैम्बर जगह है।
    6. कदम 2.1.3 के बाद गैस 1 घंटा साथ चैम्बर भरने के द्वारा हवा वर्तमान में प्लेटें, बोतल में वर्तमान और संस्कृति के माध्यम में भंग बदलें।
    7. दोहराएँ कदम 2.1.1 अन्य गैस रचनाओं के लिए 2.1.6 के लिए (जैसे, 2% पहली तिमाही trophoblast संस्कृति 9 के लिए ओ 2)।
  2. ऑक्सीजन प्रतिशत की पुष्टि (चित्रा 2 बी-सी)
    1. कक्ष के अंदर सेल संस्कृति माध्यम में ऑक्सीजन की एकाग्रता (कोशिकाओं के बिना) की पुष्टि करने के लिए, एक ऑक्सीजन ऑक्सीजन एडाप्टर से जुड़े इलेक्ट्रोड का उपयोग करें। एक वाल्टमीटर के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड कनेक्ट।
    2. एक ही समाधान में एक अंशांकन वक्र बनाने (यानी, सेल संस्कृति के माध्यम से) ज्ञात ऑक्सीजन सामग्री के साथ (गैसों का हल उजागर करके जैसे, 0% और21% ऑक्सीजन)। बाद रीडिंग प्रत्येक एकाग्रता के लिए स्थिर हो जाता है, चैम्बर में मध्यम में इलेक्ट्रोड परिचय।
      नोट: आदेश में ऑक्सीजन एकाग्रता 10 में किसी भी पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक ही गहराई में सभी माप ले लो।
  3. normoxia और trophoblasts में हाइपोक्सिया / reoxygenation की प्रेरण।
    1. उचित सेल संस्कृति बोतल, प्लेट या पेट्री डिश के लिए प्राथमिक trophoblast कोशिकाओं को जोड़ने के बाद, के रूप में आवश्यक उपचार करते हैं।
    2. समानांतर में, कक्ष के अंदर, एक विशिष्ट हालत हर 24 घंटा (चित्रा 3) को पुन: पेश करने के लिए वांछित गैस मिश्रण करने के लिए कोशिकाओं को बेनकाब।

