Introduction
במהלך הריון אדם, תאי cytotrophoblast השליה, אשר הם תאי גזע mononucleated, להתרבות במהירות להתמיין לתאי cytotrophoblast או villous או extravillous. cytotrophoblasts Extravillous לפלוש לשפץ העורקים ספירלה של דופן הרחם. Cytotrophoblasts Villous, מצד שני, ממשיכים להתרבות, להבדיל הפתיל כדי ליצור syncytiotrophoblast multinucleated (להלן syncytium) 1. התחזוקה של הומאוסטזיס trophoblast villous חיונית לרווחתה עוברית הריון בריא. למעשה, trophoblasts villous לאפשר חילופי האם והעובר של חמצן וחומרים מזינים, וכן ליצירת הורמונים חיוניים עבור ההריון. יתר על כן, syncytiotrophoblast הוא תא מהסוג רק במגע ישיר עם מחזור הדם האימהי ומספק מחסום פיזי אימונולוגיים חיוני. לכן, syncytiotrophoblast חייב לעבור אפופטוזיס והחלפת לתחזוקה ההומיאוסטטית וכדי AVOid השליה פתולוגיות 2-5.
הטכניקה פותחה על ידי Kliman et al. 6 בשנת 1986 לבודד cytotrophoblasts villous ראשית ממנהל שליות אדם גרמה מהפכה במחקר שליה בכך שהוא מאפשר בחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בידול trophoblast villous. טכניקה קלסית זו, המבוססת על digestions האנזימטית רציף עם טריפסין ו DNase, ואחריו בידוד במדיה צנטריפוגה הצפיפות (חלקיקי סיליקה colloidal מצופים ידי polyvinylpyrrolidone, או Percoll) מוכר כיום את תקן הזהב עבור לבודד תאי cytotrophoblast villous. הטכניקה יכולה להיות מותאמת על ידי מגנטי immunopurification, הליך שמפריד cytotrophoblasts villous מתאי הלא trophoblastic מבוססים על ביטוי ההפרש של אנטיגנים ספציפיים על פני השטח של תאים אלה. בחרנו ABC אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA-ABC) בשל העדר הביטוי שלה על membran תא trophoblasticדואר 7,8.
השליה היא איבר שעובר וריאציות דרמטיות ברמות החמצן במהלך הריון. בטרימסטר הראשון, יחס החמצון הוא פיסיולוגי נמוך מאוד (2% O 2) אך עליות לרמות קלות של חמצון (8% O 2) בטרימסטר השני ושלישי. Tuuli et al. 9 תיאר כי רבייה במבחנה של הסביבה trophoblast בתוך villi השליה היא אתגר לשינויים ברמות חמצון עשוי אפילו להוביל לשינויים phenotypical. זהו, אם כן, הציע לאמץ חמצן 8% כפי normoxia לחקות את המתח חמצן נמצא villi השליה במהלך השליש השלישי של ההריון 8,9. חן et al. 10 בהרחבה למדו מספר משתנים הקשורים במתח חמצן תרבית תאי trophoblast והדגימו את החשיבות של קביעת רמות חמצן בסביבת pericellular. רמות חמצן villi נוטות להגדילבשל vasculogenesis. זרימת הדם בעליות villi שלית זמן ורמת החמצן (זן חמצן תגובתי בשפע) היא איתות חשובה שולט vasculogenesis 11,12. בשנת סיבוכי הריון, חוסר vasculogenesis מייצר היפוקסיה, ויותר מכך, וריאציות לסירוגין של חמצון (שנקרא היפוקסיה / reoxygenation). תנאים אלה להוביל לעלייה חריגה סטרס חמצוני, אשר פוגעת השליה 13,14 הכדאיות עוברית. השינויים שתאים trophoblast לעבור in vivo במהלך אירועי היפוקסיה / reoxygenation ניתן חיקה במבחנה כדלקמן: cytotrophoblasts villous נשמרים בתנאי normoxic (8% O 2) עד שהם להתמיין syncytiotrophoblast. לאחר מכן הם חשופים לתנאי חוסר חמצן (0.5% O 2) עבור 4 שעות, ואחריו hr 18 נוסף של normoxia (reoxygenation). באמצעות גישה זו היפוקסיה / reoxygenation, trophoblasts לשעברhibit deregulated מצב חיזור רמות גבוהות של אפופטוזיס המהותי 8, כמו נצפה סיבוכי הריון מסוימים. לפיכך, מדובר שימושי במודל חוץ גופית על מנת להעריך גישות למנוע ולרפא אותן חדשה למאבק סיבוכי הריון הקשורות השליה היפוקסיה / reoxygenation.
תאי שליה לייצר מלטונין, אשר יש פונקציות חשובות, כגון היכולת לייתר סטרס חמצוני ופגיעה בתפקוד השליה 15. כאן, אנו מציגים מודלי הגישה ותא הניסוי נעשו שימוש כדי להמחיש את ההשפעות המגנות של מלטונין בתאי trophoblast שליה ברמה המולקולרית, תאית ופונקציונלית 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שליות התקבלו מייד לאחר משלוחי נרתיקית ספונטניים של הריונות מסובכים בבית צ'אם-St-Luc החולה, מונטריאול, קוויבק, קנדה, עם הסכמת מטופל מושכלת ואישור ועדה אתית (צ'אם-St-Luc חולי INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, קנדה).
