Introduction
طوال فترة الحمل البشري، وخلايا الأرومة الغاذية الخلوية المشيمة، وهي الخلايا الجذعية mononucleated، تتكاثر بسرعة وتفرق في أي خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي أو extravillous. أرومة غاذية خلوية Extravillous تغزو واعادة تشكيلها الشرايين دوامة من جدار الرحم. أرومة غاذية خلوية زغبي، من ناحية أخرى، لا تزال تتكاثر، والتفريق والصمامات لتشكيل الأرومة الغاذية المخلوية متعددة النوى (ومخلى) 1. الحفاظ على التوازن الأرومة الغاذية زغابي أمر ضروري لعافية الجنين والحمل الصحي. في الواقع، أرومة مغذية زغبي تسمح الصرف الأم الجنين من الأكسجين والمواد المغذية، وتنتج الهرمونات الضرورية للحمل. وعلاوة على ذلك، والأرومة الغاذية المخلوية هو الوحيد من نوع الخلية على اتصال مباشر مع الدورة الدموية للأم وتوفر حاجزا البدني والمناعية الأساسية. ولذلك، يجب على الأرومة الغاذية المخلوية الخضوع لموت الخلايا المبرمج واستبدال لصيانة التماثل الساكن وآفومعرف المشيمة الأمراض 2-5.
تسببت هذه التقنية التي وضعتها كليمان وآخرون. 6 في عام 1986 إلى عزل أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية من مشيمة الآدمي ثورة في مجال البحوث المشيمة من خلال السماح للدراسة الآليات الجزيئية المعنية في التفريق الأرومة الغاذية الزغابي. هذه التقنية الكلاسيكية، على أساس الهضم الأنزيمية متتابعة مع التربسين والدناز، تليها العزلة في وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي (جسيمات السيليكا الغروية المغلفة التي كتبها بوفيدون، أو Percoll) ومن المسلم به الآن باعتباره المعيار الذهبي لعزل خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي. هذه التقنية يمكن أن يكون الأمثل من قبل immunopurification المغناطيسي، وهو الإجراء الذي يفصل أرومة غاذية خلوية زغبي من الخلايا غير الأرومة الغاذية على أساس التعبير التفاضلية للمستضدات معينة على أسطح هذه الخلايا. اخترنا الكريات البيض البشرية مستضد ABC (HLA-ABC) بسبب غياب التعبير عنها على MEMBRAN خلية الأرومة الغاذيةه 7،8.
المشيمة هي الجهاز الذي يخضع لتغيرات كبيرة في مستويات الأكسجين أثناء الحمل. في الثلث الأول من الحمل، ونسبة الأوكسجين هو من الناحية الفسيولوجية منخفضة جدا (2٪ O 2) ولكن الزيادات إلى مستويات معتدلة من الأوكسجين (8٪ O 2) في الثلث الثاني والثالث. وصف تيولي وآخرون. 9 أن الاستنساخ في المختبر البيئة الأرومة الغاذية داخل الزغابات المشيمية هو التحدي والاختلافات في مستويات الأوكسجين قد يؤدي حتى إلى تغييرات phenotypical. ولذلك، اقترح اعتماد 8٪ من الأكسجين كما normoxia لتقليد توتر الأوكسجين الموجودة في الزغابات المشيمية خلال الربع الثالث من الحمل 8،9. تشن وآخرون. 10 درس على نطاق واسع العديد من المتغيرات المتعلقة توتر الأوكسجين في زراعة الخلايا الأرومة الغاذية وأوضح أهمية تحديد مستويات الأكسجين في بيئة المحيطة بالخلايا. مستويات الأوكسجين في الزغابات تميل إلى زيادةنظرا لتكون الأوعية. تدفق الدم في الزيادات الزغابات المشيمية باستمرار ومستوى بيروكسيد الهيدروجين (وهي وفيرة أنواع الاكسجين التفاعلية) هو إشارة مهمة التي تسيطر تكون الأوعية 11،12. في مضاعفات الحمل، وعدم تكون الأوعية يولد نقص الأكسجين، والأهم من ذلك، والاختلافات متقطعة من الأوكسجين (وتسمى نقص الأكسجة / عودة التأكسج). هذه الظروف تؤدي إلى زيادة غير طبيعية في الاكسدة، الذي يعرض للخطر المشيمة والجنين 13،14 جدوى. التعديلات التي تخضع لخلايا الأرومة الغاذية في الجسم الحي خلال حلقة من نقص الأكسجة / عودة التأكسج يمكن تحاكي في المختبر على النحو التالي: يتم الاحتفاظ أرومة غاذية خلوية زغبي في ظل ظروف normoxic (8٪ O 2) حتى تتمايز إلى الأرومة الغاذية المخلوية. ثم يتعرضون لظروف نقص الأوكسجين (0.5٪ O 2) لمدة 4 ساعة، تليها 18 ساعة إضافية من normoxia (عودة التأكسج). باستخدام هذا النهج نقص الأكسجة / عودة التأكسج، أرومة مغذية السابقحررت hibit حالة الأكسدة والاختزال وزيادة مستويات الخلايا الجوهرية 8، كما لوحظ في بعض مضاعفات الحمل. وبالتالي، هذا هو مفيد في نموذج المختبر لتقييم نهج وقائية وعلاجية جديدة لمكافحة مضاعفات الحمل يرتبط مع المشيمة نقص الأكسجة / عودة التأكسج.
