Introduction
Gedurende de zwangerschap, de placenta cytotrofoblastcellen, die mononucleaire stamcellen zijn, zich snel vermenigvuldigen en differentiëren in ofwel villous of extravilleuze cytotrofoblastcellen. Extravilleuze cytotrofoblasten binnen te vallen en de vorm van de spiraal arteriën van de baarmoederwand. Villous cytotrofoblasten, anderzijds blijven prolifereren, differentiëren en zekering multinucleated syncytiotrofoblast (de syncytium) 1 vormen. Het onderhoud van villi trofoblast homeostase is essentieel voor foetale welzijn en gezonde zwangerschap. In feite, villous trofoblasten mogelijk maternale-foetale uitwisseling van zuurstof en voedingsstoffen en hormonen produceren essentieel voor de zwangerschap. Bovendien is het syncytiotrofoblast het enige celtype in direct contact met de maternale bloedsomloop en een essentiële fysische en immunologische barrière. Daarom moet de syncytiotrofoblast apoptose en vervanging ondergaan homeostatische onderhoud en AVOid placenta pathologie 2-5.
De door Kliman et al. 6 ontwikkeld in 1986 tot primaire villous cytotrofoblasten isoleren van menselijke placenta's techniek zorgde voor een revolutie in de placenta onderzoek doordat de studie van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij villous trofoblast differentiatie. Deze klassieke techniek, waarbij in de enzymatische digesties met trypsine en DNase, gevolgd door isolatie van dichtheidscentrifugatie media (colloïdale silicadeeltjes bekleed met polyvinylpyrrolidon of Percoll) wordt nu erkend als de gouden standaard voor het isoleren villeus cytotrofoblastcellen. De techniek kan worden geoptimaliseerd door magnetische immunozuivering, een procedure die villous cytotrofoblasten scheidt van niet-trofoblastcellen gebaseerd op de differentiële expressie van specifieke antigenen op het oppervlak van deze cellen. We kozen voor het menselijke leukocyt antigen ABC (HLA-ABC) vanwege de afwezigheid van de expressie op het trofoblastische cel membraame 7,8.
De placenta is een orgaan dat dramatische verschillen in zuurstofgehalte ondergaat tijdens de zwangerschap. In het eerste trimester is de oxygenatie verhouding fysiologisch zeer laag (2% O 2) maar neemt milde niveaus van oxygenatie (8% O 2) in het tweede en derde trimester. Tuuli et al. 9 beschreven dat het in vitro reproduceren van de trofoblast omgeving in de placenta villi is een uitdaging en variaties oxygenatie niveau kan zelfs leiden tot fenotypische veranderingen. Het is daarom voorgesteld 8% zuurstof vast die normoxia de zuurstofspanning in placenta villi in het derde trimester van de zwangerschap 8,9 nabootsen. Chen et al. 10 uitgebreid bestudeerd verscheidene variabelen in verband met zuurstofspanning in trofoblast celkweek en toonde het belang van het bepalen van het zuurstofgehalte in een pericellulaire omgeving. De niveaus van zuurstof in de villi neiging te stijgendoor vasculogenese. De bloedstroom in placenta villi voortdurend toeneemt en het niveau van waterstofperoxide (een overvloedige reactieve zuurstofspecies) een belangrijk signaal dat vasculogenese 11,12 regelt. In de zwangerschap complicaties, een gebrek aan vasculogenese genereert hypoxie, en nog belangrijker, intermitterende variaties van oxygenatie (genaamd hypoxie / reoxygenatie). Deze omstandigheden leiden tot een abnormale verhoging van de oxidatieve stress, die de placenta en de levensvatbaarheid van de foetus 13,14 compromissen. De veranderingen die trofoblast cellen ondergaan in vivo tijdens episodes van hypoxie / reoxygenation kan worden nagebootst in vitro als volgt: villous cytotrofoblasten onder normoxische omstandigheden (8% O 2) totdat ze differentiëren tot syncytiotrofoblast worden gehandhaafd. Zij worden vervolgens onderworpen aan hypoxische omstandigheden (0,5% O2) gedurende 4 uur, gevolgd door nog 18 h normoxia (reoxygenatie). Met behulp van deze hypoxie / reoxygenation benadering, trofoblasten exHiBit gedereguleerd redox status en verhoogde intrinsieke apoptose 8, zoals in sommige zwangerschap complicaties waargenomen. Daarom is het zinvol om in vitro model om nieuwe preventieve en therapeutische mogelijkheden te evalueren bestrijding zwangerschap complicaties van placenta hypoxie / reoxygenatie.