1. בידוד וטיהור של תאי Villous Cytotrophoblast
- פתרונות תקשורת
- הכן התקשורת התחבורה ידי השלמת Modified של Dulbecco-גלוקוז גבוהה-בינונית של הנשר (DMEM-HG) עם 1% אנטיביוטי כרך / כרך (10,000 יחידות / פניצילין מ"ל G, 100 מ"ג / סולפט סטרפטומיצין מ"ל) ולאחסן ב 4 ° C..
- כן תקשורת התרבות העיקרית על ידי השלמת DMEM-HG עם 10% כרך / כרך בסרום שור עובר (FBS), 25 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1% אנטיביוטי כרך / כרך (10,000 יחידות / מ"ל פניצילין G, 100 מ"ג / סולפט סטרפטומיצין מ"ל) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. תקשורת חמה 37 ° C לפנילהשתמש.
- כן 4 ליטר של תמיסת מלח (0.9% נתרן כלורי משקל / כרך).
- כן שונה תמיסת המלח המאוזן של האנק (HBSS) על ידי הוספת 25 HEPES מ"מ ל X 1 HBSS (pH 7.4).
- הכן טרי, ארבעה בקבוקי פתרון העיכול עם שונה HBSS (שהוכנו 1.1.4), מגנזיום סולפט (MgSO 4), סידן כלורי (CaCl 2), טריפסין, IV deoxyribonuclease (IV DNase), ו -1% אנטיביוטי כרך / כרך ( 10,000 יחידות / מ"ל פניצילין G, 100 מ"ג / סולפט סטרפטומיצין מ"ל) כפי שמוצג בטבלה 1.
- הכין שיפוע תקשורת צנטריפוגה צפיפות
- כן פתרון תקשורת צנטריפוגה צפיפות על ידי השלמת תקשורת צנטריפוגה צפיפות עם 10% כרך / כרך HBSS 10x.
- הכן 14 צינורות assay עם פתרון התקשורת צנטריפוגה צפיפות שונה HBSS, כמתואר בטבלה 2.
- מערבבים כל פתרון צפיפות (שלב 1.1.6.2) במרץ לפני הוספת תוכנו להדרגתיות. בעדינותלהוסיף הפתרונות צפיפות לצינור צנטריפוגות זכוכית 50 מ"ל עם משאבה peristaltic (1 מ"ל / דקה), החל את הריכוז הגבוה ביותר (70%). הימנע טיפות ידי ניקוז הפתרונות בקיר צינור לשמור על הפרדה נכונה של כל שכבה של צבע.
- בהיעדרו של משאבת peristaltic, להחיל את השכבות מאוד בעדינות עם טפטפות פסטר.
- הכן חיץ ריצה הסופי על ידי השלמת למאגר פועל (ראו טבלה של חומרים) עם 2% אנטיביוטי כרך / כרך / antimycotic (10,000 יחידות / מ"ל פניצילין G, 100 מ"ג / סולפט סטרפטומיצין מ"ל). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בידוד cytotrophoblast Villous
הערה: השתמש סטרילי כירורגי ציוד, כלי זכוכית, טפטפות, צלוחיות, וכו '- ביום הבידוד cytotrophoblast villous, באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, לחמם הפתרונות digestions (משלב 1.1.5) ו -70 מ"ל של FBS. הערה: השתמש 50 מ"ל של FBS להפסיק את digestions ואתהנותרים 20 מיליליטר עבור שלב ההקפאה (1.2.22) אשר ניתן למקם על קרח מופשר פעם.
- לאחר הלידה, להביא את השליה למעבדה במדיום התחבורה קר כקרח (משלב 1.1.1) כמה שיותר מהר (פחות מ 1 שעה).
- כאמצעי תחבורה מחק ודם השליה פח אשפה נוזלית. תשקול את השליה וטבלתי תמיסת מלח קר.
- למדוד ולנתח את התכונות הבאות: אורך חבל הטבור; לוקליזציה חבל טבור; אורך שליה, רוחב, צורה (סגלגל, discoid); צבע קרום; פתולוגיות מבנה טבורית. הערה: הנתונים מוצגים בסעיף התוצאות.
- חותכים את חבל הטבור לצד והחדרתו השליה (כלומר, בבסיסו עם מעגל רדיוס נוסף 1 ס"מ סביב חוט). לטבול 300 מ"ל של תמיסת מקבע רקמות היסטולוגית (פורמלין 10%) לניתוח היסטולוגית לאחר מכן.
- חותכים את השליה כולו לקוביות של 5 X 5 X 5 ס"מ. לשטוף ביסודיות (4 פעמים x ~ 1 דק ') ב סול מלוחיםution (0.9%) כדי להסיר תאי דם עד תמיסת מלח ברורה. בטל שטיפה נוזלית.