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Representative Results

अलगाव और विलस कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं के immunopurification योनि प्रसव के द्वारा प्राप्त की एक सामान्य अवधि नाल से 1 एक्स 10 8 व्यवहार्य कोशिकाओं झुकेंगे। नाल 350 ग्राम वजन, व्यास में 19 सेमी, थाली के आकार का आकार और पारदर्शी झिल्ली के साथ 4 सेमी लंबा था। कोई गर्भदल कुरूपता का पता चला था। गर्भनाल paracentral स्थानीयकरण और 56 सेमी की लंबाई था। पवित्रता vimentin और cytokeratin-7 मार्कर का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था। कोशिकाओं के 98% से अधिक cytokeratin-7 के लिए vimentin के लिए नकारात्मक और सकारात्मक थे, immunopurification से प्राप्त विलस trophoblasts कोशिकाओं की शुद्धता की पुष्टि। विलस कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं उपस्थिति या 1 मिमी मेलाटोनिन के अभाव में normoxic शर्तों के तहत 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के लिए जोड़ा गया था। विलस cytotrophoblasts के जैव रासायनिक भेदभाव β-मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन के स्तर को निर्धारित करने से नजर रखी थी (β-एचसीजी) के रूप में स्रावपहले से 1,7,20,21 का वर्णन किया। रूपात्मक भेदभाव और apoptosis विरोधी desmoplakin और विरोधी कस्पासे cleaved cytokeratin 18 मध्यवर्ती तंतु 7,22 का उपयोग कर immunofluorescence द्वारा मूल्यांकन किया गया। दिन 4 (मुख्य रूप से syncytiotrophoblasts) के दिन 1 (मुख्य रूप से विलस cytotrophoblasts) से सेल संस्कृति मीडिया, एकत्र किए गए थे और centrifuged β-एचसीजी स्तर supernatants में मापा गया। Β-एचसीजी, जो syncytiotrophoblast के लिए विशेष है, के उत्पादन संस्कृति समय (चित्रा 4) के साथ वृद्धि हुई है। इतना ही नहीं हाइपोक्सिया / reoxygenation, लेकिन hyperoxia (> 20% ओ 2) भी सक्रिय apoptosis 23। इस प्रकार, एक 8% 2 हे एकाग्रता के गोद लेने के लिए ऑक्सीजन की मात्रा जो करने के लिए एक विलस trophoblast सेल गर्भावस्था 10 की तीसरी तिमाही के दौरान उजागर किया जाएगा के प्रतिनिधि था। β-एचसीजी स्तर 72 घंटा में मनाया के शिखर विलस cytotrophoblasts की क्षमता इन परिस्थितियों में अंतर करने की पुष्टि की।मेलाटोनिन इन अध्ययन की शर्तों के तहत β-एचसीजी स्राव में परिवर्तन नहीं किया। 96 घंटा पर β-एचसीजी स्तर की कमी होने की संभावना trophoblast कोशिकाओं के apoptosis, जो 5,7,22,24,25 (चित्रा 4) प्राथमिक संस्कृति में लंबी अवधि के बाद बढ़ जाती है की वजह से हुई। DMSO (0.1% / खंड खंड) का चयन किया गया है क्योंकि यह β-एचसीजी स्तर 26,27 प्रभावित नहीं किया। मेलाटोनिन की सुरक्षात्मक भूमिका दृढ़ता से अपने एंटीऑक्सीडेंट गुण से संबंधित था। विलस trophoblast कोशिकाओं में संस्कृति प्रेरित oxidative तनाव के 72h के बाद हाइपोक्सिया / reoxygenation। मेलाटोनिन के सुरक्षात्मक प्रभाव रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) पता लगाने अभिकर्मक (चित्रा 5 ए) के साथ मूल्यांकन किया गया था। संस्कृति के 96 घंटे के बाद, trophoblast कोशिकाओं 5 के 10 माइक्रोन (और -6) -carboxy -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA) आरओएस की कुल राशि का उत्पादन 8 का पता लगाने के साथ 45 मिनट के लिए incubated रहे थे। विलस trophoblast कोशिकाओं है कि कराना पड़ा हाइपोक्सिया / reoxygenation थाकाफी आरओएस के स्तर (54%) normoxia के तहत उन लोगों की तुलना में वृद्धि हुई है। यह वृद्धि 1 मिमी मेलाटोनिन के साथ इलाज से उलट था। इसके अलावा, normoxia मेलाटोनिन के तहत आरओएस के स्तर (homeostasis) है, जो गैर इलाज विलस trophoblast कोशिकाओं (चित्रा 5 ए) के समान था मिलाना नहीं किया। चित्रा 4 और 5 ए चलता है कि normoxia के तहत मेलाटोनिन ऑक्सीडेटिव तनाव या β-एचसीजी स्राव के स्तर को बदल नहीं किया trophoblast कोशिकाओं में है, जो सामान्य परिस्थितियों 28,29 के तहत सेल homeostasis का कोई मॉडुलन दिखा पिछले अध्ययनों की पुष्टि होती है।

