Introduction
Während der Schwangerschaft, die Plazenta Cytotrophoblastenzellen, die einkernigen Stammzellen sind, rasch vermehren und in entweder Villi oder extravillösen Cytotrophoblastenzellen unterscheiden. Extravillösen Cytotrophoblasten eindringen und die Spiralarterien der Uteruswand umbauen. Villöse Zytotrophoblasten, andererseits weiter zu vermehren, differenzieren und Sicherung kernige Synzytiotrophoblasten (Synzytium) 1 zu bilden. Die Aufrechterhaltung der Villi trophoblast Homöostase ist von wesentlicher Bedeutung für die fetale Wohlbefinden und gesunde Schwangerschaft. In der Tat erlauben villous Trophoblasten Mutter und Fötus Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen und produzieren wesentliche Hormone für die Schwangerschaft. Darüber hinaus ist die Synzytiotrophoblasten die einzige Zelltyp in direktem Kontakt mit dem mütterlichen Blutkreislauf und stellt eine wesentliche physikalische und immunologische Barriere. Daher ist die Synzytiotrophoblasten muss Apoptose und Ersatz für homeostatic Wartung zu unterziehen und zu Avoid Plazenta Pathologien 2-5.
Die Technik entwickelt von Kliman et al. 6 1986 primären villous Cytotrophoblasten aus menschlichen Plazenten zu isolieren , führte zu einer Revolution in der Plazenta Forschung durch die Untersuchung der molekularen Mechanismen ermöglicht in villous trophoblast Differenzierung beteiligt. Diese klassische Technik, basierend auf sequentiellen enzymatischen Aufschluss mit Trypsin und DNase, gefolgt von der Isolierung in Dichtezentrifugation Medien (kolloidalen Silicapartikel durch Polyvinylpyrrolidon beschichtet oder Percoll) wird nun als Goldstandard zur Isolierung von Villi Cytotrophoblastenzellen erkannt. Die Technik kann durch eine magnetische Immun optimiert werden, ein Verfahren, das villöse Zytotrophoblasten aus nicht-trophoblastischen Zellen basierend auf der differentiellen Expression spezifischer Antigene auf den Oberflächen dieser Zellen trennt. Wir wählten das Human-Leukozyten-Antigen-ABC (HLA-ABC) wegen des Fehlens seiner Expression auf der Zell trophoblastic membrane 7,8.
Die Plazenta ist ein Organ, das dramatische Veränderungen in der Sauerstoffspiegel während der Schwangerschaft erfährt. Im ersten Trimester ist die Sauerstoffanreicherungsverhältnis physiologisch sehr gering (2% O 2) , jedoch erhöht sich auf milde Ebenen der Oxygenierung (8% O 2) in der zweiten und dritten Trimester. Tuuli et al. 9 beschrieben , dass die In - vitro - Vermehrung des Trophoblasten Umgebung innerhalb des Plazentazotten ist eine Herausforderung und Variationen der Sauerstoffversorgung Ebenen sogar zu phänotypischen Veränderungen führen kann. Es ist daher, 8% Sauerstoff zu ergreifen vorgeschlagen als Normoxie die Sauerstoffspannung in Plazentazotten während des dritten Trimesters der Schwangerschaft 8,9 zu imitieren. Chen et al. 10 untersucht umfassend mehrere Variablen Sauerstoffspannung in Trophoblasten - Zellkultur verwandt und zeigen die Bedeutung Sauerstoff - Niveaus in einer perizellulären Umgebung zu bestimmen. Die Konzentrationen von Sauerstoff in den Zotten tendenziell zunehmenaufgrund Vaskulogenese. Der Blutfluss in Plazentazotten steigt ständig und das Niveau von Wasserstoffperoxid (eine häufig vorkommende reaktive Sauerstoffspezies) ist ein wichtiges Signal , das Vaskulogenese 