- בתוך זכוכית שעון, להסיר ממברנות השליה ורקמות טחונות להסיר כלי דם הסתיידויות. החזק את כלי דם בחוזקה עם מלקחיים ולהסיר רקמות באמצעות האחורי של מספרי מצנבאום.
- מניח שליה טחונה בתוך משפך ביכנר. לשטוף עם כ 100 מ"ל של חיץ מלוחים. המשך וקוצץ עד 30 - 35 גרם של רקמות טחונות מתקבל (פלסטיק לשימוש במשקל סירת מידה). במידת הצורך, לקצץ את שארית ההשליה להשיג עד שלוש נוספות 30 - הכנות 35 גרמו. במהלך תקופה זו, לשים רקמות טחונות בסירה במשקל על קרח.
הערה: שלב זה ייקח בערך 45 דקות עד 1 שעה.
- מניח שליה טחונה בתוך משפך ביכנר. לשטוף עם כ 100 מ"ל של חיץ מלוחים. המשך וקוצץ עד 30 - 35 גרם של רקמות טחונות מתקבל (פלסטיק לשימוש במשקל סירת מידה). במידת הצורך, לקצץ את שארית ההשליה להשיג עד שלוש נוספות 30 - הכנות 35 גרמו. במהלך תקופה זו, לשים רקמות טחונות בסירה במשקל על קרח.
- מוסיפים את 30 - רקמת השליה טחון 35 גרם בבקבוק trypsinizing. העברת 150 מ"ל של 1 פתרון העיכול מוכן (טבלה 1) אל הבקבוק trypsinizing ומערבבים היטב.
- מניחים את הבקבוק trypsinizing ברעד באמבט מים במשך 30 דקות במהירות של לא יותר מ 50 מחזורים / דקה ידנית לערבב את בקבוק trypsinizing כל 5 דקות לעיכול הומוגנית.
- בסוף לעיכול הראשון, הסר את בקבוק trypsinizing מן האמבטיה במים להטות אותו (45 °) עבור 1 דקות כדי משקע רקמת השליה. עם פיפטה 10 מ"ל סטרילי, להסיר ולסלק כ 80 מ"ל של supernatant. הימנע aspirating הרקמה.
- העברת 100 מ"ל של עיכול פתרון 2 (טבלה 1) אל הבקבוק trypsinizing; מערבבים היטב לחזור על שלב 1.2.9.
- בסוף לעיכול השני, להסיר את הבקבוק trypsinizing מן האמבטיה במים להטות אותו 45 מעלות במשך 1 דקות. עם פיפטה 10 מ"ל סטרילי, להסיר 80 מ"ל supernatant בעדינות להעביר צינור צנטריפוגות עם מסננת תא (100 רשת מיקרומטר). מעבירים את supernatant מסוננים כוס המכילה 2 מ"ל של FBS בכל פעם בצינור צנטריפוגות מלא.
- בצע את העיכול השלישי כמתואר עבורעיכול שני (1.2.11 ו 1.2.12) באמצעות 75 מיליליטר עיכול פתרון 3. במקביל, לבצע שלבים 1.2.15 כדי 1.2.16.1 לעיכול 2.
- בצעו את העיכול הרביעי בדיוק כמו עיכול השלישי באמצעות פתרון העיכול 4 (75 מ"ל), אבל לאסוף כמות מקסימלית של supernatant. בצע שלבים 1.2.15 כדי 1.2.16.1 במקביל לעיכול 3, ולבסוף לעיכול 4.
- Aliquot supernatant (מ digestions 2, 3 ו -4) לתוך 13.5 מ"ל חלקים, כל חלק לתוך צינור צנטריפוגות אחד 15 מ"ל. עם פיפטה פסטר זכוכית 22.8 ס"מ, מאוד בעדינות ומניחים לאט 1.5 מ"ל של FBS בתחתית כל צינור כדי ליצור שכבה נפרדת. אין לערבב FBS ו supernatant. בצנטריפוגה צינורות ללא בלם במשך 20 דקות ב 1250 XG בטמפרטורת החדר.
הערה: לאחר צנטריפוגה, 4 שכבות גלויות בצינור, כפי שמוצגות באיור 1 הפרדת תאי טריפסין trophoblast תמנע עיכול הסלולר מוגזם.. - עם משאבת ואקום, aspirאכלו וזורקים supernatant (פתרון העיכול) ושכבות FBS, כולל הסרט לבנבן בין שתי השכבות. Resuspend גלולה (להלן trophoblasts ושכבות של תאי דם אדומים) עם 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים חמים (שלב 1.1.2; ללא FBS ולא HEPES).
- איסוף תאים מושעים מכל הצינורות ולשלב אותם 1 צינור. בואו הצינור לעמוד בטמפרטורת החדר עד סוף כל digestions. הערה: אחרי הכל digestions, התשואה המקובלת היא 3 צינורות של תאי resuspended (אחד לכל עיכול).
- הפוך את הווליום עד 15 מ"ל עם מדיום תרבית תאים חמים. צנטריפוגות ב 1,250 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant עם משאבת ואקום. הימנע aspirating הגלולה.
