Introduction
整个人类怀孕，胎盘滋养层细胞，这是单个核干细胞，快速增殖和分化成绒毛或绒毛外滋养层细胞。绒毛外滋养细胞侵入并重塑子宫壁的螺旋动脉。绒毛细胞滋养细胞，另一方面，不断地增殖，分化和融合形成多核合体（合胞体）1。绒毛滋养细胞稳态的维持是胎儿的福祉和健康的怀孕是必不可少的。事实上，绒毛滋养细胞允许氧气和营养物质的母胎交换，并产生必要的荷尔蒙怀孕。此外，该合体是唯一的细胞类型与母体血液循环的直接接触，并提供了一个基本的物理和免疫障碍。因此，必须合体凋亡和替代稳态维护和AVOID胎盘病变2-5。
通过Kliman 等 6在1986年发展到初级绒毛细胞滋养细胞从人胎盘分离的技术中，允许参与绒毛滋养细胞分化的分子机制的研究导致胎盘研究了一场革命。这种古典工艺的基础上，用胰蛋白酶和DNA酶连续酶消化，其次是密度离心分离介质（胶体二氧化硅颗粒涂层由聚乙烯吡咯烷酮，或珀）是目前公认的金标准隔离绒毛细胞滋养层细胞。该技术可以通过磁免疫纯化，即从基于这些细胞的表面上的特异性抗原的差异表达非滋养层细胞分离绒毛细胞滋养层的过程进行优化。我们选择了人类白细胞抗原ABC（HLA-ABC）由于对滋养细胞MEMBRAN没有其表达Ë7,8。
胎盘是妊娠期间发生的氧气含量急剧变化的机构。在第一三个月，充氧比率是生理上非常低的（2％O 2），但增大到在第二和第三个三个月氧合温和水平（8％O 2）。 Tuuli 等人 9描述了胎盘绒毛内的滋养环境的体外再生是在氧合水平的挑战和变化甚至可能导致表型的改变。正是因此，建议采用8％的氧作为常氧模仿怀孕8,9的3个月期间胎盘绒毛中发现的氧张力。 Chen等人 10广泛的研究与在滋养层细胞培养物中的氧张力几个变量和表现出确定在细胞周围环境中的氧含量的重要性。氧在绒毛水平趋向于增加由于血管。在不断胎盘绒毛增加血流和过氧化氢 的水平（一种丰富的活性氧）是控制血管11,12的重要信号。在妊娠并发症，缺乏血管生成的产生缺氧，更重要的是，氧的间歇性变化（称为缺氧/复氧）。这些条件导致氧化应激的异常增加，这影响胎盘和胎儿的生存能力13,14。即滋养层细胞缺氧/复氧发作期间在体内经历的改变可以在体外模仿如下：绒毛细胞滋养细胞中含氧量正常的条件（8％O 2），直到它们分化 成合体下保持。然后将它们进行4小时低氧条件（0.5％O 2），其次是常氧（复氧）的另外的18小时。使用这种缺氧/复氧的做法，滋养细胞前hibit解除管制的氧化还原状态和增加的固有凋亡8的水平，正如在某些妊娠并发症被观察到。因此，这是一个有用的体外模型来评估，以打击胎盘缺氧/复氧关联妊娠并发症的新的预防和治疗的方法。
胎盘细胞产生的褪黑激素，其具有几个重要的功能，如要避免氧化应激和胎盘功能不全15的能力。这里，我们目前使用在分子，细胞和功能8级证明褪黑激素在胎盘滋养层细胞的保护作用的实验方法和细胞模型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
从简单怀孕的密友 - 圣 - 吕克医院，蒙特利尔，加拿大自然阴道分娩后立即获得胎盘，有知情患者同意和伦理委员会（CHUM圣 - 吕克医院和INRS学院阿尔芒 - Frappier批准，拉瓦尔，QC，加拿大）。
绒毛细胞滋养层细胞1.分离和纯化
- 解决方案和媒体
- 通过补充准备传输介质贝科改良Eagle培养基高糖（DMEM-HG）用1％ 体积/体积的抗生素（10,000单位/ ml青霉素G，100毫克/毫升硫酸链霉素）和储存在4℃。