11,12 steuert. In Schwangerschaftskomplikationen, erzeugt ein Mangel an Vaskulogenese Hypoxie, und noch wichtiger, intermittierende Variationen der Oxygenierung (sogenannte Hypoxie / Reoxygenierung). Diese Bedingungen führen zu einer abnormen Erhöhung des oxidativen Stress, der Plazenta und fetale Lebensfähigkeit 13,14 kompromittiert. Die Veränderungen , die Trophoblasten - Zellen in vivo während Episoden von Hypoxie / Reoxygenierung laufen kann in vitro nachgeahmt werden , wie folgt: villöse Zytotrophoblasten unter normoxischen Bedingungen (8% O 2) gehalten werden , bis sie in Synzytiotrophoblasten unterscheiden. Sie werden dann in hypoxischen Bedingungen (0,5% O 2) für 4 Stunden, gefolgt von einer weiteren 18 h Normoxie (Reoxygenierung) unterzogen. Mit dieser Hypoxie / Reoxygenierung Ansatz, Trophoblasten exhibit dereguliert Redoxzustand und erhöhte Spiegel von intrinsischen Apoptose 8, wie in bestimmten Komplikationen während der Schwangerschaft beobachtet. Daher ist dies ein in vitro - Modell nützliche neue präventive und therapeutische Ansätze zu bewerten Schwangerschaftskomplikationen mit plazentalem Hypoxie / Reoxygenierung verbunden zu bekämpfen.
Plazentalen Zellen produzieren Melatonin, das mehrere wichtige Funktionen, wie beispielsweise eine Fähigkeit , 15 oxidativem Stress und Plazentadysfunktion zu vermeiden. Hier präsentieren wir die experimentellen Ansatz und Zellmodelle verwendet , um die schützende Wirkung von Melatonin in der Plazenta Trophoblastzellen auf molekularer, zellulärer und funktionaler Ebene 8 zu demonstrieren.
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Protocol
Plazenten wurden am CHUM-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Kanada, mit informierte Zustimmung des Patienten und Genehmigung der Ethikkommissionen (CHUM-St-Luc Hospital und INRS-Institut Armand-Frappier unmittelbar nach dem spontanen vaginalen Entbindungen von einer unkomplizierten Schwangerschaften erhalten, Laval, QC, Kanada).
1. Isolierung und Reinigung von Villöse Zytotrophoblastzellen
- Lösungen und Medien
- Bereiten Sie Transportmedien durch Ergänzung Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium Hoch Glucose (DMEM-HG) mit 1% vol / vol Antibiotikum (10.000 Einheiten / ml Penicillin G, 100 mg / ml Streptomycinsulfat) und lagern bei 4 ° C.
- Bereiten primären Kulturmedien durch DMEM-HG mit 10% vol / vol fötalem Rinderserum (FBS), 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) Fügung von 1% vol / vol Antibiotikum (10.000 Einheiten / ml Penicillin G, 100 mg / ml Streptomycinsulfat) und lagern bei 4 ° C. Warme Medium auf 37 ° C bevorbenutzen.
- Herstellung von 4 l Salzlösung (0,9% Gewicht / Volumen Natriumchlorid).
- Prepare Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) durch Zugabe von 25 mM HEPES modifizierte HBSS auf 1x (pH 7,4).
- Bereiten frisch, vier Flaschen Verdauungslösung mit modifiziertem HBSS (hergestellt in 1.1.4), Magnesiumsulfat (MgSO 4), Calciumchlorid (CaCl 2), Trypsin, Deoxyribonuclease IV (DNase IV) und 1% vol / vol Antibiotikum ( 10.000 Einheiten / ml Penicillin G, 100 mg / ml Streptomycinsulfat) , wie in Tabelle 1 gezeigt.
- Bereiten Dichte Zentrifugationsmedien Gradienten
- Bereiten Sie Dichtezentrifugation Medienlösung durch Dichtezentrifugation Medien mit 10% vol / vol HBSS 10x Ergänzung.