- בעדינות resuspend גלולה המתקבל 3 צינורות עם 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים חמים. פינת התוכן שלהם 1 צינור. כדי להשיג 8 מ"ל, להשלים את נפח עם תרבית תאים בינוניים חם.
- מאוד בעדינות שכבת השעית התא על גראד הפרדהient עם פיפטה פסטר. צנטריפוגה ללא בלם במשך 30 דקות ב 507 XG בטמפרטורת החדר.
- לאחר צנטריפוגה, לזהות את השכבות השונות של תאי השיפוע עם דלקת חזרה. אתר את השכבות המכילות trophoblast לזהם תאים בין 40 - 50% של מדיום צנטריפוגה הצפיפות. עם משאבת ואקום, להסיר שכבות עליונות (> 50%).
- איסוף תאים ממוקם שכבות עניין עם פיפטה פסטר ולהעבירם צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. הפוך את הווליום עד 50 מ"ל עם מדיום תרבית תאים. צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 1250 XG בטמפרטורת החדר.
- בתנאים סטריליים, לבטל את supernatant, resuspend גלולה עם 20 מ"ל של FBS ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer. על הקרח, מוסיפים 2.22 מ"ל של sulfoxide דימתיל סטרילי (DMSO) ומערבבים בעדינות על ידי היפוך. Aliquot 1.5 מ"ל של תרחיף תאים לתוך צלוחיות קריוגני, להקפיא לילה ב -80 ° C ומעבירים מיכל חנקן נוזלי.
<li> טיהור Trophoblast - התקן את שטיפת מאגרי ריצת טור מסנן חדש על מכשיר הטיהור המגנטי על פי הוראות היצרן. בצע את "התכנית הנקיה" לנקות 1 שלילית, יציאות 1 וחיובים 2 חיוביים, ולאחר מכן להציג את הצינורות 50 מיליליטר תחת כל יציאה על פי הוראות היצרן.
- להפשיר את התאים שהוקפאו בשלב 1.2.22 במהירות באמבט מים 37 ° C. העברת תאי צינור 50 מיליליטר ותאי resuspend בעדינות עם 20 מיליליטר של תמיסת חיץ קרה. צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
- בטל supernatant. חזור על השלב לשטוף עם חיץ קר. ספירת תאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע כדאיות. חזור על צנטריפוגה (למשך 5 דקות, 450 XG ב 4 ° C). מוציאים בזהירות את supernatant. הוסף 1 מיליליטר של חיץ קר המכיל 1% כרך / כרך של עכבר נוגדנים נגד HLA-ABC. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, mixing דקות כל 5 בעדינות.
- הוסף 6 מיליליטר של חיץ קר. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant וחזור על שלב זה. תאים Resuspend ב 1 מ"ל של חיץ קרים המכילים 10% כרך / כרך של חרוזים מגנטיים מצמידים נוגדנים משני אנטי עכבר. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ערבוב כל 5 דקות בעדינות.
- הוסף 6 מיליליטר של חיץ קר. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant ו resuspend במאגר ריצה 5 מ"ל קר.
- הפרד את התאים trophoblast באמצעות מכשיר טיהור מגנטי. איסוף תאים בנמל שלילי ולהוסיף 20 מ"ל של חיץ קרים.
הערה: תאי Trophoblast אינם מכילים את HLA-ABC המורכב, ובכך מופרדים סוגי תאים אחרים ומכוון נמל 1 השלילי. - צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 450 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant בעדינות resuspend תא 20 מיליליטר בינוני תרבות הראשונית חמה. ספירת התאים מנצליםhemocytometer ga כדי לקבוע כדאיות.
- פלייט התאים על הצפיפות הבאה: 0.15 x 10 6 תאים / גם ב 96-גם צלחות, 1.6 x 10 6 תאים / גם ב 24 גם צלחות 4.5 x 10 6 תאים / היטב היטב 6 צלחות. דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- אשר את הטוהר של התאים trophoblast על ידי זרימת cytometry 16,17 ו / או על ידי immunocytochemistry 18.
הערה: הטוהר של תאי immunopurified נקבע באמצעות נוגדנים חד שבטיים FITC- מצומדות נגד cytokeratin-7 ו vimentin 17-19. פרוטוקול זה הוא גם מפורט Lanoix et al., 2008 7. - אחרי לפחות 4 שעות, לשטוף את התאים פעמים עם מדיום תרבות חמים כדי להסיר תאים פנויים ולאחר מכן להעביר את הצלחות אל תא normoxia, מורכב 8% O 2 (ראה איור 2, וסעיף 2).
2. במבחנה משרn של normoxia ו היפוקסיה / Reoxygenation
- מבצע תא חממה (ראה איור 2 א על Set-up).
- במנדף זרימה למינרית, מניחים צלחת פטרי המכילה מים סטריליים בתחתית תא חממה כדי למנוע יובש; אז במקום צלחות תרבית תאים בעבר הכינו או צלוחיות (שלב 1.3.10) על המדפים המעולים של החדר.