Placenta cellen produceren melatonine, dat een aantal belangrijke functies, zoals het vermogen om oxidatieve stress en placentale dysfunctie 15 overbodig is. Hier presenteren we de experimentele aanpak en mobiele modellen die worden gebruikt om de beschermende effecten van melatonine in de placenta trofoblast cellen vertonen op moleculair, cellulair en functioneel niveau 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Placenta's werden verkregen direct na spontane vaginale leveringen van ongecompliceerde zwangerschap met de CHUM-St-Luc ziekenhuis, Montreal, QC, Canada, met geïnformeerde toestemming van de patiënt en de goedkeuring van de ethische commissies (CHUM-St-Luc Ziekenhuis en INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, QC, Canada).
1. Isolatie en zuivering van Villous cytotrofoblastcellen
- Oplossingen en media
- Bereid transportmiddelen aanvulling Dulbecco's gemodificeerd Eagle's Medium hoog glucosegehalte (DMEM-HG) met 1% vol / vol antibiotica (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid primaire kweekmedium door DMEM-HG vullen met 10% v / v foetaal runderserum (FBS), 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 1% vol / vol antibiotica (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) en bewaar bij 4 ° C. Warm media tot 37 ° C vóórgebruiken.
- Bereid 4 L zoutoplossing (0,9% gew / vol natriumchloride).
- Bereid gemodificeerde Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) door toevoeging van 25 mM HEPES tot 1x HBSS (pH 7,4).
- Vers bereid, vier flessen ontsluitingsoplossing met gemodificeerde HBSS (bereid in 1.1.4), magnesiumsulfaat (MgSO4), calciumchloride (CaCl2), trypsine, desoxyribonuclease IV (DNase IV), en 1% vol / vol antibioticum ( 10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat) zoals getoond in tabel 1.
- Bereid dichtheid centrifugeren media gradiënt
- Bereid dichtheid centrifugeren media-oplossing aan te vullen dichtheid centrifugeren media met 10% vol / vol HBSS 10x.
- Bereid 14 testbuizen met dichtheidscentrifugatie mediaoplossing gewijzigde HBSS, zoals aangegeven in tabel 2.
- Meng elke density oplossing (stap 1.1.6.2) krachtig voor de inhoud toe te voegen aan het verloop. Voorzichtigvoeg de dichtheid oplossingen een 50 ml glazen centrifugebuis met een peristaltische pomp (1 ml / min), beginnend met de hoogste concentratie (70%). Vermijd druppeltjes door het laten uitlekken van de oplossingen tegen de buiswand op de juiste scheiding van elke laag van de helling te handhaven.
- Bij afwezigheid van een peristaltische pomp, de lagen aan te brengen heel voorzichtig met Pasteurpipetten.
- Bereid definitieve loopbuffer door daaraan loopbuffer (zie tabel of Materials) met 2% vol / vol antibioticum / antimycoticum (10.000 eenheden / ml penicilline G, 100 mg / ml streptomycine sulfaat). Bewaren bij 4 ° C.
- Villous cytotrofoblast isolatie
Opmerking: Gebruik steriele chirurgische apparatuur, glaswerk, pipetten, flesjes, enz.- Op de dag van villi cytotrofoblast isolatie, in een 37 ° C waterbad, warm de spijsvertering oplossingen (uit stap 1.1.5) en 70 ml FBS. Opmerking: Gebruik 50 ml FBS aan de vertering en onderbrekenresterende 20 ml voor het invriezen stap (1.2.22) die op ijs worden gebracht als ontdooid.
- Na de bevalling, breng de placenta naar het laboratorium in ijskoude transportmedium (uit stap 1.1.1) zo snel mogelijk (minder dan 1 uur).
- Teruggooi transportmedium en de placenta bloed in vloeibare vuilnisbak. Weeg de placenta en onder te dompelen in koude zoutoplossing.
- Meet en de volgende functies te analyseren: navelstreng lengte; navelstreng lokalisatie; placenta lengte, breedte, vorm (ovaal, discoïde); membraan kleur; zaadlob structuur pathologieën. Opmerking: De gegevens worden in de resultaten sectie.
- Snijd de navelstreng, naast haar placenta inbrengen (dat wil zeggen, aan de basis van een extra 1 cm straal cirkel rond het snoer). Dompelen in 300 ml histologische fixerende oplossing (formaline 10%) voor latere histologische analyse.
- Snijd de hele placenta in blokjes van 5 x 5 x 5 cm. Grondig wassen (4 x x ~ 1 min) in zoutoplossing solution (0,9%) bloedcellen te verwijderen totdat zoutoplossing duidelijk. Gooi spoelvloeistof.
- In een horlogeglas, verwijder de placenta membranen en gehakt weefsels aan de bloedvaten en verkalkingen te verwijderen. Houd bloedvaten stevig vast met een tang en verwijder weefsels met behulp van de achterkant van Metzenbaum schaar.