- Vorbereitung 14 Teströhrchen mit Dichtezentrifugation Medienlösung und modifizierte HBSS, wie in Tabelle 2 beschrieben.
- Mischen Sie jede Dichte-Lösung (Schritt 1.1.6.2) kräftig, bevor sein Inhalt auf den Gradienten hinzufügen. Sanftfügen die Dichte Lösungen auf eine 50 ml Glaszentrifugenröhrchen mit einer peristaltischen Pumpe (1 ml / min), mit der höchsten Konzentration (70%) beginnt. Vermeiden Tröpfchen durch die Lösungen gegen die Rohrwand Entwässern der richtigen Trennung jeder Schicht des Gradienten aufrechtzuerhalten.
- In Abwesenheit einer Schlauchpumpe, gelten die Schichten sehr vorsichtig mit Pasteur-Pipetten.
- Bereiten letzte Laufpuffer durch den Laufpuffer ergänzt (siehe Tabelle der Materialien) mit 2% vol / vol Antibiotika / Antimykotika (10.000 Einheiten / ml Penicillin G, 100 mg / ml Streptomycinsulfat). Lagerung bei 4 ° C.
- Villöse Cytotrophoblast Isolation
Hinweis: Verwenden Sie sterile chirurgische Geräte, Gläser, Pipetten, Kolben, usw.- Am Tag der Villi Cytotrophoblast Isolation, in einem 37 ° C Wasserbad °, erwärmen Sie die Aufschlüsse Lösungen (aus Schritt 1.1.5) und 70 ml FBS. Hinweis: Verwenden Sie 50 ml FBS die Aufschlüsse zu unterbrechen und dierestlichen 20 ml für den Gefrierschritt (1.2.22), die auf Eis gestellt werden können einmal aufgetaut.
- Nach der Auslieferung bringen die Plazenta an das Labor in eiskaltem Transportmedium (aus Schritt 1.1.1) so schnell wie möglich (weniger als 1 h).
- Discard Transportmedium und Plazentablut in flüssiger Mülltonne. Wiegen Sie die Plazenta und tauchen in kaltem Salzlösung.
- Messen und analysieren die folgenden Funktionen: Nabelschnur Länge; Nabelschnur Lokalisierung; Plazenta-Länge, Breite, Form (oval, discoid); Membran Farbe; cotyledon Struktur Pathologien. Hinweis: Die Daten werden im Ergebnisteil dargestellt.
- Schneiden Sie die Nabelschnur neben seiner Plazenta - Insertion (dh an seiner Basis mit einem zusätzlichen 1 cm Radius Kreis um das Kabel). Eintauchen in 300 ml histologischen Gewebefixierungslösung (Formalin 10%) für eine spätere histologische Analyse.
- Schneiden Sie die gesamte Plazenta in Würfel von 5 x 5 x 5 cm. Gründlich waschen (4-mal x ~ 1 min) in Salz Solution (0,9%) Blutzellen, bis Salzlösung ist klar, zu entfernen. Entsorgen Spülflüssigkeit.
- In einem Uhrglas, entfernen Plazentamembranen und zerkleinern Gewebe Blutgefäße und Verkalkungen zu entfernen. Halten Sie die Blutgefäße fest mit einer Zange und entfernen Gewebe den Rücken Metzenbaum Schere.
- Legen Sie gehackten Plazenta in einem Büchner-Trichter. Spülen Sie mit etwa 100 ml Salzpuffer. Weiter zerkleinern, bis 30 - 35 g zerkleinerte Gewebe erhalten wird (Verwendung Kunststoff Wiegeschiffchen und Skala). Falls erforderlich, Hackfleisch, den Rest der Plazenta zu drei zusätzliche 30 zu erhalten, bis - 35 g Zubereitungen. Während dieser Zeit setzen zerkleinerte Gewebe in einem Wägeschiffchen auf Eis.