- מחוץ למכסת המנוע, לצרף את התא (יציאת כניסה) אל צינור הגז (איור 2 א: 5a, B ו- C) כדי להגיע הצינור של גז (8% O 2 או 0.5% O 2) (איור 2 א: 7). פתח בשני יציאות הכניסה ו לשקע של החדר. ברגע זה, רגולטור הגז (איור 2 א: 4) צריך להישאר סגורים.
- בזהירות לפתוח את שסתום וסת גז (איור 2 א: 4). סומק על 4 דקות עם זרימת אוויר של 25 ליטר / דקה כדי להחליף את האוויר לגמרי בתוך החדר.
- לאחר שטיפת החדר, לסגור את רגולטור הגז אז הכניסה ו ouיציאות tlet של החדר.
- ניתק את צינור יציאת מד זרימה (איור 2 א: 5c) מנמל הכניסה של החדר ומקום קאמרי חממת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס.
- חלף באוויר כרגע נוכח צלחות, הצלוחיות ופזר במדיום התרבות ידי מילוי הקאמרי עם hr 1 גז אחרי צעד 2.1.3.
- חזור על שלבים 2.1.1 עד 2.1.6 עבור היצירות גז אחרות (למשל, 2% O 2 לתרבות trophoblast השליש הראשון 9).
- אשר את אחוז החמצן (תרשים 2B-C)
- כדי לאשר את ריכוז חמצן מדיום תרבית תאים (ללא תאים) בתוך החדר, השתמש אלקטרודה חמצן מחוברת למתאם חמצן. חבר את האלקטרודה חמצן מד מתח.
- צור עקומת כיול באותו הפתרון (כלומר, מדיום סלולארי תרבות) על ידי חשיפת הפתרון גז עם תוכן חמצן ידוע (למשל, 0% ו21% חמצן). לאחר קריאות מיוצבים עבור כל ריכוז, להציג את האלקטרודה לתוך המדיום בתא.
הערה: קח את כל המדידה באותו העומק על מנת למנוע הטיות בריכוז חמצן 10.
- אינדוקציה של normoxia ו היפוקסיה / reoxygenation ב trophoblasts.
- לאחר הוספת תאי trophoblast עיקריים צלוחיות תרבית תאים המתאימות, צלחות או צלחות פטרי, לבצע טיפולים לפי צורך.
- במקביל, בתוך החדר, לחשוף תאים לתערובת הגז הרצוי להתרבות תנאים מסוימים כל 24 שעות (איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידוד immunopurification של תאי cytotrophoblast villous מתוך השלית טווח נורמלית שהתקבלה על ידי משלוח נרתיק ניב 1 x 10 8 תאי קיימא. השליה שקלה 350 גרם, היה 19 ס"מ קוטר, 4 ס"מ עם צורה discoid וממברנות שקוף. אין מום טבורית זוהה. חבל הטבור היה לוקליזציה paracentral ובאורך של 56 ס"מ. הטוהר הוערך על ידי cytometry זרימה באמצעות vimentin ו cytokeratin-7 סמנים. יותר מ 98% מכלל התאים היו שליליים עבור vimentin וחיוביות עבור cytokeratin-7, המאשרים את הטוהר של תאי trophoblasts villous המתקבל immunopurification. תאים cytotrophoblast Villous נוספו תרבות צלחות 96-היטב בתנאים normoxic בנוכחות או בהעדר מלטונין 1 מ"מ. הבידול ביוכימיים של cytotrophoblasts villous היה פיקוח על ידי קביעת רמות גונדוטרופין כוריוני β-אדם (β-hCG) הפרשה כמושתואר לעיל 1,7,20,21. הבידול מורפולוגיים אפופטוזיס הוערכו על ידי immunofluorescence באמצעות-desmoplakin אנטי סיבי ביניים נגד caspase-ביקע 18 cytokeratin 7,22. תרבית תאים התקשורת מיום 1 (בעיקר cytotrophoblasts villous) עד היום 4 (בעיקר syncytiotrophoblasts) נאספו, centrifuged ורמות β-hCG נמדדו supernatants. הפקה של β-hCG, אשר הוא בלעדי ל syncytiotrophoblast, גדלה עם זמן תרבות (איור 4). לא רק היפוקסיה / reoxygenation, אבל hyperoxia (> 20% O 2) גם מופעל אפופטוזיס 23. לכן, אימוץ של ריכוז 8% O 2 היה נציג של כמות החמצן שאליו תא trophoblast villous ייחשפו במהלך השליש השלישי של ההריון 10. השיא של רמות β-hCG שנצפו 72 שעות אשר את היכולת של cytotrophoblasts villous להבדיל בתנאים אלה.מלטונין לא שינה הפרשת hCG-β בתנאי לימוד אלו. הירידה של רמות β-hCG ב 96 שעות נגרמה ככל הנראה על ידי אפופטוזיס של תאי trophoblast, דבר המגדיל לאחר תקופות ממושכות בתרבות העיקרית 5,7,22,24,25 (איור 4). DMSO (0.1% כרך / כרך) נבחר משום שהיא לא השפיעה על רמות β-hCG 26,27. את תפקיד המגן של מלטונין היה קשור באופן תכונות נוגדות חמצון שלה. היפוקסיה / reoxygenation לאחר 72h של סטרס חמצוני מושרה תרבות תאי trophoblast villous. האפקט המגן של מלטונין הוערך עם מיני חמצן תגובתי (ROS) איתור מגיב (איור 5 א). לאחר 96 שעות של תרבות, התאים trophoblast הודגרו במשך 45 דקות עם 10 מיקרומטר של 5 (ו -6) -carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA) כדי לזהות את הסכום הכולל של ROS המיוצר 8. תאי trophoblast Villous שעברו היפוקסיה / reoxygenation היומשמעותי רמות גבוהות ROS (54%) בהשוואה לאלו תחת normoxia. עלייה זו התהפכה על ידי טיפול עם 1 מלטונין מ"מ. יתר על כן, תחת normoxia מלטונין לא לווסת רמות ROS (הומאוסטזיס), אשר היה דומה תאים trophoblast villous שאינם מטופלים (איור 5 א). איור 4 ולהראות 5A כי תחת normoxia מלטונין לא לשנות את רמות של סטרס חמצוני או הפרשת hCG-β בתאי trophoblast, אשר מאשש מחקרים קודמים שהראו לא אפנון של הומאוסטזיס תא בתנאים רגילים 28,29.