خلايا المشيمة تنتج الميلاتونين، الذي لديه عدة وظائف مهمة، مثل القدرة على تفادي الإجهاد التأكسدي وضعف المشيمة 15. هنا، نقدم نماذج النهج وخلية تجريبية تستخدم للتدليل على آثار وقائية من الميلاتونين في خلايا الأرومة الغاذية المشيمة على مستوى الجزيئات والخلايا وظيفية 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم الحصول على المشيمة مباشرة بعد الولادة المهبلية التلقائية من حالات الحمل غير معقدة في CHUM سانت لوك مستشفى، مونتريال، QC، كندا، مع موافقة المريض عن علم وموافقة لجان أخلاقية (CHUM سانت لوك مستشفى والنسبة المطبعة دوليا لمعهد أرمان-Frappier، لافال، QC، كندا).
1. عزل وتنقية خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي
- حلول ووسائل الإعلام
- إعداد وسائل الاعلام وسائل النقل من خلال استكمال Dulbecco لتعديل النسر متوسطة عالية الجلوكوز (DMEM-HG) مع 1٪ المجلد / المجلد المضادات الحيوية (10،000 وحدة / مل البنسلين G، 100 ملغ / مل كبريتات الستربتوميسين) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة الأساسي من خلال استكمال DMEM-HG مع 10٪ المجلد / المجلد مصل بقري جنيني (FBS)، 25 مم 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، 1٪ المجلد / المجلد المضادات الحيوية (10،000 وحدة / مل البنسلين G، 100 ملغ / مل كبريتات الستربتوميسين) وتخزينها في 4 درجات مئوية. وسائل الاعلام الحارة إلى 37 درجة مئوية قبلاستعمال.
- إعداد 4 لتر من محلول ملحي (0.9٪ وزن / المجلد كلوريد الصوديوم).
- استعد تعديل هانك المتوازن محلول الملح (HBSS) وذلك بإضافة 25 ملي HEPES ل1x أخرى HBSS (7.4 درجة الحموضة).
- إعداد الطازجة، وأربع زجاجات من الحل الهضم مع HBSS المعدلة (المعد في 1.1.4)، كبريتات المغنيسيوم (MgSO 4)، كلوريد الكالسيوم (CaCl 2)، التربسين، ديوكسي ريبونيوكلياز الرابع (الدناز الرابع)، و 1٪ المجلد / المجلد المضادات الحيوية ( 10،000 وحدة / مل البنسلين G، 100 ملغ / مل كبريتات الستربتوميسين) كما هو مبين في الجدول رقم 1.
- إعداد كثافة وسائل الاعلام الطرد المركزي التدرج
- إعداد الكثافة الطرد المركزي حل وسائل الاعلام من خلال استكمال كثافة وسائل الاعلام الطرد المركزي مع 10٪ المجلد / المجلد HBSS 10X.
- إعداد 14 أنابيب الاختبار مع الحل وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي وتعديل HBSS، كما هو موضح في الجدول رقم (2).
- خلط كل حل الكثافة (الخطوة 1.1.6.2) بقوة قبل أن يضيف محتواه على التدرج. بلطفإضافة حلول الكثافة إلى 50 مل أنبوب زجاجي الطرد المركزي مع مضخة تحوي (1 مل / دقيقة)، بدءا من أعلى تركيز (70٪). تجنب قطرات عن طريق استنزاف الحلول ضد جدار أنبوب للحفاظ على فصل الصحيح لكل طبقة من التدرج.
- في حالة عدم وجود مضخة تحوي، وتطبيق طبقات بلطف شديد مع ماصات باستور.
- إعداد عازلة تشغيل النهائي من خلال استكمال المخزن المؤقت تشغيل (انظر الجدول المواد) مع 2٪ المجلد / المجلد مضاد حيوي / مضاد فطري (10،000 وحدة / مل البنسلين G، 100 ملغ / مل كبريتات الستربتوميسين). تخزينها في 4 درجات مئوية.
- العزلة الأرومة الغاذية الخلوية زغبي
ملاحظة: استخدام الخيوط الجراحية المعقمة المعدات والأواني الزجاجية، والماصات والقوارير، الخ- في يوم من العزلة الأرومة الغاذية الخلوية زغبي، في 37 ° C حمام الماء، تدفئة حلول الهضم (من الخطوة 1.1.5) و 70 مل من FBS. ملاحظة: استخدام 50 مل من FBS لمقاطعة الهضم وتبقى 20 مل للخطوة التجميد (1.2.22) التي يمكن وضعها على الجليد إذابة مرة واحدة.
- بعد الولادة، وجلب المشيمة إلى مختبر في وسط النقل المثلج (من الخطوة 1.1.1) في أسرع وقت ممكن (أقل من 1 ساعة).
- متوسطة نقل نبذ ودم المشيمة في مزبلة السائلة. وزن المشيمة وتزج في محلول ملحي بارد.
- قياس وتحليل الميزات التالية: طول الحبل السري. توطين الحبل السري. طول المشيمة، والعرض، والشكل (بيضاوي، قرصي)؛ لون الغشاء. الأمراض هيكل فلقة. ملاحظة: يتم عرض البيانات في قسم النتائج.
- قطع الحبل السري إلى جانب الإدراج في المشيمة (أي عند قاعدته مع دائرة إضافية نصف قطرها 1 سم حول الحبل). تزج في 300 مل من النسيجي حل تثبيتي الأنسجة (الفورمالين 10٪) للتحليل النسيجي لاحق.
- قطع المشيمة بأكملها إلى مكعبات 5 × 5 × 5 سم. اغسل (4 مرات س ~ 1 دقيقة) في سول المالحةution (0.9٪) لإزالة خلايا الدم حتى محلول ملحي واضح. تجاهل الشطف السائل.