Hinweis: Dieser Schritt etwa 45 Minuten bis 1 Stunde dauern.
- Legen Sie gehackten Plazenta in einem Büchner-Trichter. Spülen Sie mit etwa 100 ml Salzpuffer. Weiter zerkleinern, bis 30 - 35 g zerkleinerte Gewebe erhalten wird (Verwendung Kunststoff Wiegeschiffchen und Skala). Falls erforderlich, Hackfleisch, den Rest der Plazenta zu drei zusätzliche 30 zu erhalten, bis - 35 g Zubereitungen. Während dieser Zeit setzen zerkleinerte Gewebe in einem Wägeschiffchen auf Eis.
- In den 30 - 35 g gehackten Plazentagewebe zu einem Trypsinisierung Kolben. Transfer 150 ml der vorbereiteten Aufschlußlösung 1 (Tabelle 1) mit dem Kolben trypsinisiert und gut mischen.
- Setzen Sie den Trypsinisierung Kolben inWasserbad für 30 Minuten bei einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 50 Zyklen / min ein Schütteln und manuell die Trypsinisierung Kolben für homogene Verdauung alle 5 min mischen.
- Am Ende der ersten Verdauung, entfernen Sie die Trypsinisierung Kolben aus dem Wasserbad und kippen (45 °) für 1 min das Plazentagewebe zu sedimentieren. Mit einer 10 ml sterilen Pipette entfernen und ca. 80 ml Überstand verwerfen. Vermeiden Sie das Gewebe abgesaugt.
- Transfer 100 ml Aufschlußlösung 2 (Tabelle 1) mit dem Kolben Trypsinisierung; gut mischen und wiederholen Sie Schritt 1.2.9.
- Am Ende des zweiten Verdauung, entfernen Sie die Trypsinisierung Kolben aus dem Wasserbad und kippen es 45 ° für 1 min. Mit einem 10 ml sterilen Pipette entfernen 80 ml Überstand und Transfer sanft in ein Zentrifugenröhrchen mit einem Zellsieb (100 & mgr; m mesh). Übertragen des filtrierten Überstand in ein Becherglas mit 2 ml FBS Voll jedesmal, wenn das Zentrifugenrohr ist.
- Führen Sie die dritte Verdauung wie für die beschriebenezweite Verdauung (1.2.11 und 1.2.12) unter Verwendung von 75 ml Aufschlusslösung 3. Parallel dazu führen Sie die Schritte 1.2.15 bis 1.2.16.1 für die Verdauung 2.
- Führen Sie die vierte Verdauung genau wie die dritte Verdau der Aufschlußlösung 4 (75 ml) verwendet, aber eine maximale Menge an Überstand zu sammeln. Führen Sie die Schritte 1.2.15 bis 1.2.16.1 parallel zur Verdauung 3 und schließlich für die Verdauung 4.
- Aliquot der Überstand (von Verdauungen 2, 3 und 4) in 13,5 ml Teile, jedes Teil in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Mit einem 22,8 cm langen Glaspasteurpipette, sehr sanft und langsam ab 1,5 ml FBS am unteren Ende jeder Röhre, um eine separate Schicht zu schaffen. Nicht FBS und Überstand mischen. Zentrifugieren Sie die Rohre ohne Bremse für 20 min bei 1250 × g bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Nach der Zentrifugation 4 Schichten in dem Rohr sichtbar sind, wie in Figur 1 gezeigt , um die Trennung von Trypsin und Trophoblastzellen exzessive zelluläre Verdauung vermeidet.. - Mit einer Vakuumpumpe, aspiraß und der Überstand (Verdauungslösung) und FBS Schichten, einschließlich der weißliche Film zwischen den beiden Schichten zu verwerfen. Resuspendieren des Pellets (die Trophoblasten und roten Blutzellschichten) mit 1 ml warmem Zellkulturmedium (Schritt 1.1.2; ohne FBS und kein HEPES).