- Plaats gehakt placenta in een Büchner trechter. Spoelen met ongeveer 100 ml van een zoutoplossing buffer. Blijven hakken tot 30-35 gram gehakt weefsel wordt verkregen (gebruik plastic wegen boot en schaal). Indien nodig, gehakt de rest van de placenta te verkrijgen tot drie extra 30-35 g preparaten. Gedurende deze tijd, zet gehakt weefsel in een weegschuitje op ijs.
Opmerking: Deze stap zal ongeveer 45 minuten duren 1 uur.
- Plaats gehakt placenta in een Büchner trechter. Spoelen met ongeveer 100 ml van een zoutoplossing buffer. Blijven hakken tot 30-35 gram gehakt weefsel wordt verkregen (gebruik plastic wegen boot en schaal). Indien nodig, gehakt de rest van de placenta te verkrijgen tot drie extra 30-35 g preparaten. Gedurende deze tijd, zet gehakt weefsel in een weegschuitje op ijs.
- Voeg de 30 - 35 g gehakt placenta weefsel om een trypsinizing kolf. Overdracht 150 ml van de bereide ontsluitingsoplossing 1 (tabel 1) bij de trypsinizing kolf en meng.
- Plaats de kolf in trypsinizingeen schuddend waterbad gedurende 30 minuten bij een snelheid van niet meer dan 50 cycli / min en handmatig trypsinizing kolf zachtjes elke 5 min gedurende homogene spijsvertering.
- Aan het einde van de eerste digestie verwijdert de trypsinizing kolf uit het waterbad en kantelen (45 °) gedurende 1 min naar het placentaweefsel sedimenteren. Met een 10 ml steriele pipet, te verwijderen en gooi ongeveer 80 ml van de bovenstaande. Vermijd het opzuigen van het weefsel.
- Breng 100 ml ontsluitingsoplossing 2 (tabel 1) bij de trypsinizing kolf; meng goed en herhaal stap 1.2.9.
- Aan het einde van de tweede spijsvertering, verwijder de trypsinizing kolf uit het waterbad en kantelen 45 ° gedurende 1 minuut. Met een 10 ml steriele pipet Verwijder 80 ml supernatant en voorzichtig overbrengen naar een centrifugebuis met een cel zeef (100 um mesh). Breng de bovenstaande vloeistof gefiltreerd met een bekerglas met 2 ml FBS telkens de centrifugebuis vol.
- Voer de derde digestie zoals beschreven voor detweede spijsvertering (1.2.11 en 1.2.12) met behulp van 75 ml spijsvertering oplossing 3. Tegelijkertijd voeren stappen 1.2.15 om 1.2.16.1 voor de spijsvertering 2.
- Voer de vierde digestie precies zoals de derde digestie met de verteringsoplossing 4 (75 ml), maar laat een maximale hoeveelheid supernatant. Voer stap 1.2.15 om 1.2.16.1 in parallel voor de spijsvertering 3, en ten slotte voor de spijsvertering 4.
- Aliquot de supernatant (van digesties 2, 3 en 4) in 13,5 ml delen, elk in een 15 ml centrifugebuis. Met een 22,8 cm lange glazen Pasteur pipet zachtjes en langzaam plaats 1,5 ml FBS onder aan elke buis om een afzonderlijke laag. Meng geen FBS en supernatant. Centrifugeer de buizen zonder rem gedurende 20 minuten bij 1250 xg bij kamertemperatuur.
Opmerking: Na centrifugeren 4 lagen zijn zichtbaar in de buis, zoals weergegeven in figuur 1 De scheiding van trypsine en trofoblast cellen voorkomt overmatige cellulaire spijsvertering.. - Met een vacuümpomp, Aspiraten en gooi het supernatant (spijsvertering oplossing) en FBS lagen, met inbegrip van de witachtige film tussen de twee lagen. Resuspendeer de pellet (de trofoblasten en rode bloedcel lagen) met 1 ml warm celkweekmedium (stap 1.1.2, zonder FBS en zonder HEPES).
- Verzamel geresuspendeerde cellen van alle buizen en combineren in 1 tube. Laat de buis bij kamertemperatuur staan tot het einde van alle ontsluitingen. Let op: Na alle ontsluitingen, de gebruikelijke opbrengst is 3 tubes van geresuspendeerde cellen (één per spijsvertering).
- Make-up het volume op 15 ml met warme celkweekmedium. Centrifugeer bij 1250 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met een vacuümpomp. Vermijd opzuigen de pellet.
- Voorzichtig resuspendeer de pellet verkregen uit de 3 buizen met 1 ml warm celcultuurmedium. de inhoud in 1 tube zwembad. Om 8 ml te verkrijgen, vul het volume met warme celkweekmedium.