- في الزجاج ووتش، وإزالة الأغشية المشيمة والأنسجة واللحم المفروم لإزالة الأوعية الدموية وتكلسات. عقد الأوعية الدموية بحزم مع ملقط وإزالة الأنسجة باستخدام الجزء الخلفي من مقص Metzenbaum.
- وضع المشيمة المفروم في قمع بوشنر. شطف مع ما يقرب من 100 مل من العازلة المالحة. تواصل تنميق حتى 30 - يتم الحصول على 35 غرام من نسيج مفروم (استخدام البلاستيك وزنها قارب وعلى نطاق و). إذا لزم الأمر، تخطر على ما تبقى من المشيمة للحصول على ما يصل الى ثلاثة إضافية 30 - استعدادات 35 غ. خلال هذا الوقت، وضعت الأنسجة المفروم في قارب وزنها على الجليد.
ملاحظة: هذه الخطوة سوف يستغرق حوالي 45 دقيقة إلى 1 ساعة.
- وضع المشيمة المفروم في قمع بوشنر. شطف مع ما يقرب من 100 مل من العازلة المالحة. تواصل تنميق حتى 30 - يتم الحصول على 35 غرام من نسيج مفروم (استخدام البلاستيك وزنها قارب وعلى نطاق و). إذا لزم الأمر، تخطر على ما تبقى من المشيمة للحصول على ما يصل الى ثلاثة إضافية 30 - استعدادات 35 غ. خلال هذا الوقت، وضعت الأنسجة المفروم في قارب وزنها على الجليد.
- إضافة 30-35 غرام أنسجة المشيمة المفروم إلى قارورة trypsinizing. نقل 150 مل من استعداد الهضم حل 1 (الجدول 1) إلى قارورة trypsinizing وتخلط جيدا.
- ضع قارورة trypsinizing فيوتهز حمام مائي لمدة 30 دقيقة بسرعة لا تزيد عن 50 دورة / دقيقة ويدويا مزيج القارورة trypsinizing كل 5 دقائق لعملية الهضم متجانسة.
- في نهاية عملية الهضم الأول، وإزالة قارورة trypsinizing من الحمام المائي وإمالته (45 درجة) لمدة 1 دقيقة لالرواسب وأنسجة المشيمة. مع 10 مل ماصة معقمة، وإزالة وتجاهل ما يقرب من 80 مل من طاف. تجنب الشفط الأنسجة.
- نقل 100 مل من محلول الهضم 2 (الجدول 1) إلى قارورة trypsinizing. تخلط جيدا وكرر الخطوة 1.2.9.
- في نهاية عملية الهضم الثاني، وإزالة قارورة trypsinizing من الحمام المائي وإمالته 45 درجة لمدة 1 دقيقة. مع 10 مل ماصة معقمة، إزالة 80 مل طاف ونقل بلطف لأنبوب الطرد المركزي مع مصفاة الخلية (100 شبكة ميكرون). نقل طاف تصفيتها إلى دورق يحتوي على 2 مل من FBS في كل مرة أنبوب الطرد المركزي ممتلئ.
- أداء الهضم الثالث كما هو موضح فيالهضم الثاني (1.2.11 و1.2.12) باستخدام 75 مل الهضم حل 3. وفي موازاة ذلك، نفذ الخطوات 1.2.15 ل1.2.16.1 لهضم 2.
- أداء الهضم الرابع تماما كما الهضم الثالث باستخدام حل الهضم 4 (75 مل)، ولكن جمع أكبر قدر ممكن من طاف. تنفيذ الخطوات 1.2.15 ل1.2.16.1 بالتوازي لعملية الهضم 3، وأخيرا لعملية الهضم 4.
- قسامة وطاف (من الهضم 2 و 3 و 4) إلى 13.5 مل أجزاء، كل جزء في واحدة أنبوب الطرد المركزي 15 مل. مع 22.8 سنتيمترا ماصة باستير الزجاج، بلطف شديد ووضع ببطء 1.5 مل من FBS في الجزء السفلي من كل أنبوب من أجل خلق طبقة منفصلة. لا تخلط FBS وطاف. أنابيب الطرد المركزي دون الفرامل لمدة 20 دقيقة في 1250 x ج في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بعد الطرد المركزي، 4 طبقات واضحة في الأنبوب، كما هو مبين في الشكل (1) فصل الخلايا التربسين والأرومة الغاذية يتجنب الهضم الخلوي المفرط. - مع مضخة فراغ، aspirأكل وتجاهل طاف (حل الهضم) وطبقات FBS، بما في ذلك فيلم بيضاء بين طبقتين. resuspend الكرية (وأرومة مغذية وطبقات خلايا الدم الحمراء) مع 1 مل من الحارة خلية ثقافة المتوسط (الخطوة 1.1.2، مع عدم وجود FBS ولا HEPES).
- جمع الخلايا معلق من جميع الأنابيب والجمع بينهما في 1 أنبوب. السماح للأنبوب الوقوف في درجة حرارة الغرفة حتى نهاية كل الهضم. ملاحظة: بعد كل الهضم، والعائد المعتاد هو 3 أنابيب من الخلايا معلق (واحد لكل الهضم).
- تشكل وحدة التخزين إلى 15 مل مع دافئ مستنبت الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 1250 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف مع مضخة فراغ. تجنب الشفط بيليه.
- resuspend بلطف بيليه تم الحصول عليها من 3 أنابيب مع 1 مل من الحارة خلية ثقافة المتوسط. تجميع محتوياتها في 1 أنبوب. للحصول على 8 مل، واستكمال وحدة التخزين مع دافئ مستنبت الخلية.