- 通过用10％ 体积/体积的胎牛血清（FBS），25mM的4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），1％ 体积/体积的抗生素（10,000单位/补充的DMEM-HG制备原代培养介质毫升青霉素G，100mg / ml的链霉素硫酸盐），并存储在4℃。温暖的媒体至37℃之前使用。
- 制备4升的盐水溶液（0.9％重量/体积的氯化钠）。
- 准备加入的25mM HEPES至1x HBSS（pH 7.4）中改性Hank氏平衡盐溶液（HBSS）中。
- 制备的消化溶液新鲜，四瓶具有修饰的HBSS（在1.1.4的方法制备），硫酸镁（MgSO 4上），氯化钙（ 氯化钙 ），胰蛋白酶，脱氧核糖核酸酶IV（DNA酶IV）和1％ 体积/体积的抗生素（ 10,000单位/ ml的青霉素G，100毫克/ ml硫酸链霉素），如表1所示。
- 准备密度离心媒体梯度
- 通过补充密度离心介质，用10％ 体积/体积的HBSS 10倍制备密度离心介质溶液。
- 制备具有密度离心介质溶液和改性的HBSS 14测定管，如表2所述。
- 大力增加其内容的梯度之前每个混合密度的解决方案（步骤1.1.6.2）。平缓用蠕动泵（1毫升/分钟）中，加入浓度溶液到50ml玻璃离心管中，以最高浓度（70％）开始。通过排放靠在管壁溶液保持梯度的每层的适当分离，避免液滴。
- 在没有蠕动泵，轻轻敷层采用巴氏吸管。
- 准备通过补充运行缓冲液最终运行缓冲液（见材料的数据表），用2％ 体积/体积的抗生素/抗 真菌剂（10,000单位/ ml青霉素G，100毫克/ ml硫酸链霉素）。保存在4℃。
- 绒毛细胞滋养层隔离
注意：使用无菌手术器械，玻璃仪器，移液管，烧瓶等 。- 上绒毛细胞滋养层隔离的当天，在37℃水浴中，温消化溶液（从步骤1.1.5）和70的FBS毫升。注意：使用50毫升FBS的中断消化和剩下的20毫升，可置于冰上解冻一次冷冻工序（1.2.22）。
- 分娩后，使胎盘在冰冷的传输介质（来自步骤1.1.1）实验室尽快（小于1小时）。
- 放弃传输介质和胎盘血液体垃圾箱。称取胎盘，冷盐水浸泡。
- 测量和分析以下特点：脐带的长度;脐带定位;胎盘的长度，宽度，形状（椭圆形，盘状）;膜的颜色;子叶结构的病症。注：数据在结果部分提出。
- （用线缠绕的附加1厘米圈半径即在其基）剪断脐带的旁边插入胎盘。浸泡在300毫升病理组织固定液（福尔马林10％）供以后组织学分析的。
- 切整个胎盘进入5×5×5厘米的立方体。彻底清洗（4次X〜1分钟）生理盐水溶胶ution（0.9％）以除去血细胞，直到盐溶液是明确的。弃去冲洗液。
- 在手表的玻璃，取出胎盘胎膜切末组织去除血管和钙化。用钳子紧紧握住血管和删除使用剪刀梅岑鲍姆的背部组织。
- 放置剁碎胎盘在一个布氏漏斗。用有约100ml生理盐水缓冲液漂洗。继续切碎，直到30 - 35克剁碎组织获得（使用塑料称量船和规模）。如果需要的话，肉的胎盘剩下来获得多达三个额外的30 - 35克准备。在此期间，把组织糜在称量舟上冰上。
注意：此步骤将花费大约45分钟至1小时。
- 放置剁碎胎盘在一个布氏漏斗。用有约100ml生理盐水缓冲液漂洗。继续切碎，直到30 - 35克剁碎组织获得（使用塑料称量船和规模）。如果需要的话，肉的胎盘剩下来获得多达三个额外的30 - 35克准备。在此期间，把组织糜在称量舟上冰上。
- 35克剁碎胎盘组织到胰蛋白酶瓶 - 30添加。转让150毫升准备消化液1（ 见表1）的胰蛋白酶消化烧瓶中拌匀。
- 放置胰蛋白酶消化烧瓶中一个在不超过50个循环/分钟的速度振摇水浴30分钟并手动混合胰蛋白酶烧瓶每5分钟均匀消化。
- 在第一消化的末端，取出从水浴的胰蛋白酶烧瓶和其倾斜（45°）为1分钟以沉淀胎盘组织。用10毫升无菌吸管，删除和丢弃约80ml上清液。避免吸组织。