- Sammeln Sie resuspendierten Zellen aus allen Rohren und kombinieren sie in 1 Tube. Lassen Sie das Rohr bis zum Ende aller Aufschlüsse bei Raumtemperatur stehen. Hinweis: Nachdem alle Aufschlüsse, die übliche Ausbeute beträgt 3 Röhrchen von resuspendierten Zellen (einer pro Verdauung).
- Machen Sie das Volumen auf 15 ml mit warmem Zellkulturmedium nach oben. Zentrifuge bei 1.250 xg für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe. Vermeiden Sie das Pellet abgesaugt.
- resuspendieren vorsichtig das Pellet aus den drei Röhrchen mit 1 ml warmem Zellkulturmedium erhalten. Pool ihren Inhalt in 1 Tube. Zur Erzielung 8 ml, füllen Sie das Volumen mit warmem Zellkulturmedium.
- Sehr sanft die Zellsuspension auf eine Trennung grad Schichtfänger mit einer Pasteur-Pipette. Zentrifuge ohne Bremsen für 30 min bei 507 xg bei Raumtemperatur.
- Nach dem Zentrifugieren die verschiedenen Schichten von Zellen in der Steigung mit Hintergrundbeleuchtung zu identifizieren. Suchen Sie die Schichten, die Trophoblasten und verunreinigende Zellen zwischen 40 - 50% der Dichtezentrifugation Medium. Mit einer Vakuumpumpe, entfernen Sie den oberen Schichten (> 50%).
- Sammeln Sie in den Schichten von Interesse mit einer Pasteur-Pipette befindlichen Zellen und sie auf einen 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Machen Sie das Volumen auf 50 ml mit Zellkulturmedium nach oben. Zentrifuge für 10 min bei 1250 xg bei Raumtemperatur.
- Unter sterilen Bedingungen, der Überstand verworfen, das Pellet mit 20 ml FBS resuspendieren und die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers zählen. Auf dem Eis, fügen 2,22 ml sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) und durch Umklappen vorsichtig mischen. Aliquot 1,5 ml Zellsuspension in Kryoröhrchen, einfrieren über Nacht bei -80 ° C und in einen flüssigen Stickstofftank.
<li> Trophoblast Reinigung - Installieren Sie die Spül- und Laufpuffer und eine neue Filtersäule auf dem Instrument magnetische Reinigung nach den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie die "saubere Programm" zu reinigen negativ 1 positiv 1 und positive 2-Anschlüsse, und dann stellen die 50-ml-Röhrchen unter den Ports gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Tauen Sie die Zellen, die in einem 37 ° C Wasserbad in Schritt 1.2.22 schnell eingefroren. Transfer-Zellen in ein 50 ml-Röhrchen und resuspendieren Zellen vorsichtig mit 20 ml kaltem Puffer-Lösung. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 Minuten bei 450 × g und 4 ° C.
- Überstand verwerfen. Wiederholen Sie den Waschschritt mit kaltem Puffer. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers Lebensfähigkeit zu bestimmen. Wiederholen der Zentrifugation (5 min, 450 × g bei 4 ° C). Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. 1 ml kaltem Puffer, der 1% vol / vol von Maus anti-HLA-ABC - Antikörpern. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min, mixing sanft alle 5 Minuten.
- In 6 ml kaltem Puffer. Zentrifuge für 5 Minuten bei 450 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen und wiederholen Sie diesen Schritt. Die Zellen in 1 ml kaltem Puffer , enthaltend 10% Vol / Vol Anti-Maus - Sekundär - Antikörper-gekoppelten Magnetkügelchen. bei 4 ° C inkubieren 15 min sanft alle 5 min gemischt wird.
- In 6 ml kaltem Puffer. Zentrifuge für 5 Minuten bei 450 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren in 5 ml kaltem Puffer.