איור 1:. Tube עיכול לאחר צנטריפוגה, 4 שכבות נוצרות. השכבה העליונה מורכבת פתרון העיכול; רק בהמשך, בסרום שור העובר (FBS). שני השכבות אמורות להיות מושלכות עם משאבת ואקום. בשכבות הנמוכות arדואר מורכב כדלקמן: שכבה לבנה המכילה פיברובלסטים, לויקוציטים, מקרופאגים, ו trophoblasts; ושכבה תחתונה המורכבת של כדוריות דם אדומות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 2: רכיבים של לשכת היפוקסיה ומדידה / חישוב ריכוז חמצן מומס (א) תא היפוקסיה והרכבת בלון גז: (1) גליל גז; (2) רגולטור גז; (3) מהדק צינור גז; (4) צינור גז צילינדר; (5) מסנן מפרצון; (6) צינור כניסה; (7) מד זרימה; (8) צינור יציאה; (9) תא חממת מודולרי. (ב) חישוב ריכוז חמצן בפועל במדיום תרבית תאים באמצעות עקומת סטנדרט מיוצרת עם ריכוזי חמצן ידועים. (C ו- D)הערכים ביחס שהושגו הפתרונים "0% O 2" ו "21% O 2", הם זממו גרפיים כפונקציה ליניארית כדי לקבוע את ריכוז חמצן מדיום תרבית תאים "?% O 2". אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. עיצוב ניסיוני גנרי של תרבית תאים של התקרה בחדר דגירה מודולרי normoxia (8% O 2, 5% CO 2; 87% N 2) היפוקסיה / reoxygenation (H / R) (0.5% O 2, 5% CO 2; 94.5% N 2) הם מצבים בהם כדי ללמוד בתנאים פתולוגיים cytotrophoblast villous (vCTB) ו syncytiotrophoblast (תאים STB). כל 24 שעות, בינוני עם או בלי מלטונין (1 מ"מ) משתנהואת תערובת הגז מתחדשת. תחת H / R, תאים STB לעבור היפוקסיה (0.5% O 2) עבור 4 שעות ולאחר מכן לחזור normoxia (8% O 2). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. השפעת מלטונין על גונדוטרופין כוריוני בטא-אדם (β-hCG) הפרשה במהלך Villous Trophoblast בידול תאי cytotrophoblast Villous בודדו מטוהרים מן השליות טווח בריאות אדם. תאים שטופלו במשך 96 שעות עם 1 מ"מ מלטונין או sulfoxide דימתיל (DMSO 0.1%: שליטה ברכב) בתנאים normoxic (8% O 2, 5% CO 2; 87% N 2). β-hCG רמות במדיום תרבות נמדדו על ידי assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) לאחר 24, 48, 72 ו -96 שעות oהתרבות העיקרית f. רמות היו מנורמל את תכולת החלבון של lysate כל תא אחד המתאים גם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. אפקט אנטי-אוקסידנטית של מלטונין Syncytiotrophoblast חשופים היפוקסיה / Reoxygenation (א) ההשפעה של מלטונין (M; 1 מ"מ) על מינים החמצן מגיב תאיים (ROS) רמות בתאים syncytiotrophoblast תחת normoxia (N) או היפוקסיה / reoxygenation (HR), הנגרם לאחר 72 שעות של תרבות, הוערך על ידי 5 (ו -6) -carboxy-2 ', diacetate 7'-dichlorodihydrofluorescein (carboxy-H2DCFDA) קרינה. תוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית התקן של 3 השליות שונות; *** P <0.001 (Lanoix, et al. 8). (ב) מסלולי הסלולר מעורבים בהגנה המשוערת של מלטונין נגד היפוקסיה / אפופטוזיס מושרה reoxygenation. תאי cytotrophoblast villous העיקריים היו בתרבית למשך 72 שעות תחת normoxia (8% O 2) כדי לאפשר בידול לתוך syncytiotrophoblast. התאים נחשפו 1 מ"מ של מלטונין או שליטה ברכב ולאחר מכן נתון היפוקסיה (0.5% O 2) עבור 4 שעות ואחריו תקופה של 18 שעות reoxygenation (8% O 2). היפוקסיה / reoxygenation הנגרמת סטרס חמצוני מפעיל גורמי שעתוק רגיש חיזור כגון B קאפה הפקטור הגרעיני (NF-κB) היפוקסיה מושרה גורם 1 (HIF-1). NF-κB גורם p53, אשר מפעילה את מסלול Bax / Bcl-2 של אפופטוזיס