- 将100毫升消解液2（ 表1）的胰蛋白酶瓶;拌匀，重复步骤1.2.9。
- 在第二消化的末端，取出从水浴的胰蛋白酶烧瓶和其倾斜45°1分钟。用10毫升无菌移液管，取出80毫升上清液和轻轻地用细胞过滤网（100微米目）转移到一个离心管中。传送过滤的上清液含有每离心管充满时2毫升FBS的烧杯中。
- 作为所述执行第三消化使用75毫升消解液3.在平行的第二个消化（1.2.11和1.2.12），执行步骤1.2.15到1.2.16.1消化2。
- 准确执行第四消化作为使用消化溶液4（75毫升）中的第三消化，但收集上清的最大量。执行步骤1.2.15到1.2.16.1并行消化3，最后消化4。
- 等分试样（来自消化2，3和4）将上清液进13.5毫升部分，每个部分为一15ml离心管中。随着22.8厘米长的玻璃巴斯德吸管，轻轻地，慢慢地放置1.5毫升FBS在每个管的底部，以创建一个单独的层。不要混合FBS和上清液。离心管不带制动器20分钟，在室温1250 XG。
注意：离心后，4层是可见在管， 如图1胰蛋白酶和滋养细胞的分离避免了过多的细胞消化。 - 用真空泵，aspir吃并丢弃上清液（消化溶液）和FBS层，包括两个层之间的白色膜。重悬沉淀（滋养细胞和红血细胞层）用1毫升温细胞培养基（步骤1.1.2;无FBS和没有HEPES）。
- 收集所有的管子悬浮细胞，并在1管将它们结合起来。让该管在室温下放置直到所有消化的末端。注：所有的消化之后，通常的产量悬浮细胞（消化每一个）3管。
- 补足体积至15ml用温细胞培养基。离心在1250 xg离心在室温下10分钟。除去用真空泵上清。避免吸沉淀。
- 轻轻悬浮用1毫升温细胞培养基从3管得到的粒料。他们集中在1管的内容。要获得8毫升，完成与温暖细胞培养基的体积。
- 轻轻在分离层毕业生细胞悬液ient用巴氏吸管。没有制动离心30分钟，在室温下507 xg离心。
- 离心后，确定在与背面照明梯度细胞的不同的层。找到包含滋养层和40之间污染细胞层 - 密度离心培养基的50％。用真空泵，除去上层（> 50％）。
- 收集位于的用巴氏吸管兴趣层细胞，并将它们传送到一50ml离心管中。补足体积至50ml用细胞培养基。在室温下以1250 xg离心离心10分钟。
- 在无菌条件下，弃上清，重悬用20ml的FBS的颗粒和计数使用血球细胞的数目。在冰，加2.22毫升无菌二甲基亚砜（DMSO），并通过翻转轻轻拌匀。细胞悬浮到低温小瓶等分1.5毫升，在-80℃冷冻过夜，然后转移至液氮罐中。
<LI>净化滋养层 - 安装在漂洗和运行缓冲液和上根据制造商的说明在磁性纯化仪器新的过滤器柱。执行“清洁程序”，以干净的负1，积极的1和2阳性端口，然后根据制造商的说明每个端口下引入50ml试管。
- 解冻在步骤1.2.22在37℃水浴中被冻结迅速的细胞。转移细胞到50ml管中，轻轻地用20ml冷的流动缓冲液悬浮细胞。离心反应管在450 xg离心5分钟，4℃。
- 弃去上清液。重复洗涤步骤用冷运行缓冲液。使用血细胞计数器确定可行性计数细胞。重复离心（5分钟，450 xg离心在4℃）。小心取出上清液。加入1毫升含有1％ 体积/小鼠抗-HLA-ABC抗体的体积冷运行缓冲液中。在4℃孵育30分钟，mixi网纳克轻轻每隔5分钟。
- 加6毫升冷运行缓冲液。离心机在450 xg离心5分钟，4℃。弃上清，重复此步骤。悬浮细胞在1ml含有10％ 体积/抗小鼠二级抗体偶联的磁珠体积冷运行缓冲液中。孵育在4℃下15分钟，轻轻混合，每5分钟。
- 加6毫升冷运行缓冲液。离心机在450 xg离心5分钟，4℃。丢弃在5毫升冷磨合缓冲上清，重悬。