- Trennen Sie die Trophoblastzellen das magnetische Reinigungsinstrument. Sammeln Zellen am negativen Anschluss und fügen Sie 20 ml kaltem Puffer.
Hinweis: Trophoblastzellen enthalten nicht die komplexe HLA-ABC und werden somit von anderen Zelltypen getrennt und in Richtung der negativen 1 Port. - Zentrifuge für 5 Minuten bei 450 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen und die Zellen vorsichtig in 20 ml warmen Primärkulturmedium resuspendieren. Zählen Sie die Zellen usinga Hämozytometer Lebensfähigkeit zu bestimmen.
- Platte die Zellen bei den folgenden Dichten: 0,15 x 10 6 Zellen / Well in 96-Well - Platten, 1,6 x 10 6 Zellen / Well in 24-Well - Platten und 4,5 x 10 6 Zellen / Well in 6-Well - Platten. Inkubiere Platten bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Bestätigen Sie die Reinheit der Trophoblastzellen mittels Durchflusszytometrie 16,17 und / oder 18 Immunzytochemie.
Anmerkung: Die Reinheit der immungereinigten Zellen wurde bestimmt unter Verwendung von FITC-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen Cytokeratin-7 und Vimentin 17-19. Dieses Protokoll ist gut detailliert in Lanoix et al., 2008 7. - Nach mindestens 4 Stunden, spülen Sie die Zellen zweimal mit warmem Kulturmedium ungebunden Zellen zu entfernen und dann die Platten auf die Normoxie Kammer übertragen, die von 8% O 2 (siehe Abbildung 2 und Abschnitt 2) zusammengesetzt ist.
2. In - vitro - induction von Normoxie und Hypoxie / Reoxygenierung
- Inkubatorkammer Betrieb (2A für Set-up zu sehen).
- In einer Laminarströmungsabzug, legen Sie eine Petrischale mit sterilem Wasser am Boden der Inkubatorkammer Trockenheit zu vermeiden; legen Sie dann die zuvor hergestellte Zellkulturplatten oder Kolben (Schritt 1.3.10) auf den höheren Regalen der Kammer.
- Außerhalb der Haube, befestigen die Kammer (Einlassöffnung) mit dem Gasschlauch (2A: 5a, b und c) , um das Rohr von Gas (8% O 2 oder 0,5% O 2) zu erreichen (2A , 7). Öffnen beider Einlass- und Auslassöffnungen der Kammer. In diesem Moment wird der Gasregler (2A , 4) geschlossen bleiben sollte.
- Sie vorsichtig das Ventil Gasregler öffnen (Abbildung 2A: 4). Flush für 4 min mit einem Luftstrom von 25 l / min, um vollständig die Luft innerhalb der Kammer zu ersetzen.
- Nachdem die Kammer gespült, schließen Sie den Gasregler dann den Einlass und den outlet Häfen der Kammer.
- Ziehen Sie den Durchflussmesser Ablaufschlauch (2A: 5c) von der Einlassöffnung der Kammer und legen Sie die Kammer in einer Zellkultur - Inkubator bei 37 ° C.
- Ersetzen Sie die Luft derzeit in den Platten, Flaschen und in dem Kulturmedium gelöst, indem die Kammer Befüllung mit Gas 1 Stunde nach dem Schritt 2.1.3.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 für die anderen Gaszusammensetzungen zu 2.1.6 (beispielsweise 2% O 2 für die ersten Trimesters Trophoblasten Kultur 9).
- Bestätigen Sie den Sauerstoffanteil (2B-C)
- Um die Konzentration von Sauerstoff in dem Zellkulturmedium bestätigen (ohne Zellen) innerhalb der Kammer, verwenden, um eine Sauerstoffelektrode an ein Sauerstoffadapter verbunden. Schließen Sie die Sauerstoffelektrode mit einem Voltmeter.