- Heel voorzichtig laag de celsuspensie op een scheiding gradseerde met een Pasteur pipet. Centrifugeren zonder rem gedurende 30 min bij 507 xg bij kamertemperatuur.
- Na centrifugeren identificeren van de verschillende lagen van cellen in het verloop met achtergrondverlichting. Zoek de lagen die trofoblast en contaminerende cellen tussen 40 - 50% van dichtheidscentrifugatie medium. Met een vacuümpomp verwijdert de bovenste lagen (> 50%).
- Verzamel cellen die zich in de lagen van belang met een Pasteur pipet en overbrengen naar een 50 ml centrifugebuis. Vul met water aan tot 50 ml met celkweekmedium. Centrifugeer 10 minuten bij 1250 xg bij kamertemperatuur.
- Onder steriele omstandigheden, gooi het supernatant, resuspendeer de pellet met 20 ml FBS en tel het aantal cellen met een hemocytometer. Op ijs, voeg 2,22 ml steriele dimethylsulfoxide (DMSO) en meng door omkeren. Aliquot 1,5 ml celsuspensie in cryogene flesjes, invriezen overnacht bij -80 ° C en overbrengen in een vloeibare stikstof tank.
<li> Trofoblast zuivering - Installeer de spoelen en actief buffers en een nieuw filter kolom aan de magnetische zuivering instrument volgens de instructies van de fabrikant. Voer de "schone programma" negatieve 1, positieve 1 en positieve 2 poorten schoon te maken, en vervolgens de invoering van de 50 ml buizen onder elke haven volgens instructies van de fabrikant.
- Ontdooi de cellen die werden bevroren in stap 1.2.22 snel in een 37 ° C waterbad. Overdracht cellen om een 50 ml buis en resuspendeer cellen zachtjes met 20 ml koud bufferoplossing. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C.
- Verwijder het supernatant. Herhaal de wasstap met koud stromend buffer. Aantal cellen met een hemocytometer levensvatbaarheid te bepalen. Centrifugeer nogmaals (gedurende 5 min, 450 x g bij 4 ° C). Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Voeg 1 ml koude loopbuffer die 1% vol / vol muizen anti-HLA-ABC-antilichamen. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min, mixing zachtjes elke 5 min.
- Voeg 6 ml koud stromend buffer. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en herhaal deze stap. Resuspendeer cellen in 1 ml koude loopbuffer die 10% vol / vol anti-muis secundair antilichaam gekoppelde magnetische korrels. Incubeer bij 4 ° C gedurende 15 minuten, voorzichtig mengen om de 5 min.
- Voeg 6 ml koud stromend buffer. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 5 ml koud stromend buffer.
- Scheid de trofoblast cellen met de magnetische zuivering instrument. Verzamel cellen op het negatieve haven en voeg 20 ml koud stromend buffer.
Opmerking: trofoblast cellen niet bevatten complexe HLA-ABC en worden dus gescheiden van andere celtypen en gericht naar de negatieve 1 poort. - Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 20 ml warme primaire kweekmedium. Tel de cellen usinga hemocytometer om de levensvatbaarheid te bepalen.
- Plaat de cellen op de volgende dichtheden: 0,15 x 10 6 cellen / putje in 96-putjesplaten, 1,6 x 10 6 cellen / putje in 24-putjesplaten en 4,5 x 10 6 cellen / putje in 6-well platen. Incubeer de platen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Bevestigt de zuiverheid van de trofoblast cellen door flowcytometrie 16,17 en / of 18 immunocytochemie.
Opmerking: De zuiverheid van het immuungezuiverd cellen werd bepaald met FITC-geconjugeerde monoklonale antilichamen tegen cytokeratine-7 en vimentine 17-19. Dit protocol is goed gedetailleerd in Lanoix et al., 2008 7. - Na minimaal 4 uur Spoel de cellen tweemaal met warm kweekmedium losse cellen te verwijderen en vervolgens de platen dragen aan de normoxia kamer, die is samengesteld uit 8% O 2 (zie figuur 2 en paragraaf 2).
2. In vitro Induction van normoxia en hypoxie / reoxygenation
- Incubator kamer operatie (zie figuur 2A voor de set-up).
- In een laminaire stroming kap, plaats een petrischaal met steriel water op de bodem van de kamer incubator tot droog voorkomen; plaats de eerder bereide cel kweekplaten of flessen (stap 1.3.10) op de superieure schappen van de kamer.
- Buiten de kap, sluit de kamer (inlaatpoort) aan de gasslang (Figuur 2A: 5a, b en c) de buis gas (8% O 2 of 0,5% O 2) te bereiken (Figuur 2A: 7). Open beide inlaat en uitlaat poorten van de kamer. Op dit moment, het gas regulator (Figuur 2A: 4) moet gesloten blijven.