- 使用磁净化仪器分离滋养层细胞。收集细胞在负端口，加入20毫升冷运行缓冲液。
注意：滋养层细胞不包含复杂的HLA-ABC，并因此从其它细胞类型分开，朝向负1端口。 - 离心机在450 xg离心5分钟，4℃。弃去上清液并轻轻重悬细胞于20毫升温暖原培养基。全光照计数细胞GA血球确定可行性。
- 板中的细胞在以下密度：0.15×10 6个细胞中/孔的96孔板，1.6×10 6个细胞中/孔24孔平板和4.5×10 6个细胞/孔在6孔板中。在37℃和5％CO 2孵育板。
- 确认滋养细胞通过流动纯度16,17仪和/或免疫细胞化学18。
注意：在使用FITC缀合的单克隆抗体对细胞角蛋白-7和波形蛋白17-19测定免疫纯化的细胞的纯度。该协议是在Lanoix 等人以及详细的，2008年7月。 - 至少4小时后，冲洗细胞两次用温培养基以除去未附着细胞，然后在板传送到常氧腔室，它是由8％O 2（ 见图2和第2部分）的。
2.体外感应仪常氧n和缺氧/复氧
- 孵化室的操作（参见设置图2A）。
- 在层流罩，将含有无菌水在培养箱室，以避免干燥的底部培养皿;然后将先前制备的细胞培养板或烧瓶（步骤1.3.10）在腔室的上货架上。
- 罩外，附加的腔室（吸入口）的气体的软管（ 图2A：图5a，b和c），以达到气体（8％O 2或0.5％O 2）的管（ 图2A：7）。打开腔室的入口和出口端口。在这一刻，该气体调节器（ 图2A：4）应该保持封闭。
- 小心打开气体调节阀（ 图2A：4）。冲洗为25升的空气流4分钟/ min至完全取代空气室内部。
- 冲洗室后，关闭燃气调压器，然后入口和OU腔室的tlet端口。
- 拔掉流量计出口软管（ 图2A：5C）从室的入口，并放置在细胞培养恒温箱腔室在37℃。
- 通过步骤2.1.3后气体1小时填充所述腔室替换当前存在于该板，烧瓶，溶解于培养基中的空气。
- 重复步骤2.1.1 2.1.6其他气体组成（ 如 2％O 2早孕滋养细胞培养9）。
- 确认氧气百分比（ 图2B-C）
- 为了确认氧在细胞培养基中室内部的浓度（无细胞），使用连接到一个氧适配器氧电极。氧电极连接到一个电压计。
- 创建在同一溶液中的标准曲线（ 即 ，细胞培养基）通过溶液到气体与已知的氧含量（曝光例如 ，0％和21％的氧气）。读数是稳定的对于每个浓度后，引入电极到该室中的介质。
注：以所有测量在相同的深度，以避免在氧浓度10任何偏差。
- 在滋养细胞常氧和缺氧/复氧的诱导。
- 增加的主要滋养细胞到合适的细胞培养瓶，板或培养皿后，进行必要的治疗。
- 并行地，腔室的内部，细胞暴露于所需的气体混合物以再现特定的条件，每24小时（ 图3）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
分离和绒毛细胞滋养层细胞的免疫纯化从经阴道分娩获得正常足月胎盘产生1×10 8个活细胞。胎盘称重350克，为19厘米，直径4厘米高与圆盘状和透明膜。没有检测到子叶畸形。脐带有旁本地化和56厘米的长度。的纯度通过流式细胞术使用波形蛋白和细胞角蛋白7的标记。细胞的98％以上是阴性的波形和阳性细胞角蛋白7，确认从免疫纯化获得的绒毛滋养细胞的纯度。绒毛细胞滋养层细胞在1mM的褪黑激素的存在或不存在含氧量正常条件下，加入到96孔培养板中。代绒毛滋养细胞的生化分化通过测定β人绒毛膜促性腺激素水平监测（β-HCG）的分泌此前1,7,20,21描述。形态分化和凋亡免疫荧光使用抗桥粒斑和抗胱天蛋白酶裂解细胞角蛋白18的中间丝7,22评估。从第1天（主要是绒毛细胞滋养细胞）到4天（主要合体）细胞培养基，收集，离心，在上清测定β-hCG水平。 β-HCG，它是专用的合体，生产与培养时间（ 图4）增加。