आकृति 1
चित्रा 1:। पाचन ट्यूब centrifugation के बाद, 4 परतों का गठन कर रहे हैं। ऊपरी परत पाचन समाधान से बना है; बस के नीचे, भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)। दोनों परतों के एक वैक्यूम पंप के साथ खारिज किया जाना चाहिए। निचली परतों की गिरफ्तारीई के रूप में अनुसरण रचना: एक सफेद परत fibroblasts, ल्यूकोसाइट्स, मैक्रोफेज, और trophoblasts युक्त; और एक नीचे की परत लाल रक्त कोशिकाओं की रचना की। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
। चित्रा 2: हाइपोक्सिया चैंबर और भंग ऑक्सीजन एकाग्रता का मापन / गणना के घटकों (ए) हाइपोक्सिया कक्ष और गैस सिलेंडर विधानसभा: (1) गैस सिलेंडर; (2) गैस नियामक; (3) गैस नली बंद; (4) सिलेंडर गैस नली; (5) प्रवेश फिल्टर; (6) इनलेट नली; (7) मीटर प्रवाह; (8) आउटलेट नली; (9) मॉड्यूलर इनक्यूबेटर चैंबर। (बी) के एक मानक वक्र ज्ञात ऑक्सीजन सांद्रता के साथ उत्पादन का उपयोग करते हुए सेल संस्कृति माध्यम में वास्तविक ऑक्सीजन एकाग्रता की गणना। (सी और डी)समाधान "0% ओ 2" और "21% ओ 2" में प्राप्त रिश्तेदार मूल्यों, एक रेखीय समारोह सेल संस्कृति माध्यम में ऑक्सीजन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए? "% 2 हे" के रूप में रेखांकन प्लॉट किए जाते हैं। देखने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा 3:। मॉड्यूलर ऊष्मायन कक्ष normoxia में सेल संस्कृति के जेनेरिक प्रायोगिक डिजाइन (8% 2 हे, 5% सीओ 2, 87% एन 2) और हाइपोक्सिया / reoxygenation (एच / आर) (0.5% 2 हे, 5% सीओ 2; 94.5% एन 2) विलस कोशिकापोषकप्रसू (vCTB) और syncytiotrophoblast (एसटीबी) की कोशिकाओं में रोग की स्थिति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल शर्तों रहे हैं। हर 24 घंटा, के साथ या बिना मेलाटोनिन मध्यम (1 मिमी) बदल जाता हैऔर गैस मिश्रण नए सिरे से है। के तहत एच / आर, एसटीबी कोशिकाओं 4 घंटे के लिए हाइपोक्सिया (0.5% 2 हे) से गुजरना और फिर normoxia (8% 2 हे) के लिए वापसी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। विलस ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव के दौरान पर बीटा मानव chorionic gonadotropin (β-एचसीजी) स्राव मेलाटोनिन का प्रभाव विलस कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं को अलग और मानव स्वस्थ अवधि गर्भनालों से शुद्ध किया गया। (5% सीओ 2, 87% एन 2 से 8% 2 हे): (वाहन नियंत्रण DMSO 0.1%) normoxic शर्तों के तहत कोशिकाओं 1 मिमी मेलाटोनिन या डाइमिथाइल sulfoxide के साथ 96 घंटे के लिए इलाज किया गया। संस्कृति के माध्यम में β-एचसीजी स्तर के बाद 24, 48, 72 और 96 मानव संसाधन ओ एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा मापा गयाच प्राथमिक संस्कृति। स्तर में अच्छी तरह से इसी प्रत्येक से पूरे सेल lysate के प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकृत कर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। Syncytiotrophoblast में मेलाटोनिन हाइपोक्सिया / Reoxygenation (ए) मेलाटोनिन (एम; 1 मिमी) के प्रभाव को उजागर की एंटी ऑक्सीडेंट प्रभाव intracellular प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों पर (आरओएस) normoxia के तहत syncytiotrophoblast कोशिकाओं में स्तर (एन) या हाइपोक्सिया / reoxygenation (मानव संसाधन), संस्कृति के 72 घंटे के बाद प्रेरित किया, 5 (और -6) द्वारा मूल्यांकन किया गया था -carboxy -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA) प्रतिदीप्ति। परिणाम ± 3 अलग गर्भनालों के एसडी मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं; *** पी <0.001 (Lanoix, एट अल। 8)। (बी) सेलुलर हाइपोक्सिया / reoxygenation प्रेरित apoptosis के खिलाफ मेलाटोनिन के ख्यात संरक्षण में शामिल रास्ते। प्राथमिक विलस कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं normoxia के तहत 72 घंटा (8% ओ 2) syncytiotrophoblast में भेदभाव की अनुमति देने के लिए सुसंस्कृत थे। प्रकोष्ठों मेलाटोनिन या वाहन पर नियंत्रण के 1 मिमी से अवगत कराया गया और उसके बाद 4 घंटा एक 18 घंटा reoxygenation अवधि (8% 2 हे) द्वारा पीछा के लिए हाइपोक्सिया (0.5% ओ 2) के अधीन है। हाइपोक्सिया / reoxygenation प्रेरित oxidative तनाव जैसे परमाणु कारक रूई बी (एनएफ-κB) और hypoxia inducible कारक 1 (HIF-1) के रूप में redox संवेदनशील प्रतिलेखन कारक सक्रिय हो जाता है। एनएफ-κB लाती P53, जो दरार और caspases 9 और 3 कस्पासे 3 के सक्रियण शामिल mitochondrial apoptosis के Bax / बीसीएल -2 मार्ग से चलाता है रो-जुड़े सक्रिय करता है, कुंडलित तार युक्त प्रोटीन काइनेज 1 (रॉक 1), पाली की दरार (ADP-ribose) पोलीमर्स (PARP) और डीएनए की मरम्मत की परेशानी होती है। मेलाटोनिन रोकेंएक शक्तिशाली एंटीऑक्सीडेंट ऑक्सीडेटिव हाइपोक्सिया / reoxygenation की वजह से तनाव को कम करने के रूप में अभिनय से mitochondrial apoptosis के शामिल है। यह आंकड़ा Lanoix एट अल से संशोधित किया गया है।, 2013 8। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पाचन 1 पाचन 2 पाचन 3 पाचन 4
संशोधित HBSS (एमएल) 150 100 75 75
DNase (μl) 300 200 150 150
(0.1 मिलीग्राम /μl)
MgSO 4 (μl) 150 100 75 75
(800 मिमी)
2 CaCl (μl) 150 100 75 75
(100 मिमी)
Trypsin (यू) 1824000 1,200,000 960,000 960,000
पी / एस (एमएल) 1 0 0 0