- جدا طبقة بلطف تعليق الخلية على غراد الانفصالient مع ماصة باستور. أجهزة الطرد المركزي من دون فرامل لمدة 30 دقيقة في 507 x ج في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي، وتحديد طبقات مختلفة من الخلايا في الانحدار مع الإضاءة الخلفية. تحديد الطبقات التي تحتوي على الأرومة الغاذية وتلويث الخلايا بين 40 - 50٪ من متوسط الكثافة الطرد المركزي. مع مضخة فراغ، وإزالة الطبقات العليا (> 50٪).
- جمع الخلايا الموجودة في طبقات الفائدة مع ماصة باستير ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تشكل وحدة التخزين إلى 50 مل مع خلية ثقافة المتوسط. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1250 x ج في درجة حرارة الغرفة.
- تحت ظروف معقمة، تجاهل طاف، resuspend الكرية مع 20 مل من FBS وحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. على الجليد، إضافة 2.22 مل من سلفوكسيد ثنائي ميثيل العقيمة (DMSO) وتخلط بلطف عن طريق التقليب. قسامة 1.5 مل من تعليق خلية في قارورة المبردة، وتجميد بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية، ونقل إلى خزان النتروجين السائل.
<لى> تنقية الأرومة الغاذية - تثبيت الشطف ومخازن تشغيل وعمود فلتر جديد على الصك تنقية المغناطيسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. نفذ برنامج "نظيفة" لتنظيف السلبية 1، إيجابي 1 و 2 الإيجابي الموانئ، ومن ثم إدخال 50 مل أنابيب تحت كل ميناء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ذوبان الجليد الخلايا التي تم تجميدها في الخطوة 1.2.22 بسرعة في 37 ° C حمام الماء. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل وResuspend الخلايا برفق مع 20 مل من البرد حل العازلة على التوالي. أنبوب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج و 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف. كرر الخطوة غسل العازلة مع جارية باردة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات لتحديد جدوى. كرر الطرد المركزي (لمدة 5 دقائق، 450 x ج في 4 درجات مئوية). إزالة بعناية طاف. إضافة 1 مل من العازلة جارية باردة تحتوي على 1٪ المجلد / المجلد الماوس الأجسام المضادة، HLA-ABC. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، للانترنتنانوغرام بلطف كل 5 دقائق.
- إضافة 6 مل من العازلة جارية باردة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وتكرار هذه الخطوة. Resuspend الخلايا في 1 مل من العازلة جارية باردة تحتوي على 10٪ المجلد / المجلد من مكافحة فأر حبات مغناطيسية الثانوية إلى جانب الأجسام المضادة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، والخلط بلطف كل 5 دقائق.
- إضافة 6 مل من العازلة جارية باردة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend في 5 مل العازلة جارية باردة.
- فصل خلايا الأرومة الغاذية باستخدام أداة تنقية المغناطيسي. جمع الخلايا في ميناء سلبي وإضافة 20 مل من العازلة جارية باردة.
ملاحظة: خلايا الأرومة الغاذية لا تحتوي على معقدة HLA-ABC، وبالتالي فصل من أنواع الخلايا الأخرى وتوجيهها نحو 1 منفذ السلبي. - أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 450 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل طاف و resuspend بلطف الخلايا في 20 مل دافئ مستنبت الأولية. عد الخلايا النقيبالجا عدادة الكريات لتحديد جدوى.
- لوحة الخلايا في كثافة التالية: 0.15 × 10 6 خلايا / جيد في لوحات 96-جيدا، 1.6 × 10 6 خلايا / جيد في 24 لوحات جيدة و 4.5 × 10 6 خلايا / جيد في 6 لوحات جيدة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تأكيد نقاء خلايا الأرومة الغاذية التدفق الخلوي 16،17 و / أو مناعية 18.
ملاحظة: تم تحديد نقاء من الخلايا immunopurified باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة FITC مترافق ضد cytokeratin-7 و فيمنتين 17-19. هذا البروتوكول هو مفصل بشكل جيد في Lanoix وآخرون، 2008 7. - بعد لا يقل عن 4 ساعة، وشطف الخلايا مرتين مع مستنبت دافئ لإزالة الخلايا غير مرتبط ومن ثم نقل لوحات لغرفة normoxia، الذي يتكون من 8٪ O 2 (انظر الشكل 2 والباب 2).
2. في المختبر Inductioن من Normoxia ونقص الأكسجة / عودة التأكسج
- تشغيل غرفة الحاضنة (انظر الشكل 2A لمجموعة متابعة).
- في غطاء تدفق الصفحي، وضع طبق بتري تحتوي على الماء المعقم في الجزء السفلي من الغرفة الحاضنة لتجنب جفاف. ثم وضع لوحات أو قوارير (الخطوة 1.3.10) ثقافة خلية أعدت مسبقا على الرفوف العالية للغرفة.
- خارج غطاء محرك السيارة، ونعلق الغرفة (منفذ مدخل) للخرطوم الغاز (الشكل 2A: 5A، ب، ج) للوصول إلى أنبوب الغاز (8٪ O 2 أو 0.5٪ O 2) (الشكل 2A: 7). فتح كل مدخل ومخرج الموانئ من الغرفة. في هذه اللحظة، ومنظم الغاز (الشكل 2A: 4) يجب أن تظل مغلقة.