不仅缺氧/复氧，高氧，但（> 20％O 2）也激活细胞凋亡23。因此，采用8％的O 2浓度为代表，其中绒毛滋养细胞会在怀孕10的第三孕期暴露的氧气量。在72小时观察到的β-hCG水平的峰值证实绒毛细胞滋养细胞在这些条件下分化的能力。脑白金没有改变这些研究条件下，β-HCG的分泌。 β-hCG水平在96小时的下降很可能是由滋养细胞的凋亡，这在原代培养长时间5,7,22,24,25（ 图4）后增加而引起的。 DMSO（0.1％ 体积/体积 ）中的选择，因为它没有影响β-hCG水平26,27。褪黑激素的保护作用强烈有关其抗氧化性能。绒毛滋养细胞培养诱导的氧化应激的72小时后缺氧/复氧。褪黑激素的保护作用与活性氧（ROS）的检测试剂（ 图5A）进行评估。培养96小时后，滋养细胞孵育45分钟，5-10μM的（和-6） -羧基-2'，7'-二氯二乙酸酯（羧基H2DCFDA）来检测活性氧的总量产生8。该行缺氧/复氧绒毛滋养细胞有显著相比增加那些在常氧ROS水平（54％）。这一增长是由1毫米褪黑激素治疗后逆转。此外，常氧褪黑素下未调制ROS水平（体内平衡），这是类似于未处理的绒毛滋养细胞（ 图5A）。 图4和图5A显示，在常氧褪黑素并不改变氧化应激或β-hCG的分泌水平在滋养层细胞，这证实了先前的研究表明在正常情况下，28,29无细胞稳态的调节。
图 1： 消解管离心后，形成4层。上层是由消解液;正下方，在胎牛血清（FBS）。两个层应用真空泵被丢弃。较低层ARÈ如下组成：含有成纤维细胞，白细胞，巨噬细胞和滋养细胞白色层;和红细胞组成的底层。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：缺氧商会和溶解氧浓度的测量/计算的成分 （A），低氧室和气瓶大会：（1）气瓶; （2）燃气调压器; （3）煤气软管夹; （4）气缸输气软管; （5）进口过滤器; （6）进水管; （7）流量计; （8）出口软管; （9）模块化培养箱室中。用已知的氧浓度所产生的标准曲线在细胞培养基中实际的氧浓度的（B）的计算。 （C和D）在解决方案的“0％O 2”和“21％的O 2”获得的相对值，以图形绘制成线性函数来确定在细胞培养液中的氧气浓度“？％O 2”， 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。
图 3： 在模块化培育室常氧细胞培养的通用实验设计 （8％O 2; 5％CO 2，87％N 2）和缺氧/复氧（H / R）（0.5％O 2，5％的CO 2; 94.5％ 的 N 2）是用于研究在绒毛细胞滋养层（vCTB）和合体（STB）细胞病理条件的条件。具有或不具有褪黑激素，每24小时，培养基（1毫摩尔）被改变和气体混合物被更新。在H / R，STB细胞发生缺氧（0.5％O 2）4小时，然后返回到常氧（8％O 2）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 绒毛滋养层分化过程中的β-人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）的分泌褪黑激素的影响绒毛细胞滋养层细胞的分离和人类健康足月胎盘纯化。细胞处理96小时用1mM褪黑素或二甲基亚砜（DMSO 0.1％：赋形剂对照）含氧量正常条件下（8％O 2; 5％CO 2; 87％N 2）。 β-HCG在培养基水平由酶联免疫吸附测定（ELISA）后24，48，72和96小时ö测定˚F主要文化。