तालिका 1: पाचन समाधान पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के लिए सामग्री की मात्रा;। मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO 4); कैल्शियम क्लोराइड (CaCl <उप> 2); deoxyribonuclease चतुर्थ (DNase चतुर्थ)।

सारणी 2
तालिका 2: घनत्व centrifugation मीडिया समाधान के खंड और ढाल समाधान की तैयारी के लिए संशोधित HBSS आवश्यक है।

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Discussion

स्तनधारियों में, भ्रूण के विकास सीधे पर्याप्त अपरा समारोह पर निर्भर है। स्वास्थ्य विकार के विकास के मूल परिकल्पना है कि बाद के जीवन में प्रकट रोगों के कारण प्रारंभिक विकास के लिए और नाल भ्रूण प्रोग्रामिंग 30-32 में एक यंत्रवत भूमिका है कि वापस पता लगाया जा सकता है पर आधारित हैं। नाल भ्रूण के विकास और विकास की कुंजी मध्यस्थ है: यह पोषक तत्व हस्तांतरण को नियंत्रित करता है, हानिकारक जोखिम के खिलाफ की रक्षा करता है, और प्रमुख अंत: स्रावी कार्य किया है। एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक व्यवहार्य प्राथमिक cytotrophoblasts अलग-थलग करने की Kliman एट अल द्वारा विकास। सामान्य और असामान्य अपरा कार्यों 6 के अध्ययन में एक मील का पत्थर है। कई शोधकर्ताओं ने इन विट्रो में विशिष्ट परिस्थितियों पुन: पेश करने अपरा शरीर क्रिया विज्ञान 18,20,33,34 समझने के लिए इस तकनीक को ढाल लिया है। Petroff एट अल द्वारा वर्णित है।, कई कदम पृथक Cyto का एक शुद्ध और मजबूत उपज की गारंटी करने के लिए महत्वपूर्ण हैंtrophoblast कोशिकाओं 18। उदाहरण के लिए, पाचन कदम इस तरह के एक संख्या में वृद्धि हुई है और पाचन, की लंबाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संरचना और पाचन एंजाइमों की मात्रा को 1988, में तकनीक के विकास के बाद से कई संशोधनों आया है, व्यवहार्य पृथक cytotrophoblasts की अधिक से अधिक संख्या में जिसके परिणामस्वरूप 18। सेल लगाव 7,34-36 सुधार microplates लेपित पूर्व cryopreservation, संभावना प्रोटोकॉल बाद में immunomagnetic शुद्धि, जो कोशिकापोषकप्रसू पवित्रता और का उपयोग बढ़ता जारी रखने के लिए के लिए अनुमति देता है जो: यह वर्तमान प्रोटोकॉल तीन मुख्य फायदे हैं। मौजूदा साहित्य कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं के लिए अलगाव तकनीक की विभिन्न संशोधनों के कई उदाहरण हैं, लेकिन घनत्व centrifugation मीडिया की विशेषताओं लगभग असंशोधित 37 रह गया है। अलगाव / immunopurification की प्रस्तुत तकनीक कई महत्वपूर्ण कदम है। इसलिए, यह पवित्रता का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण हैप्रत्येक immunopurification के अंत में विलस कोशिकापोषकप्रसू कोशिकाओं की। इस प्रवाह द्वारा किया जा सकता cytometry मार्कर के रूप में उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग: cytokeratin-7 (trophoblastic मार्कर), भेदभाव 45 (CD45) और vimentin के क्लस्टर (गैर trophoblast कोशिकाओं मार्कर) 18,38,39। अन्य महत्वपूर्ण पहलुओं प्राप्त गर्भनालों की गुणवत्ता, FBS और घनत्व centrifugation मीडिया ढाल, साथ ही centrifugation गति है, जो सभी को प्रभावित कर सकते हैं उपज और कोशिकाओं 20,40 की गुणवत्ता के हैं।

हालांकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, वर्तमान तकनीक अपरिहार्य सीमाएँ हैं। सबसे पहले, immunopurification के बाद प्राप्त व्यवहार्य cytotrophoblasts कोशिकाओं की मात्रा अपेक्षाकृत कम है और संभव स्थिति / उपचार है कि परीक्षण किया जा सकता है की संख्या में मुख्य सीमित कारक है। दूसरे, प्राथमिक trophoblast कोशिकाओं की जीवन अवधि कम है और syncytiotrophoblast में इन विट्रो भेदभाव में बारीकी से सेल viabili की कमी के बाद है Ty और apoptosis की वृद्धि हुई है। जो इन विट्रो में पैदा नहीं करता trophoblast सेल व्यवहार्यता की कम लंबाई, लंबी अवधि के उपचार के मूल्यांकन की सीमा क्योंकि apoptosis अचल संस्कृति 7,41 के बारे में 4 दिनों के बाद शुरू हो रहा है। तीसरा, interplacental परिवर्तनशीलता बड़ी है, इसलिए गर्भनालों की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में सांख्यिकीय रूप से व्याख्या परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। दूसरी ओर, प्राथमिक trophoblast संस्कृति ऐसी कोशिकाओं की क्षमता संकोश में अंतर करने की है, जो भेदभाव के विभिन्न चरणों के अनुसार अलग-अलग सेल phenotypes में स्थिति और उपचार के अध्ययन के लिए अनुमति देता है के रूप में अद्वितीय फायदे हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत ऑक्सीजन विधि अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसके विन्यास में इस तरह के जो normoxia 9,42,43 के लिए एक कम ऑक्सीजन तनाव से अवगत कराया जाना चाहिए पहली तिमाही गर्भावस्था से प्राथमिक trophoblast कोशिकाओं, की संस्कृति के रूप में अन्य स्थितियों, के लिए सिलवाया जा सकता है।

ntent "> इन विट्रो में मानव अपरा समारोह का अध्ययन करने के लिए अन्य दृष्टिकोण हैं। स्नैप ठंड अपरा ऊतकों बहु omics के लिए अनुमति देता है विश्लेषण करती है, लेकिन अपरा एकाधिक नमूने की आवश्यकता है, उदाहरण के चयापचय ऑक्सीजन ढाल के कारण जो सेंट्रल से कम हो जाती है विविधताओं, के लिए से बचने के लिए परिधि से 44 विल्ली। हालांकि, लाइव trophoblast कोशिका जीव विज्ञान और व्यवहार के इस दृष्टिकोण 45 का उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता। विलस explants घटक प्रकार की कोशिकाओं और उनके संचार के साथ पूरे विलस संरचना को बनाए रखने का फायदा है, लेकिन उपचार के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए विशिष्ट नहीं हैं ऐसे BeWo, Jeg -3 और जार के रूप में ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं 23। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध trophoblast-तरह गर्भाशयकर्कट सेल लाइनों, इस तरह के संलयन, भेदभाव, और transplacental परिवहन के रूप में अपरा कार्य, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, हाल के अध्ययन बताते हैं कि प्राथमिक में जीन की अभिव्यक्ति दिखाने cytotrophoblasts और BeWo ट्यूमर कोशिकाओं को खराब 46-48 सहसंबद्ध होते हैं। टीहुसैन, प्राथमिक विलस trophoblast सेल संस्कृति, अपनी सीमाओं के बावजूद, सामान्य या असामान्य नाल के vivo पर्यावरण नकल उतार का अनूठा लाभ के पास है।