- Erstellen einer Eichkurve in der gleichen Lösung (dh Zellkulturmedium) durch die Lösung zu Gasen mit bekannten Sauerstoffgehalt ausgesetzt wird (beispielsweise 0% , und21% Sauerstoff). Nachdem die Messwerte für jede Konzentration stabilisiert sind, einzuführen, um die Elektrode in das Medium in der Kammer.
Hinweis: Nehmen Sie alle Messung in der gleichen Tiefe um 10 Bias in der Sauerstoffkonzentration zu vermeiden.
- Die Induktion von Normoxie und Hypoxie / Reoxygenierung in Trophoblasten.
- primäre Trophoblastzellen zu den entsprechenden Zellkulturflaschen, Platten oder Petrischalen nach dem Hinzufügen führen Behandlungen wie nötig.
- Parallel im Inneren der Kammer, belichten Zellen auf die gewünschte Gasmischung eine bestimmte Bedingung zu reproduzieren alle 24 h (Figur 3).
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Representative Results
Isolation und Immunoreinigung von Villi Cytotrophoblastenzellen aus einer normalen Begriff Plazenta durch vaginale Entbindung erhalten ergab 1 x 10 8 lebensfähige Zellen. Die Plazenta wog 350 g, betrug 19 cm im Durchmesser, 4 cm hoch mit scheibenförmigen Form und transparent Membranen. Keine cotyledon Malformation nachgewiesen. Die Nabelschnur hatte paracentralis Lokalisation und eine Länge von 56 cm. Die Reinheit wurde mittels Flow-Cytometrie untersucht unter Verwendung von Vimentin und Cytokeratin-7-Marker. Mehr als 98% der Zellen waren negativ für Vimentin und positiv für Cytokeratin-7, um die Reinheit des villous Trophoblasten-Zellen aus dem Immun erhalten bestätigt. Villöse Zytotrophoblasten-Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten unter normoxischen Bedingungen in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 mM Melatonin. Die biochemische Differenzierung von villous Zytotrophoblasten wurde überwacht durch Ebenen β-human Choriongonadotropin (β-hCG) Sekretion Bestimmenzuvor 1,7,20,21 beschrieben. Die morphologische Differenzierung und Apoptose wurden durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von Anti-Desmoplakin beurteilt und Anti-Caspase-gespaltenen Cytokeratin - 18 Intermediärfilamente 7,22. Zellkulturmedien von Tag 1 (hauptsächlich villous Cytotrophoblasten) bis Tag 4 (hauptsächlich Synzytiotrophoblasten) wurden gesammelt, zentrifugiert und β-hCG-Werte wurden in den Überständen gemessen. Herstellung von β-hCG, die dem Synzytiotrophoblasten exklusiv ist, erhöhte sich mit Kulturzeit (Abbildung 4). Nicht nur Hypoxie / Reoxygenierung, aber Hyperoxie (> 20% O 2) ebenfalls aktiviert apoptosis 23. Somit Annahme einer 8% O & sub2 ; -Konzentration war repräsentativ für die Menge an Sauerstoff zu dem eine villous Trophoblastenzelle 10 während des dritten Trimesters der Schwangerschaft ausgesetzt wäre. Der Peak von β-hCG-Werte bei 72 Stunden beobachtet bestätigt die Fähigkeit der villösen Zytotrophoblasten unter diesen Bedingungen zu unterscheiden.Melatonin hat β-hCG-Sekretion unter diesen Studienbedingungen nicht verändern. Die Abnahme von β-hCG - Konzentration bei 96 Stunden wurde wahrscheinlich durch die Apoptose von Trophoblastzellen verursacht, die 5,7,22,24,25 (Abbildung 4) nach längeren Zeiträumen in Primärkultur erhöht. DMSO (0,1% vol / vol) wurde ausgewählt , weil es nicht β-hCG - Konzentration 26,27 beeinflußte. Die schützende Rolle von Melatonin wurde