- بعناية فتح صمام منظم الغاز (الشكل 2A: 4). مطاردة لمدة 4 دقائق مع تدفق الهواء من 25 لتر / دقيقة تماما ليحل محل الهواء داخل الغرفة.
- بعد التنظيف الغرفة، أغلق منظم الغاز ثم مدخل وأووالموانئ tlet من الغرفة.
- افصل خرطوم تدفق متر منفذ (الشكل 2A: 5C) من مدخل الميناء من الغرفة ووضع الغرفة في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية.
- استبدال الهواء موجودة حاليا في لوحات، وقوارير وحلت في مستنبت عن طريق ملء الغرفة مع الغاز 1 ساعة بعد خطوة 2.1.3.
- كرر الخطوات من 2.1.1 إلى 2.1.6 للالتراكيب الغاز الأخرى (على سبيل المثال، 2٪ O 2 لالأشهر الثلاثة الأولى الثقافة الأرومة الغاذية 9).
- تأكيد نسبة الأكسجين (الشكل 2B-C)
- لتأكيد تركيز الأوكسجين في مستنبت خلايا (بدون الخلايا) داخل الغرفة، استخدم إلكترود أكسجين مرتبطة بمحول الأكسجين. ربط القطب الأكسجين إلى الفولتميتر.
- إنشاء منحنى المعايرة في نفس الحل (أي خلية ثقافة المتوسط) من خلال تعريض حل للغازات مع محتويات الأكسجين المعروفة (على سبيل المثال، 0٪ و21٪ أكسجين). بعد أن استقرت قراءات لكل تركيز، وإدخال القطب في المتوسط في الغرفة.
ملاحظة: خذ كل قياس في عمق نفسه من أجل تجنب أي تحيز في تركيز الأكسجين 10.
- تحريض normoxia ونقص الأكسجة / عودة التأكسج في أرومة مغذية.
- بعد إضافة خلايا الأرومة الغاذية الأولية إلى قوارير ثقافة الخلية المناسبة، لوحات أو أطباق بتري، نفذ العلاجات حسب الضرورة.
- في موازاة ذلك، داخل غرفة، وتعريض الخلايا لخليط الغاز المطلوب لإعادة إنتاج حالة معينة كل 24 ساعة (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العزلة وimmunopurification من خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي من المشيمة طبيعية المدى التي حصلت عليها الولادة المهبلية أسفرت 1 × 10 8 خلايا قابلة للحياة. وزن المشيمة 350 غرام، كانت 19 سم وقطرها 4 سم مع شكل القرصية والأغشية الشفافة. تم الكشف عن أي تشوهات فلقة. كان الحبل السري توطين مجاور للمركز ويبلغ طوله 56 سم. تم تقييم نقاء التدفق الخلوي باستخدام فيمنتين وcytokeratin-7 علامات. وكانت أكثر من 98٪ من الخلايا السلبية لفيمنتين وإيجابية لcytokeratin-7، مؤكدا على نقاء خلايا أرومة مغذية زغبي تم الحصول عليها من immunopurification. أضيفت خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي لوحات ثقافة 96-جيدا في ظل ظروف normoxic في وجود أو عدم وجود 1 ملي الميلاتونين. تم رصد التفريق الكيمياء الحيوية من أرومة غاذية خلوية زغبي عن طريق تحديد مستويات-β الإنسان موجهة الغدد التناسلية المشيمية (β-HCG) إفراز كماسبق وصفها 1،7،20،21. تم تقييم التمايز الصرفي وموت الخلايا المبرمج المناعي باستخدام مكافحة desmoplakin وcytokeratin 18 خيط متوسط المشقوق مكافحة كاسباس 7،22. تم جمع وسائل الإعلام ثقافة خلية من يوم 1 (أساسا أرومة غاذية خلوية زغبي) ليوم 4 (أساسا أرومة غاذية مخلوية)، طرد وتم قياس مستويات β-قوات حرس السواحل الهايتية في supernatants. زاد إنتاج β-قوات حرس السواحل الهايتية، وهو حكرا على الأرومة الغاذية المخلوية، مع مرور الوقت ثقافة (الشكل 4). ليس فقط نقص الأكسجة / عودة التأكسج، ولكن فرط التأكسج (> 20٪ O 2) تنشيط أيضا موت الخلايا المبرمج 23. وهكذا، كان اعتماد تركيز 8٪ O 2 ممثل من كمية الأكسجين التي يمكن أن يتعرض خلية الأرومة الغاذية زغبي خلال الربع الثالث من الحمل 10. وأكدت ذروة مستويات β HCG لوحظ في 72 ساعة قدرة أرومة غاذية خلوية زغبي للتمييز في ظل هذه الظروف.لم الميلاتونين لا يغير إفراز-β HCG في ظل هذه الظروف الدراسة. من المحتمل أن يحدث انخفاض مستويات β HCG في 96 ساعة بواسطة موت الخلايا المبرمج للخلايا الأرومة الغاذية، مما يزيد بعد فترات طويلة في الثقافة الابتدائية 5،7،22،24،25 (الشكل 4). وقد تم اختيار DMSO (0.1٪ المجلد / المجلد) لأنها لم تؤثر على مستويات بيتا قوات حرس السواحل الهايتية 26،27. ويرتبط الدور الوقائي للميلاتونين بقوة على الخصائص المضادة للأكسدة لها. نقص الأكسجة / عودة التأكسج بعد 72H الثقافة التوتر الناجم عن الأكسدة في خلايا الأرومة الغاذية زغبي. تم تقييم تأثير وقائي من الميلاتونين مع أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) كشف الكاشف (الشكل 5A). بعد 96 ساعة من الثقافة، وحضنت خلايا الأرومة الغاذية لمدة 45 دقيقة مع 10 ميكرومتر من 5- (و6) -carboxy-2 "، 7'-dichlorodihydrofluorescein ثنائي الأسيتات (كربوكسي-H2DCFDA) للكشف عن المبلغ الإجمالي للROS تنتج 8. خلايا الأرومة الغاذية زغبي أن خضع لنقص الأكسجة / عودة التأكسج كانارتفاع كبير في مستويات ROS (54٪) مقارنة مع أولئك تحت normoxia. وقد انعكس هذا الارتفاع عن طريق العلاج مع 1 ملم الميلاتونين. وعلاوة على ذلك، تحت normoxia الميلاتونين لم تعدل مستويات ROS (التوازن)، والتي كانت مشابهة لخلايا الأرومة الغاذية زغبي غير المعالجة (الشكل 5A). الشكل (4) وتظهر 5A أنه في ظل normoxia لم الميلاتونين لا يغير مستويات الإجهاد التأكسدي أو إفراز-β HCG في خلايا الأرومة الغاذية، والتي تؤكد صحة دراسات سابقة تظهر أي تعديل على التوازن خلية في ظل ظروف طبيعية 28،29.