प्राथमिक संस्कृति और विलस explants में विलस trophoblast सेल का उपयोग अध्ययनों से पता चलता है कि हाइपोक्सिया और हाइपोक्सिया / reoxygenation व्यवस्थित ऑक्सीडेटिव तनाव, सूजन, भोजी और apoptosis 43,49-52 के स्तर में वृद्धि के साथ trophoblast सेल व्यवहार्यता, सहवर्ती कमी। इस हाइपोक्सिया / reoxygenation सेल संस्कृति मॉडल, विशेष रूप से, हमें विलस trophoblast कोशिकाओं में मेलाटोनिन का एंटीऑक्सिडेंट और विरोधी apoptotic प्रभाव को प्रदर्शित करने की अनुमति दी गई है। प्राथमिक विलस trophoblast हाइपोक्सिया / reoxygenation के संपर्क में कोशिकाओं में, मेलाटोनिन निम्नलिखित रोकता है: ऑक्सीडेटिव तनाव की प्रेरण, एंटीऑक्सीडेंट एंजाइम गतिविधियों, redox के प्रति संवेदनशील संकेत दे रास्ते की वृद्धि की गतिविधि, और mitochondrial apoptosis की प्रेरण (चित्रा 5 ब) में कमी आई 8। hypoxia / reoxygenation मॉडल ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित नुकसान और ऐसे प्रीक्लेम्पसिया, जहां अपरा मेलाटोनिन संश्लेषण 53 कम हो जाता है के रूप में गर्भावस्था की जटिलताओं में अपनी संभव सुरक्षात्मक भूमिका में मेलाटोनिन के निवारक भूमिका का पता लगाने के लिए एक अनूठा उपकरण है। मेलाटोनिन लक्ष्यों 54 की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक शक्तिशाली एंटीऑक्सीडेंट है। इसके अलावा, एक इलाज के रूप में मेलाटोनिन की सुरक्षा काफी हद तक स्थापित किया गया है। मेलाटोनिन के साथ लाभकारी परिणाम कई शोधकर्ताओं द्वारा reproduced किया गया है और मेलाटोनिन प्रीक्लेम्पसिया या जन्म के समय वजन 55,56 से जटिल गर्भधारण में एक संभावित निवारक या चिकित्सीय उपचार के रूप में नैदानिक ​​परीक्षण में वर्तमान में है।