- Open voorzichtig de gas-regelklep (Figuur 2A: 4). Flush 4 min onder een luchtstroom van 25 l / min tot volledig vervangen van de lucht in de kamer.
- Na het spoelen van de kamer, sluit het gas regulator dan de inlaat en outlet havens van de kamer.
- Koppel de debietmeter afvoerslang (Figuur 2A: 5c) vanaf de inlaatpoort van de kamer en plaats de kamer in een cel incubator bij 37 ° C.
- Vervang het moment aanwezig in de platen, kolven en opgelost in het kweekmedium door het vullen van de kamer met gas 1 uur na stap 2.1.3.
- Herhaal de stappen 2.1.1 tot 2.1.6 voor de andere composities gas (bv, 2% O 2 voor de eerste trimester trofoblast cultuur 9).
- Bevestig het zuurstofpercentage (Figuur 2B-C)
- De concentratie van zuurstof in de celkweek medium (zonder cellen) binnen de kamer te bevestigen, gebruikt een zuurstof elektrode verbonden met een zuurstof adapter. Sluit de zuurstof elektrode naar een voltmeter.
- Een kalibratiekromme in dezelfde oplossing (bijv celkweekmedium) Door de oplossing bloot gassen met bekende zuurstofgehaltes (bijvoorbeeld 0% en21% zuurstof). Nadat de metingen zijn gestabiliseerd voor elke concentratie, dient de elektrode in het medium in de kamer.
Opmerking: Neem alle metingen op dezelfde diepte om eventuele bias in zuurstofconcentratie 10 voorkomen.
- Inductie van normoxia en hypoxie / reoxygenatie in trophoblasts.
- Na toevoeging primaire trofoblast cellen de juiste celkweek flessen, platen of petrischaaltjes, voeren behandelingen nodig.
- Tegelijkertijd binnen de kamer, bloot cellen het gewenste gasmengsel te reproduceren een specifieke voorwaarde elke 24 uur (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolatie en immunozuivering van villous cytotrofoblastcellen van een normale term placenta verkregen door vaginale bevalling leverde 1 x 10 8 levensvatbare cellen. De placenta woog 350 g, was 19 cm in diameter 4 cm hoog met schijfvormige vorm en transparant membranen. Geen zaadlob misvorming werd gedetecteerd. De navelstreng had paracentrale lokalisatie en een lengte van 56 cm. De zuiverheid werd beoordeeld door flowcytometrie behulp vimentine en cytokeratine 7-merkers. Meer dan 98% van de cellen waren negatief voor vimentine en positief voor cytokeratine-7 bevestigt de zuiverheid van villi trofoblasten cellen verkregen uit de immunozuivering. Villous cytotrofoblastcellen waren onder normoxische omstandigheden in aanwezigheid of afwezigheid van 1 mM melatonine 96 putjes toegevoegd. De biochemische differentiatie van villi cytotrofoblasten werd gevolgd door het bepalen van niveaus van β-humaan choriongonadotrofine (β-hCG) secretie alseerder 1,7,20,21 beschreven. De morfologische differentiatie en apoptose werden door immunofluorescentie met behulp van anti-desmoplakine en-anti-caspase gekliefd cytokeratine 18 intermediaire filamenten 7,22. Celkweekmedia vanaf dag 1 (voornamelijk villi cytotrofoblasten) tot dag 4 (voornamelijk syncytiotrofoblasten) werden verzameld, gecentrifugeerd en β-hCG-niveaus werden gemeten in de supernatanten. Productie van β-hCG, dat exclusief voor het syncytiotrophoblast, vermeerderd met kweektijd (Figuur 4). Niet alleen hypoxie / reoxygenatie, maar hyperoxia (> 20% O 2) ze geactiveerd apoptose 23. Aldus goedkeuring van een 8% O2 concentratie representatief voor de hoeveelheid zuurstof die een villous trofoblast cellen worden blootgesteld tijdens het derde trimester van de zwangerschap 10. De piek van β-hCG concentraties waargenomen 72 uur bevestigde het vermogen van villi cytotrofoblasten differentiëren onder deze omstandigheden.Melatonine nam niet weg β-hCG secretie onder deze studie omstandigheden. De afname van β-hCG niveaus 96 u werd waarschijnlijk veroorzaakt door apoptose van trofoblast cellen, die toeneemt na een langere periode in primaire kweek 5,7,22,24,25 (figuur 4). DMSO (0,1% vol / vol) werd geselecteerd omdat ze geen invloed had β-hCG niveaus 26,27. De beschermende rol van melatonine is sterk gerelateerd aan zijn antioxiderende eigenschappen. Hypoxie / reoxygenatie na 72h van de cultuur oxidatieve stress in villous trofoblast cellen. Het beschermende effect van melatonine werd gemeten met reactive oxygen species (ROS) detectiereagens (Figuur 5A). Na 96 uur kweken werden trofoblastcellen gedurende 45 min met 10 uM 5- (en-6) -carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (carboxy-H2DCFDA) detecteren de totale hoeveelheid geproduceerde ROS 8. Villous trofoblast cellen die hypoxie / reoxygenation ondergingen haddenaanzienlijk verhoogde ROS levels (54%) in vergelijking met die onder normoxia. Deze stijging werd omgekeerd door behandeling met 1 mM melatonine. Bovendien, onder normoxie melatonine niet moduleren ROS levels (homeostase), die vergelijkbaar zijn met onbehandelde villous trofoblast cellen (Figuur 5A) is. Figuur 4 en 5A tonen dat onder normoxie melatonine niet niveaus van oxidatieve stress of β-hCG secretie veranderen in de trofoblast cellen die bevestigt eerdere onderzoeken blijkt er geen modulatie van celhomeostase onder normale omstandigheden 28,29.