الشكل 1: الهضم أنبوب بعد الطرد المركزي، تتشكل 4 طبقات. وتتكون الطبقة العليا من حل الهضم. أقل بقليل، ومصل بقري جنيني (FBS). يجب التخلص من كل الطبقات مع مضخة فراغ. الطبقات السفلى عالبريد تتألف على النحو التالي: طبقة البيضاء التي تحتوي على الخلايا الليفية، الكريات البيض، الضامة، وأرومة مغذية. والطبقة السفلية يتألف من خلايا الدم الحمراء. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 2: مكونات الغرفة نقص الأكسجة والقياس / حساب تركيز الأوكسجين الذائب (أ) نقص الأكسجة غرفة والتجمع اسطوانة الغاز: (1) اسطوانة غاز. (2) منظم الغاز. (3) المشبك خرطوم الغاز. (4) خرطوم اسطوانة غاز. (5) مرشح مدخل. (6) خرطوم مدخل. (7) تدفق متر. (8) خرطوم منفذ. (9) وحدات غرفة الحاضنة. (ب) حساب تركيز الأكسجين الفعلي في مستنبت الخلية باستخدام منحنى مستوى إنتاجها مع تركيزات الأكسجين المعروفة. (C و D)يتم رسم القيم النسبية التي تم الحصول عليها في الحلول "0٪ O 2" و "21٪ O 2"، بيانيا كدالة خطية لتحديد تركيز الأوكسجين في مستنبت الخلية "؟٪ O 2". انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): عام التجريبية تصميم خلية الثقافة في وحدات الحضانة غرفة Normoxia (8٪ O 2 و 5٪ CO 2، 87٪ N 2) ونقص الأكسجة / عودة التأكسج (H / R) (0.5٪ O 2 و 5٪ CO (2)؛ 94.5٪ N 2) هي الشروط تستخدم لدراسة الحالات المرضية في الأرومة الغاذية الخلوية الزغابي (vCTB) والأرومة الغاذية المخلوية الخلايا (STB). يتم تغيير كل 24 ساعة والمتوسطة مع أو بدون الميلاتونين (1 ملم)ويتم تجديد خليط الغاز. تحت H / R، خلايا STB تخضع نقص الأكسجة (0.5٪ O 2) لمدة 4 ساعة ثم العودة إلى normoxia (8٪ O 2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم عزل تأثير الميلاتونين على بيتا الإنسان موجهة الغدد التناسلية المشيمية (β-HCG) إفراز خلال زغبي الأرومة الغاذية تمايز خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي وتنقيته من مشيمة الآدمي على المدى صحية: الرقم 4. تم علاج الخلايا لمدة 96 ساعة مع الميلاتونين 1 ملم أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO 0.1٪: السيطرة على السيارة) في ظل الظروف normoxic (8٪ O 2 و 5٪ CO 2، 87٪ N 2). تم قياس مستويات β-قوات حرس السواحل الهايتية في مستنبت بواسطة انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) بعد 24، 48، 72 و 96 ساعة سثقافة الأولية F. وتم تطبيع مستويات لمحتوى البروتين من المحللة خلية كاملة من المقابلة بشكل جيد لكل منهما. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: تأثير مضاد للأكسدة من الميلاتونين في الأرومة الغاذية المخلوية تتعرض لنقص الأكسجة / عودة التأكسج (A) تأثير الميلاتونين (M، 1 ملم) على أنواع الاكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) مستويات في خلايا الأرومة الغاذية المخلوية تحت normoxia (N) أو نقص الأكسجة / عودة التأكسج (HR)، الناجم عن بعد 72 ساعة من الثقافة، والمقررة من قبل 5- (و6)، 7'-dichlorodihydrofluorescein ثنائي الأسيتات (كربوكسي-H2DCFDA) مضان-2 -carboxy. يتم التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SD من 3 مشيمة مختلفة؛ *** P <0.001 (Lanoix، وآخرون. 8). (ب) مسارات الخلوية المشاركة في حماية المفترضة من الميلاتونين ضد نقص الأكسجة / الناجم عن عودة التأكسج موت الخلايا المبرمج. كانت خلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي الأولية مثقف لمدة 72 ساعة تحت normoxia (8٪ O 2) للسماح التمايز في الأرومة الغاذية المخلوية. وتعرض الخلايا ل1 ملم من الميلاتونين أو السيطرة على السيارة وبعد ذلك تعرض لنقص الأكسجة (0.5٪ O 2) لمدة 4 ساعة تليها فترة عودة التأكسج 18 ساعة (8٪ O 2). نقص الأكسجة / عودة التأكسج الناجم عن الاكسدة ينشط الأكسدة الحساسة عوامل النسخ مثل العامل النووي كابا B (NF كيلوبايت) ونقص الأكسجة عامل محرض 1 (مؤسسة الحرمين-1). NF