水平正常化，从每个相应的井全细胞裂解液中的蛋白质含量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5： 脑白金在合体滋养低氧/复氧 （A）褪黑素（M 1毫米）的作用的抗氧化作用的滋养细胞对细胞内活性氧（ROS）的水平下，常氧（N）或缺氧/复氧（HR），在培养72小时诱导的，用5-（和-6）评估羧基-2'，7'-二氯二乙酸酯（羧基H2DCFDA）荧光。结果表示为平均值±3种不同的胎盘的SD; *** p <0.001（Lanoix， 等。 8）。（B）参与褪黑激素对缺氧/复氧诱导的细胞凋亡假定保护细胞的途径。主要绒毛细胞滋养层细胞培养在常氧72小时（8％O 2）允许分化成合体。细胞暴露于褪黑激素或溶媒对照为1mM，然后进行低氧（0.5％O 2）为4小时，随后在18小时再氧合期间（8％O 2）。缺氧/复氧诱导的氧化应激激活氧化还原敏感的转录因子如核因子κB（NF-κB）和缺氧诱导因子1（HIF-1）。 NF-kB诱导p53-，这将触发线粒体凋亡的涉及切割和胱天蛋白酶9和3胱天蛋白酶3的激活Bax蛋白/ Bcl-2的通路激活Rho相关，卷曲含线圈蛋白激酶1（ROCK-1），则聚裂解（ADP-核糖）聚合酶（PARP）和DNA修复的损伤。褪黑激素预防通过作为一个强大的抗氧化剂，以减少因缺氧/复氧的氧化应激线粒体中诱导细胞凋亡。这个数字已经从Lanoix 等修改，2013 8。 请点击此处查看本图的放大版本。
| 消化1 | 消化2 | 3消化 | 4消化 | |
| 改性的HBSS（毫升） | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNA酶（微升） | 300 | 200 | 150 | 150 |
| （0.1毫克/微升） | ||||
| 用MgSO 4（微升） | 150 | 100 | 75 | 75 |
| （800毫米） | ||||
| 氯化钙 （微升） | 150 | 100 | 75 | 75 |
| （100毫米） | ||||
| 胰蛋白酶（U） | 1824000 | 1200000 | 960000 | 960000 |
| P / S（毫升） | 1 | 0 | 0 | 0 |
表1：配料为消解液青霉素和链霉素（P / S） 的数量。硫酸镁（MgSO 4上）;氯化钙（氯化钙<子> 2）;脱氧核糖核酸酶IV（DNA酶IV）。
表2：密度梯度离心媒体解决方案的卷和改良HBSS所需的梯度溶液的制备。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在哺乳动物中，胎儿发育是直接依赖于足够胎盘功能。健康障碍的发展起源是基于的以后的生活中表现的疾病的病因可追溯到早期的发展，而且胎盘在胎儿编程30-32一种机械作用的假说。胎盘是胎儿生长发育的关键调解人：它调节养分转移，防止有害的曝光，并具有重要的内分泌功能。可重复的方法来隔离可行的主要滋养由Kliman 等的发展。在正常和异常胎盘功能6研究的一个里程碑。许多研究者已经适应这种技术来重现具体情况在体外 ，了解胎盘生理18,20,33,34。如由佩特罗夫等人所描述的 ，许多步骤是重要的，以保证隔离CYTO的纯化和健壮产量滋养层细胞18。例如，在消化步骤都发生由于技术在1988年，开发一些修改，如消化，的增加的数量和长度，以及消化酶的组成和数量，导致有活力的分离滋养层细胞的更大数目18。此目前的协议具有三个主要优点：冷冻保存，其允许的可能性继续协议后免疫纯化，这增加了细胞滋养细胞纯度及使用预涂微孔板改善细胞附着7,34-36。现有的文献包含用于细胞滋养层细胞的分离技术的多样的修改的几个例子，但密度离心介质的特性却几乎未修饰37。隔离/免疫纯化的呈现技术有几个关键步骤。因此，为了评估纯度是很重要的在每个免疫纯化的端部的绒毛细胞滋养层细胞。细胞角蛋白-7（滋养细胞标志物），分化45（CD45）和波形的集群（非滋养细胞标记）18,38,39：这可以通过流式细胞仪使用适当的抗体作为标记来完成。其它重要方面是所获得的胎盘的质量，FBS和密度离心媒体梯度，以及离心速度，这都可以影响细胞20,40的产量和质量。