Figuur 1:. Destructiebuis Na centrifugatie 4 lagen gevormd. De bovenste laag bestaat uit ontsluitingsoplossing; net onder het foetaal runderserum (FBS). Beide lagen moeten worden verwijderd met een vacuümpomp. De onderste lagen are samengesteld als volgt: een witte laag met fibroblasten, leukocyten, macrofagen en trofoblasten; en een onderste laag bestaat uit rode bloedcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 2: Onderdelen van de Hypoxie Kamer en waardering / Berekening van de concentratie van opgeloste zuurstof (A) Hypoxie kamer en gasfles montage: (1) Gas cilinder; (2) Gas regelgever; (3) klem Gas slang; (4) Cilinder gasslang; (5) Inlaat filter; (6) Inlet slang; (7) Flow meter; (8) Outlet slang; (9) Modulaire incubator ruimte. (B) berekening van de actuele zuurstofconcentratie in celkweek medium met behulp van een standaard curve geproduceerd met bekende zuurstofconcentraties. (C en D)De relatieve waarden verkregen in de oplossingen "0% O 2" en "21% O 2", worden grafisch uitgezet als een lineaire functie van de zuurstofconcentratie in het celkweekmedium bepalen "?% O 2". Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3:. Algemeen Experimenteel ontwerp van celcultuur in de modulaire incubatiekamer normoxia (8% O2; 5% CO2, 87% N2) en hypoxie / reoxygenatie (H / R) (0,5% O2, 5% CO 2; 94,5% N 2) zijn voorwaarden gebruikt pathologie villi cytotrofoblast (VCTB) en syncytiotrophoblast (STB) cellen te bestuderen. Elke 24 uur, medium met of zonder melatonine (1 mM) wordt gewijzigden het gasmengsel wordt vernieuwd. Onder H / R, STB cellen ondergaan hypoxie (0,5% O 2) voor 4 uur en vervolgens terug te keren naar normoxia (8% O 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Effect van melatonine op bèta-humane chorion gonadotropine (β-hCG) Secretie tijdens Villous trofoblast differentiatie Villous cytotrofoblastcellen werden geïsoleerd en gezuiverd uit humane gezonde term placenta. Cellen werden behandeld gedurende 96 uur met 1 mM melatonine of dimethylsulfoxide (DMSO 0,1%: dragercontrole) onder normoxische omstandigheden (8% O2; 5% CO2, 87% N2). β-hCG niveaus in cultuurmedium werden gemeten met aan enzym gebonden immunosorbent assay (ELISA) na 24, 48, 72 en 96 uur of primaire kweek. Niveaus werden genormaliseerd om het eiwitgehalte van de hele cellysaat van elk putje overeenkomt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Anti-oxidant effect van melatonine bij syncytiotrofoblast blootgesteld aan hypoxie / reoxygenation (A) Het effect van melatonine (M, 1 mM) op intracellulaire reactive oxygen species (ROS) niveaus syncytiotrophoblast cellen onder normoxia (N) of hypoxie / reoxygenatie (HR), geïnduceerd na 72 uur kweken werd beoordeeld door 5- (en-6) -carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (carboxy-H2DCFDA) fluorescentie. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van 3 verschillende placenta; *** P <0,001 (Lanoix, et al. 8). (B) De cellulaire routes betrokken bij de vermeende bescherming van melatonine tegen hypoxie /-reoxygenatie geïnduceerde apoptose. Primaire villous cytotrofoblastcellen werden gedurende 72 uur onder normoxia (8% O 2) tot differentiatie tot syncytiotrofoblast mogelijk. Cellen werden blootgesteld aan 1 mM van melatonine of het voertuig en vervolgens onderworpen aan hypoxie (0,5% O2) gedurende 4 uur, gevolgd door een 18 uur periode reoxygenation (8% O 2). Hypoxie / reoxygenation-geïnduceerde oxidatieve stress activeert redox gevoelige transcriptiefactoren zoals nucleaire factor kappa B (NF-KB) en hypoxia induceerbare factor 1 (HIF-1). NF-KB induceert p53, die de Bax / Bcl-2 route van mitochondriale apoptose waarbij splitsing en activatie van caspases 9 en 3 Caspase 3 triggers activeert Rho-geassocieerde, coiled-coil bevattende eiwit kinase 1 (ROCK-1), de splitsing van poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) en de bijzondere waardevermindering van DNA-herstel. melatonine prevents de inductie van mitochondriale apoptose door als krachtige antioxidant aan de oxidatieve stress veroorzaakt door hypoxie / reoxygenatie verminderen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Lanoix et al., 2013 8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| spijsvertering 1 | spijsvertering 2 | spijsvertering 3 | spijsvertering 4 | |