كيلوبايت يدفع البروتين p53، مما يتسبب في مسار باكس / بي سي إل 2 من موت الخلايا المبرمج الميتوكوندريا التي تنطوي على الانقسام وتفعيل caspases 9 و 3. كاسباس 3 ينشط رو المصاحب، ملفوف التي تحتوي على لفائف بروتين كيناز 1 (ROCK-1)، و انشقاق بولي (ADP-الريبوز) البلمرة (PARP) وانخفاض قيمة إصلاح الحمض النووي. الميلاتونين منعق استحثاث موت الخلايا المبرمج الميتوكوندريا التي كتبها بوصفها أحد مضادات الأكسدة القوية للحد من الإجهاد التأكسدي الناجم عن نقص الأكسجة / عودة التأكسج. تم تعديل هذا الرقم من Lanoix وآخرون، 2013 8. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الهضم 1 | الهضم 2 | الهضم 3 | الهضم 4 | |
| تعديل HBSS (مل) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| الدناز (ميكرولتر) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0.1 ملغ /ميكرولتر) | ||||
| MgSO 4 (ميكرولتر) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 ملم) | ||||
| CaCl 2 (ميكرولتر) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 ملم) | ||||
| التربسين (U) | 1824000 | 1،200،000 | 960000 | 960000 |
| P / S (مل) | 1 | 0 | 0 | 0 |
الجدول 1: كميات المكونات لالهضم الحل البنسلين والستربتومايسين (P / S)؛ كبريتات المغنيسيوم (MgSO 4)؛ كلوريد الكالسيوم (CaCl <فرعية> 2)؛ ديوكسي ريبونيوكلياز الرابع (الدناز الرابع).
الجدول 2: وحدات التخزين من الكثافة الحل الطرد المركزي وسائل الإعلام والتعديل HBSS المطلوبة لإعداد حلول متدرجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الثدييات، تعتمد اعتمادا مباشرا على وظيفة المشيمة كافية نمو الجنين. وتستند أصول التنموية من الاضطرابات الصحية على فرضية أن سبب الأمراض يتجلى في وقت لاحق في الحياة يمكن ان ترجع الى التنمية في وقت مبكر وأن المشيمة دورا الآلية في البرمجة الجنينية 30-32. المشيمة هي الوسيط الرئيسي للنمو الجنين وتطوره: أنه ينظم نقل المواد الغذائية، ويحمي من التعرض الضارة، ولها وظائف الغدد الصماء الرئيسية. التطور الذي كليمان وآخرون من تقنية استنساخه لعزل أرومة غاذية خلوية أولية قابلة للحياة هي علامة فارقة في دراسة وظائف المشيمة العادية وغير العادية 6. وقد تكيفت العديد من الباحثين هذه التقنية لإعادة إنتاج شروط محددة في المختبر لفهم المشيمة 18،20،33،34 علم وظائف الأعضاء. كما وصفها بيتروف وآخرون، العديد من الخطوات الهامة لضمان العائد النقي والقوي للخلوي معزولةخلايا الأرومة الغاذية 18. على سبيل المثال، خضعت الخطوات الهضم عدة تعديلات منذ تطوير هذه التقنية في عام 1988، مثل زيادة عدد وطول الهضم، فضلا عن تكوين وكمية من الانزيمات الهضم، مما أدى إلى أعداد أكبر من أرومة غاذية خلوية منعزلة قابلة للحياة 18. هذا البروتوكول الحالي لديه ثلاث مزايا رئيسية هي: الحفظ بالتبريد، والذي يسمح لاحتمال أن يستمر في وقت لاحق تنقية immunomagnetic البروتوكول، مما يزيد من نقاء الأرومة الغاذية الخلوية واستخدام قبل المغلفة microplates تحسين مرفق الخلية 7،34-36. يحتوي على الكتابات الموجودة عدة أمثلة التعديلات المتنوعة لتقنية عزل لخلايا الأرومة الغاذية الخلوية، ولكن خصائص وسائل الإعلام الكثافة الطرد المركزي ظلت معدلة تقريبا 37. تقنية عرض من العزلة / immunopurification لديها العديد من الخطوات الحاسمة. وبالتالي، فمن المهم تقييم نقاءمن الخلايا الأرومة الغاذية الخلوية زغبي في نهاية كل immunopurification. ويمكن أن يتم ذلك عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة المناسبة كعلامات: cytokeratin-7 (علامة الأرومة الغاذية)، مجموعة من التمايز 45 (CD45) وفيمنتين (خلايا غير الأرومة الغاذية علامات) 18،38،39. جوانب هامة أخرى هي نوعية مشيمة التي تم الحصول عليها، وFBS والكثافة الطرد المركزي سائل الإعلام التدرج، وكذلك سرعة الطرد المركزي، والتي يمكن أن تؤثر على كل المحصول ونوعية الخلايا 20،40.