המיטוכונדריה מעורבים המחשוף והפעלה של caspases 9 ו -3 caspase 3 מפעיל Rho הקשורים, פרוטאין קינאז המכילים סליל מפותל 1 (ROCK-1), המחשוף של פולי (ADP-ריבוז) פולימראז (PARP) ופגיעה תיקון DNA. מלטונין מנעזה אינדוקציה של אפופטוזיס המיטוכונדריה על ידי מתנהג כמו נוגדי חמצון רבי עוצמה כדי להפחית את הלחץ החמצוני שנגרם היפוקסיה / reoxygenation. נתון זה יש הבדל בין Lanoix et al., 2013 8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| עיכול 1 | עיכול 2 | עיכול 3 | עיכול 4 | |
| השתנה HBSS (מ"ל) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAse (μl) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0.1 מ"ג /μl) | ||||
| MgSO 4 (μl) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 מ"מ) | ||||
| CaCl 2 (μl) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 מ"מ) | ||||
| טריפסין (U) | 1,824,000 | 1,200,000 | 960,000 | 960,000 |
| P / S (מ"ל) | 1 | 0 | 0 | 0 |
טבלה 1: כמויות המצרכים פתרון העיכול פניצילין סטרפטומיצין (P / S);. מגנזיום סולפט (4 MgSO); סידן כלורי (CaCl <sub> 2); deoxyribonuclease IV (IV DNase).
טבלה 2: כרכים של פתרון צפיפות צנטריפוגה מדיה השתנה HBSS הנדרש עבור הכנת התמיסה Gradient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביונקים, התפתחות עוברת תלויה ישירות על תפקוד השליה נאות. מקורותיה ההתפתחותי של הפרעות בריאות מבוססים על ההשערה כי הגורם למחלות לידי ביטוי בשלב מאוחר יותר בחיים יכול להיות נעוצה בהתפתחות מוקדמת וכי השליה יש תפקיד מכניסטית בתכנות עוברי 30-32. השליה היא מתווך המפתח של גדילת עובר ופיתוח: זה מסדיר העברת מזין, מגן מפני חשיפות מזיקות, ויש לו פונקציות האנדוקרינית גדולות. הפיתוח על ידי Kliman et al. של טכניקה לשחזור לבודד cytotrophoblasts העיקרי הקיימא הוא ציון דרך בחקר פונקציות השליה נורמליות נורמליות 6. חוקרים רבים הסתגלו בטכניקה זו כדי לשחזר תנאים ספציפיים במבחנה להבין 18,20,33,34 פיזיולוגית שליה. כפי שתואר על ידי Petroff et al., צעדים רבים חשובים להבטחת תשואה מטוהרת ויציבה של ציטומגלווירוס המבודד18 תאים trophoblast. לדוגמא, שלבי העיכול עברו מספר שינויים מאז הפיתוח של הטכניקה בשנת 1988, כגון הגדלת מספר ואורך של digestions, וכן בהרכב ובכמות של אנזימים לעיכול, וכתוצאה מכך מספר גדול יותר של cytotrophoblasts הקיימא המבודד 18. הפרוטוקול הנוכחי זה יש שלושה יתרונות עיקריים: cryopreservation, המאפשר את האפשרות להמשיך בפרוטוקול מאוחר טיהור immunomagnetic, דבר המגדיל טוהר cytotrophoblast ושימוש טרום מצופה microplates שיפור תא מצורף 7,34-36. הספרות הקיימת מכילה כמה דוגמאות לשינויים מגוונים של הטכניקה לבידוד תאי cytotrophoblast, אבל המאפיינים של תקשורת צנטריפוגה הצפיפות נותרו כמעט ללא שינוי 37. הטכניקה הציגה הבידוד / immunopurification יש כמה שלבים קריטיים. לפיכך, חשוב להעריך את הטוהרשל תאי cytotrophoblast villous בסוף כל immunopurification. ניתן לעשות זאת על ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים מתאימים כסמנים: cytokeratin-7 (סמן trophoblastic), מקבץ של בידול 45 (CD45) ו vimentin (לא trophoblast סמנים תאים) 18,38,39. היבטים קריטיים נוספים על איכות השליות שנתקבלו, FBS ו שיפוע תקשורת צנטריפוגה הצפיפות, כמו גם מהירות צנטריפוגה, אשר עשוי להשפיע על התפוקה ואיכות של התאים 20,40.