| Gemodificeerde HBSS (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAse (pl) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 mg /gl) | ||||
| MgSO 4 (pl) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mM) | ||||
| CaCl2 (pl) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Trypsine (U) | 1.824.000 | 1200000 | 960.000 | 960.000 |
| P / S (ml) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tabel 1: Hoeveelheden Ingrediënten voor de destructie-Solution Penicilline en streptomycine (P / S). magnesiumsulfaat (MgSO4); calciumchloride (CaCl <sub> 2); IV deoxyribonuclease (DNase IV).
Tabel 2: De volumes van dichtheidscentrifugatie Media Solution en Modified HBSS Vereiste voor de voorbereiding van de Gradient Solution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In zoogdieren, ontwikkeling van de foetus is direct afhankelijk van een adequate placenta-functie. De oorsprong van ontwikkeling stoornissen zijn gebaseerd op de hypothese dat de oorzaak van ziekten manifesteren op latere leeftijd naar vroege ontwikkeling en dat de placenta een mechanistische rol bij de foetale 30-32 kunnen worden getraceerd. De placenta is de sleutel mediator van de foetale groei en ontwikkeling: het reguleert nutriëntentransfers, beschermt tegen schadelijke blootstelling, en heeft grote endocriene functies. De ontwikkeling van Kliman et al. Een reproduceerbare techniek levensvatbare primaire cytotrofoblasten isoleren is een mijlpaal in de studie van normale en abnormale placenta functies 6. Veel onderzoekers hebben deze techniek aangepast aan de specifieke omstandigheden te reproduceren in vitro placenta fysiologie 18,20,33,34 begrijpen. Zoals beschreven door Petroff et al., Veel stappen zijn belangrijk voor een gezuiverd en robuuste opbrengst aan geïsoleerd cyto waarborgentrofoblastcellen 18. Zo hebben de vertering stappen diverse wijzigingen sinds de ontwikkeling van de techniek in 1988, ondergaan die een verhoogd aantal en lengte van de spijsvertering, en de samenstelling en hoeveelheid van verteringsenzymen, wat resulteert in grotere aantallen levensvatbare geïsoleerde cytotrofoblasten 18. Het huidige protocol heeft drie belangrijke voordelen: cryopreservatie, waardoor de mogelijkheid om de protocol later immunomagnetische zuivering, die cytotrofoblast zuiverheid en het gebruik van verder verhoogt pre-coated microplaten verbetering celhechting 7,34-36. De bestaande literatuur zijn verschillende voorbeelden van diverse modificaties van de isolatietechniek voor cytotrofoblastcellen, maar de kenmerken van de dichtheid centrifugatie media nagenoeg ongemodificeerd 37 bleef. De gepresenteerde techniek van isolatie / immunozuivering heeft een aantal kritische stappen. Daarom is het belangrijk om de zuiverheid te evaluerenvan de villi cytotrofoblastcellen aan het einde van elke immunozuivering. Dit kan door stroomcytometrie onder toepassing van geschikte antilichamen zoals markers: cytokeratine-7 (trophoblastic marker), CD-merker 45 (CD45) en vimentine (niet trofoblastcellen markers) 18,38,39. Andere kritische aspecten van de kwaliteit van de verkregen placenta, de FBS en dichtheid centrifugatie gradiënt media, en centrifugeersnelheid, waarbij alle opbrengst en kwaliteit van de cellen 20,40 beïnvloeden.