على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع، والتقنية الحالية لديها قيود لا يمكن تجنبها. أولا، كمية من الخلايا أرومة غاذية خلوية قابلة للحياة التي تم الحصول عليها بعد immunopurification منخفضة نسبيا وهو العامل المحدد الرئيسي في عدد من الظروف الممكنة / العلاجات التي يمكن اختبارها. ثانيا، تمتد الحياة من خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية القصير والتمايز في المختبر إلى الأرومة الغاذية المخلوية وتليها تخفيض viabili خلية تاي وزيادة موت الخلايا المبرمج. طول قصيرة من بقاء الخلية الأرومة الغاذية التي لا تتكاثر في المختبر، يحد من تقييم العلاج على المدى الطويل، لأن الخلايا يتم تشغيل بشكل لا رجعة فيه بعد حوالي 4 أيام الثقافة 7،41. ثالثا، وتقلب interplacental كبير، لذلك لا بد من عدد كبير نسبيا من مشيمة للحصول على نتائج التأويل إحصائيا. من ناحية أخرى، ثقافة الأرومة الغاذية الأولية لها مزايا فريدة من نوعها، مثل قدرة الخلايا على التمايز إلى مخلى، والذي يسمح لدراسة الظروف والعلاجات في الظواهر مختلفة من الخلايا وفقا لمراحل مختلفة من التمايز. طريقة الأوكسجين الواردة في هذا البروتوكول هو متكيف جدا وتكوينه يمكن تكييفه لحالات أخرى، مثل ثقافة خلايا الأرومة الغاذية الأساسية من أول الحمل الثلث، والتي ينبغي أن تتعرض لانخفاض توتر الأوكسجين لnormoxia 9،42،43.
ntent "> وهناك أساليب أخرى لدراسة وظيفة المشيمة البشرية في المختبر. الإضافية تجميد أنسجة المشيمة يسمح OMICS متعددة تحليلات، ولكنها تتطلب أخذ عينات متعددة المواقع المشيمة، لتجنب مثل التباينات التمثيل الغذائي بسبب التدرج الأوكسجين، مما يقلل من الحكومة المركزية الزوائد على هامش 44. ومع ذلك، ويعيش بيولوجيا الخلايا الأرومة الغاذية وسلوك لا يمكن دراستها باستخدام هذا النهج 45. إإكسبلنتس زغبي لديها ميزة الحفاظ على هيكل زغابي كله مع أنواع الخلايا المكونة والاتصالات، ولكن الردود على العلاجات ليست محددة ل خلايا الأرومة الغاذية 23. المتاحة تجاريا خطوط الخلايا المشيمة مثل الأرومة الغاذية، مثل BEWO، JEG-3 و JAR يمكن استخدامها لدراسة وظائف المشيمة، مثل الانصهار، والتمايز، والنقل بالمشيمة. ومع ذلك، تبين الدراسات الحديثة أن التعبير الجيني في الانتخابات التمهيدية ترتبط أرومة غاذية خلوية والخلايا السرطانية BEWO سيئة 46-48. تيHUS، زغبي زراعة الخلايا الأرومة الغاذية الأولية، على الرغم من قصوره، تمتلك ميزة فريدة من محاكاة البيئة في الجسم الحي من المشيمة طبيعية أو غير طبيعية.وتشير الدراسات التي تستخدم الخلايا الأرومة الغاذية زغبي في الثقافة الابتدائية وإإكسبلنتس زغبي أن نقص الأكسجين ونقص الأكسجة / عودة التأكسج يقلل بشكل منهجي بقاء الخلية الأرومة الغاذية، بالتزامن مع زيادة مستويات التوتر التأكسدي، والالتهابات، الالتهام الذاتي وموت الخلايا المبرمج 43،49-52. هذا النموذج زراعة الخلايا نقص الأكسجة / عودة التأكسج، على وجه التحديد، وقد سمح لنا لإظهار المضادة للأكسدة والمضادة للأفكارك آثار الميلاتونين في خلايا الأرومة الغاذية زغبي. في خلايا الأرومة الغاذية زغبي الابتدائية تتعرض لنقص الأكسجة / عودة التأكسج، الميلاتونين يمنع ما يلي: تحريض الاكسدة، وانخفاض الأنشطة المضادة للأكسدة الإنزيم، زيادة نشاط مسارات الإشارات حساسة الأكسدة، واستحثاث موت الخلايا المبرمج الميتوكوندريا (الشكل 5B) 8. ومحطانموذج poxia / عودة التأكسج هو أداة فريدة من نوعها للتأكد من دور وقائي من الميلاتونين في الضرر الناجم عن الاكسدة ودورا وقائيا المحتمل في مضاعفات الحمل مثل تسمم الحمل، حيث يتم تخفيض تركيب الميلاتونين المشيمة 53. الميلاتونين هو أحد مضادات الأكسدة القوية مع مجموعة واسعة من الأهداف 54. أيضا، تم إنشاء حد كبير سلامة الميلاتونين كعلاج. وقد استنسخت نتائج مفيدة مع الميلاتونين من قبل العديد من الباحثين والميلاتونين هو حاليا في التجارب السريرية لعلاج الوقائية أو العلاجية المحتملة في حالات الحمل تعقيدا بسبب تسمم الحمل أو نمو الجنين داخل الرحم تقييد 55،56.
وفي الختام، وعزل وتنقية والثقافة الأولية ذات جودة عالية الأرومة الغاذية الخلوية الخلايا، جنبا إلى جنب مع تقنية نقص الأكسجة / عودة التأكسج تمكين مجموعة واسعة من الأساليب التجريبية واعدة لفهم أفضل لمضاعفات الحمل المتعلقة الأكسدةالتوتر وتحسين الصحة المشيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
- Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