निष्कर्ष, अलगाव, शुद्धि और कोशिकाओं कोशिकापोषकप्रसू उच्च गुणवत्ता के प्राथमिक संस्कृति, हाइपोक्सिया की तकनीक के साथ मिलकर में / reoxygenation बेहतर गर्भावस्था ऑक्सीडेटिव से संबंधित जटिलताओं को समझने के लिए होनहार प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की एक विस्तृत श्रृंखला सक्षमतनाव और अपरा स्वास्थ्य में सुधार होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Curved Metzenbaum Scissors Shandon 9212 surgical equipment (cell isolation) (2 units)
Splinter Forceps Fine 41/2 in Fisherbrand 13-812-42 surgical equipment (cell isolation) (2 units)
Scissors 4.5 Str Dissection Fisherbrand 08-940 surgical equipment (cell isolation) (2 units)
Gauze Sponge 10 cm x 10 cm Cardinal Health 361020733
Oblong Glass Baking Dish Pyrex 1105397 Glassware (2.8 L)
Funnel Buchner Coorstek Inc 10-356E Glassware (114 mm diameter)
Watch Glass  pyrex 9985100EMD Glassware
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L histological tissue fixative solution
Trypsinizing Flasks Wheaton 355395 Glassware (1 unit)
Disposable Culture Tubes Kimble 73750-13100 Glassware
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) Fisherbrand K63B1367820C Glassware
250 ml Glass Beakers Fisherbrand KFS14005250 Glassware
Glass Media Bottles With Cap Fisherbrand KFS14395250 Glassware (8 units)
50 ml Corex Tube  Corning 8422-A (1 unit)
15 ml Polystyrene Centrifuge Tube Corning 430791
50 ml Polystyrene Centrifuge Tube Corning 430829
10 ml Serological Pipet Corning 11415038
Cell Strainer 100 μm Nylon Corning 431752
Absorbant Liner Scienceware 1199918
500 ml Bottles Top Filter Corning Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation
2 ml Criogenic Vials Corning 430488
Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty Sigma-Aldrich C1562-1EA
Peristaltic Pump Pharmacia Fine Chemicals P3 model
Shaking Water Bath Fisher Model 127
Vacuum Pump ABM 4EKFS6CX-4
Sodium Chloride Fisherbrand EC231-598-3 Saline solution 0.9%
Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) Sigma-Aldrich H2387 Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) Life Technologies 15630-080 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution
Trypsin Type I Sigma-Aldrich T8003 9,888 U
Deoxyribonuclease Type Iv Roche 10-104-159-001 402,000 U
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901 100 mM
Magnesium Sulfate Baker 2500-01 800 mM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) Life Technologies 10564-045
Penicillin/Streptomycin Sulphate Hyclone SV30010
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Percoll Sigma-Aldrich P1644 Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml
Isopropanol Acros 42383-0010 50 ml
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich 472301
Automacs Magnetic Separator  Miltenyi Biotec Model 003
Automacs Columns  Miltenyi Biotec 130-021-101
Automacs Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221 http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Automacs Rinsing Solution  Miltenyi Biotec 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 Affymetrix eBioscience 14-9983-82 anti-mouse antibody
Anti Mouse Igg Microbeads Miltenyi Biotec 130048401
Multiple Well Plate -  6 Well With Lid Corning 3335 Cell Bind surface
Multiple Well Plate -  24 Well With Lid Corning 3337 Cell Bind surface
Multiple Well Plate -  96 Well With Lid Corning 3300 Cell Bind surface
Modular Incubator Chamber  Billups-Rothenberg MIC-101 A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions
Single Flow Meter Billups-Rothenberg SFM3001
50 mm In-Line Filter Whatman 6721-5010 PTFE, pore: 1.0 µm
Gas Regulator Pro Star PRS301233 A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions
Gas Hose Class Vi Clear 5/16  Parker 100-05070102 3 pieces with ~ 0.5 m
17 mm Adjustable Gas Hose Clamp Tiewraps THCSS-16
Normoxia Gas Cylinder  Praxair NI CDOXR1U-K Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)
Normoxia Gas Cylinder  Praxair NI CDOXR1U-K Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2)
Oxygen Microelectrode Mi-730 Microelectrodes INC 84477
Oxygen Adapter Microelectrodes INC 3572
ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA  Invitrogen C-400
β-hCG ELISA kit  DRG internatinal EIA-4115
Anti-Vimentin purified antibody eBioscience 14-9897 Host: mouse
Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody  Abcam ab119697 Host: mouse
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody Life Technologies A-11029

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 113 मानव नाल हाइपोक्सिया चैम्बर immunopurification मेलाटोनिन normoxia oxidative तनाव घनत्व ढाल प्राथमिक सेल संस्कृति syncytiotrophoblast विलस कोशिकापोषकप्रसू।
मानव प्राथमिक ट्रोफोब्लास्ट खिलाफ हाइपोक्सिया मेलाटोनिन के सुरक्षात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सेल संस्कृति मॉडल / reoxygenation प्रेरित विघटन
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Sagrillo-Fagundes, L., Clabault, H., Laurent, L., Hudon-Thibeault, A. A., Salustiano, E. M. A., Fortier, M., Bienvenue-Pariseault, J., Wong Yen, P., Sanderson, J. T., Vaillancourt, C. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. J. Vis. Exp. (113), e54228, doi:10.3791/54228 (2016).

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