Hoewel wijd gebruikt, deze techniek heeft onvermijdelijk beperkingen. Enerzijds, de hoeveelheid levensvatbare cellen cytotrofoblasten verkregen na immunozuivering relatief laag en is de belangrijkste beperkende factor bij het aantal mogelijke voorwaarden / behandelingen die kunnen worden getest. Ten tweede is de levensduur van de primaire trofoblastcellen is kort en in vitro differentiatie in syncytiotrofoblast wordt op de voet gevolgd door een daling van de cel viabili ty en een toename van apoptose. De korte lengte van trofoblast cellevensvatbaarheid die niet prolifereren in vitro, beperkt de evaluatie van lange termijn behandelingen, omdat apoptose onomkeerbaar wordt geactiveerd na ongeveer 4 dagen kweek 7,41. Ten derde interplacental variabiliteit groot is, zodat een relatief groot aantal placenta nodig om statistisch interpreteerbare resultaten. Anderzijds, primaire trofoblast cultuur unieke voordelen, zoals het vermogen van de cellen om te differentiëren in syncytia, die het mogelijk maakt voor de studie van omstandigheden en behandelingen in verschillende cel fenotypes volgens de verschillende stadia van differentiatie. De oxygenatie werkwijze die in dit protocol is zeer flexibel en zijn configuratie kunnen worden aangepast voor andere situaties, zoals de kweek van primaire trofoblast cellen van eerste trimester zwangerschap, die moet worden blootgesteld aan een lagere zuurstofspanning voor normoxia 9,42,43.
ntent "> Er zijn andere manieren om menselijke placenta-functie in vitro te bestuderen. Snap-bevriezing placenta weefsels zorgt voor multi-omics analyses, maar vereist placenta multisite bemonstering, om te voorkomen dat bijvoorbeeld metabole veranderingen als gevolg van de zuurstof gradiënt, die afneemt van de centrale villi naar de periferie 44. echter levende trofoblast celbiologie en gedrag is echter niet onderzocht met deze benadering 45. villous explantaten hebben het voordeel van het handhaven van de gehele villous structuur met de samenstellende celtypes en de communicatie, maar reacties op behandelingen niet specifiek voor trofoblastcellen 23. Commercieel beschikbare trofoblast-achtige choriocarcinoom cellijnen, zoals BeWo, Jeg-3 en JAR kan worden gebruikt om placenta functies, zoals fusie, differentiatie en transplacentaire transport te bestuderen. uit recente studies tonen aan dat genexpressie in primaire cytotrofoblasten en BeWo tumorcellen worden slecht gecorreleerd 46-48. Thus, primaire villous trofoblast celkweek, ondanks zijn beperkingen, beschikken over de unieke voordeel van het nabootsen van de in vivo omgeving van de normale of abnormale placenta.Studies met behulp van villous trofoblast cel in primaire cultuur en villous explantaten tonen aan dat hypoxie en hypoxie / reoxygenatie stelselmatig verlagen trofoblast levensvatbaarheid van de cellen, gelijktijdig met verhoogde niveaus van oxidatieve stress, inflammatie, autofagie en apoptose 43,49-52. Dit hypoxie / reoxygenation celcultuur model, in het bijzonder, heeft ons toegelaten om de anti-oxidant en anti-apoptotische effecten van melatonine in villous trofoblastcellen demonstreren. In primaire villous trofoblast cellen blootgesteld aan hypoxie / reoxygenatie, melatonine voorkomt de volgende: inductie van oxidatieve stress, verminderde antioxidant enzymactiviteiten, verhoogde activiteit van redox-gevoelige signaalwegen en inductie van mitochondriale apoptose (Figuur 5B) 8. de hypoxia / reoxygenatie model is een uniek instrument om de preventieve rol van melatonine nagaan in oxidatieve stress-geïnduceerde schade en de mogelijke beschermende rol in de zwangerschap complicaties, zoals pre-eclampsie, waar de placenta de melatonine-synthese verminderd 53. Melatonine is een krachtige anti-oxidant met een breed scala aan doelen 54. Ook de veiligheid van melatonine als behandeling is grotendeels vastgesteld. De gunstige resultaten met melatonine zijn gereproduceerd door verschillende onderzoekers en melatonine is momenteel in klinische onderzoeken als een mogelijke preventieve of therapeutische behandeling in zwangerschappen gecompliceerd door pre-eclampsie of Dysmaturiteit 55,56.
Concluderend, de isolatie, zuivering en primaire kweek van hoge kwaliteit cytotrofoblastcellen, samen met de techniek van hypoxie / reoxygenation maken een groot aantal veelbelovende experimentele benaderingen om beter inzicht zwangerschapscomplicaties naar de oxidatievestress en het verbeteren van de gezondheid van de placenta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E.
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L.
- Barker, D. J.
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J.
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