למרות בשימוש נרחב, הטכניקה הנוכחית יש מגבלות בלתי נמנעות. ראשית, כמות תאי cytotrophoblasts קיימא המתקבלים לאחר immunopurification היא נמוכה יחסית והוא גורם המגביל העיקרי במספר תנאים / טיפולים אפשריים שיכול להיבדק. שנית, אורך החיים של תאי trophoblast העיקריים הוא קצר ב בידול במבחנה לתוך syncytiotrophoblast הוא ובעקבותיו צמצום של התא viabili ty וגידול של אפופטוזיס. אורך קצר של כדאיות התא trophoblast שאינו להתרבות במבחנה, מגביל את הערכה של טיפולים לטווח ארוך יותר, בגלל אפופטוזיס מופעלת באופן בלתי הפיך לאחר כ -4 ימים של תרבות 7,41. שלישית, השתנות interplacental הן גדולות, כך מספר רב יחסי של שליות נדרש כדי להשיג תוצאות וניתנות לפרשנות סטטיסטית. מצד השני, תרבות trophoblast העיקרית יש יתרונות ייחודיים, כגון היכולת של התאים להתמיין syncytium, המאפשרת לחקר תנאים וטיפולים ב פנוטיפים תאים שונים על פי השלבים השונים של בידול. שיטת החמצון שהוצגה בפרוטוקול זה ניתנת להתאמה מאוד התצורה שלו ניתן להתאים למצבים אחרים, כגון התרבות של תאי trophoblast ראשית ממנהל הריון בטרימסטר הראשון, שאמור להיחשף מתח חמצן נמוך יותר עבור normoxia 9,42,43.
ntent "> ישנן גישות אחרות כדי ללמוד לתפקד שליה אנושית במבחנה. Snap-הקפאת רקמות השליה מאפשרת-omics רב ניתוחי, אבל דורש דגימת multisite שליה, כדי למנוע וריאציות מטבולית למשל בשל שיפוע החמצון, אשר מקטינות מהתחנה המרכזית villi אל 44 בפריפריה. עם זאת, ביולוגית התנהגות תא trophoblast חייה לא ניתן ללמוד באמצעות גישה זו 45. explants villous יש את היתרון של שמירה על מבנה villous השלם עם סוגי תאי מרכיבים והתקשורת שלהם, אבל תגובות טיפולים שאינן ספציפיות תאים trophoblast 23. זמינים מסחרית דמוי trophoblast שורות תאים choriocarcinoma, כגון BeWo, Jeg-3 ו JAR שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד פונקציות השליה, כגון היתוך, בידול, והתחבורה transplacental. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי ביטוי גנים בחינוך היסודי cytotrophoblasts ותאים סרטניים BeWo מתואמים היטב 46-48. Tהוס, תרבית תאי trophoblast villous עיקרית, למרות מגבלותיו, להחזיק את היתרון הייחודי של מחק את סביבת vivo של השליה הנורמלית או לא נורמלית.מחקרים שעשו שימוש התא trophoblast villous בתרבות הראשוני explants villous מראים כי היפוקסיה היפוקסיה / reoxygenation שיטתי להקטין כדאיות התא trophoblast, בד בבד עם רמות גבוהות של עקה חמצונית, דלקת, autophagy אפופטוזיס 43,49-52. היפוקסיה / reoxygenation תא זה מודל התרבות, במיוחד, אפשר לנו להדגים את ההשפעות נוגדות חמצון ואנטי-אפופטוטיים של מלטונין בתאי trophoblast villous. בתאים trophoblast villous העיקרי חשוף היפוקסיה / reoxygenation, מלטונין מונע את הפעולות הבאות: אינדוקציה של סטרס חמצוני, ירד פעילויות אנזים נוגד חמצון, פעילות מוגברת של מסלולי איתות חיזור רגיש, ו אינדוקציה של אפופטוזיס המיטוכונדריה (איור 5 ב) 8. ח.י.poxia / דגם reoxygenation הוא כלי ייחודי כדי לברר את תפקיד מניעתי של מלטונין ניזק שנגרם עקב מתח חמצוני תפקיד המגן האפשרי ב סיבוכי הריון כגון רעלת הריון, שבו סינתזת מלטונין שליה מצטמצמת 53. מלטונין הוא נוגד חמצון רב עוצמה עם מגוון רחב של מטרות 54. כמו כן, את שלומם של מלטונין כטיפול כבר נקבע במידה רבה. התוצאות המועילות עם מלטונין שוחזרו על ידי מספר חוקרים ומלטונין הוא כעת בניסויים קליניים כטיפול מניעתי או טיפולי פוטנציאל בהריונות המסובכים בגלל הגבלת רעלת הריון או צמיחה תוך רחמי 55,56.
לסיכום, את הבידוד, טיהור התרבות העיקרית של איכות גבוהה cytotrophoblast תאים, יחד עם הטכניקה של היפוקסיה / reoxygenation לאפשר מגוון רחב של גישות ניסיוניות מבטיחות כדי להבין טוב יותר לסיבוכי הריון הקשורים חמצוניםלחץ ולשפר בריאות שליה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E.
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L.
- Barker, D. J.
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J.
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