尽管广泛使用，本技术具有不可避免的限制。首先，免疫纯化后获得存活细胞滋养层细胞的量是比较低的，并且在可测试可能条件/治疗的数量的主要限制因素。其次，主滋养细胞的寿命很短， 在体外分化为合体紧随其后的是减少细胞viabili的 TY并增加细胞凋亡。滋养层细胞活力的短长度不在体外增殖，限制了较长期治疗的评估，因为细胞凋亡后约4天培养7.41的不可逆触发。第三，interplacental变性大，因此需要相对大量胎盘获得统计学上可解释的结果。另一方面，主滋养培养具有独特的优势，如细胞的能力，以分化成合胞体，其允许在根据分化的不同阶段不同的细胞表型的条件和治疗方法的研究。在这个协议中提出的氧合方法是适应性强，其配置可为其他情况下，如从早孕主滋养层细胞，这应暴露于低氧分压为常氧9,42,43的培养量身定做。
ntent“>还有其他的方法来研究在体外人胎盘功能。管理单元冷冻胎盘组织允许多组学分析，但需要的胎盘多点取样，以避免由于氧梯度例如代谢变化，这从中央减小绒毛的周边44，但是，活滋养细胞生物学和行为不能使用这种方法45进行研究。绒毛状植有与组分的细胞类型和它们的通信保持整个绒毛结构的优势，但对治疗的响应不特定于滋养层细胞23。市售滋养样绒毛膜癌的细胞系，如BEWO，JEG-3和JAR可用于研究的胎盘功能，例如融合，分化和胎盘运输。然而，最近的研究表明，在主基因的表达滋养细胞和BEWO肿瘤细胞相关性很差46-48：THUS，初级绒毛滋养细胞培养，尽管它的局限性，具有模仿正常或不正常胎盘的体内环境的独特优势。原代培养和绒毛植使用绒毛滋养细胞的研究表明，缺氧和缺氧/复氧系统减少滋养层细胞活力，伴随着增加氧化应激，炎症反应，细胞自噬和凋亡43,49-52水平。这种缺氧/复氧细胞培养模型，特别是使我们能够证明绒毛滋养细胞褪黑激素的抗氧化和抗凋亡作用。在暴露于缺氧/复氧原绒毛滋养细胞，褪黑激素可以防止如下：感应氧化应激，降低的抗氧化酶活性，氧化还原敏感性信号传导途径的增加的活性和线粒体凋亡的诱导（ 图5B）8。海兰poxia /复模型是确定在氧化应激诱导的损伤和在妊娠并发症如子痫前期，其中胎盘褪黑素合成降低53及其可能的保护作用的褪黑激素的预防性作用的独特工具。褪黑激素是一种强大的抗氧化剂具有广泛的目标54。此外，褪黑激素作为一种治疗的安全性已基本确立。与褪黑激素的有益结果已被再现的若干研究人员和褪黑激素是目前在临床试验中由先兆子痫或胎儿宫内生长受限55,56复杂怀孕一个潜在的预防或治疗性治疗。
总之，分离，纯化和高质量的细胞滋养层细胞原代培养，缺氧的技术一起/复氧使广泛的有前途的实验方法，以更好地了解与氧化妊娠并发症压力，改善胎盘的健康。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E.
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L.
- Barker, D. J.
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J.
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