stark auf ihre antioxidative Eigenschaften verwandt. Hypoxie / Reoxygenierung nach 72h Kultur induzierten oxidativen Stress in villous Trophoblastzellen. Die schützende Wirkung von Melatonin wurde mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Nachweisreagenz (5A) beurteilt. Nach 96 h Kultur wurden Trophoblastzellen für 45 min mit 10 & mgr; M 5- (und-6) -Carboxy-2 ', 7'-8 hergestellt dichlorodihydrofluorescein diacetat (carboxy-H2DCFDA) die Gesamtmenge des ROS zu detektieren inkubiert. Villöse Trophoblastzellen, die Hypoxie / Reoxygenierung unterzog hattedeutlich ROS Ebenen erhöht (54%) im Vergleich zu denen unter Normoxie. Dieser Anstieg wurde durch die Behandlung mit 1 mM Melatonin umgekehrt. Darüber hinaus unter Normoxie Melatonin hat modulieren nicht ROS Ebenen (Homöostase), die villous Trophoblastzellen nicht behandelten ähnlich war (5A), Fig . 4 und 5A zeigen , dass Melatonin unter Normoxie nicht Niveaus von oxidativem Stress oder β-hCG - Sekretion verändern in den Trophoblasten - Zellen, die früheren Studien erhärtet 28,29 keine Modulation von Zell - Homöostase unter normalen Bedingungen zeigt.
Abb . 1: Aufschlußrohr Nach Zentrifugation 4 Schichten gebildet werden . Die obere Schicht ist aus Aufschlußlösung zusammengesetzt ist; knapp unterhalb der fötalem Rinderserum (FBS). Beide Schichten sollte mit einer Vakuumpumpe verworfen werden. Die unteren Schichten are zusammengesetzt wie folgt: eine weiße Schicht enthält, Fibroblasten, Leukozyten, Makrophagen und Trophoblasten; und eine untere Schicht aus roten Blutzellen zusammengesetzt ist . Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 2: Komponenten der Hypoxie Kammer und Messtechnik / Berechnung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff (A) Hypoxie Kammer und Gaszylinderanordnung: (1) Gasflaschen; (2) Gasregler; (3) Gasschlauchschelle; (4) Zylindergasschlauch; (5) Eingangsfilter; (6) Zulaufschlauch; (7) Durchflussmesser; (8) Ablaufschlauch; (9) Modulare Inkubatorkammer. (B) Berechnung der tatsächlichen Sauerstoffkonzentration im Zellkulturmedium eine Standardkurve erzeugt mit bekannten Sauerstoffkonzentrationen verwendet. (C und D)Die relativen Werte in den Lösungen "0% O 2" und "21% O 2" erhalten, werden grafisch als eine lineare Funktion zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration in dem Zellkulturmedium "?% O 2" aufgetragen. Bitte klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3:. Allgemeine Experimentelle Gestaltung der Zellkultur in der Modular Inkubationskammer Normoxie (8% O 2, 5% CO 2, 87% N 2) und Hypoxie / Reoxygenierung (H / R) (0,5% O 2, 5% CO 2; 94,5% N 2) sind die Bedingungen verwendet , um pathologische Zustände in villous Cytotrophoblast (VCTB) und Synzytiotrophoblasten (STB) Zellen untersucht werden . Alle 24 h, Medium mit oder ohne Melatonin (1 mM) geändert wirdund das Gasgemisch wird erneuert. Unter H / R, STB Zellen durchlaufen Hypoxie (0,5% O 2) für 4 Stunden und dann wieder auf Normoxie (8% O 2). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 4: Wirkung von Melatonin auf beta-human Chorionic Gonadotropin (β-hCG) -Sekretion während Villöse Trophoblast Differentiation Villöse Zytotrophoblasten - Zellen wurden isoliert und gereinigt aus menschlichen Plazenten gesunden Begriff. (; 5% CO 2, 87% N 2 8% O 2): (Vehikelkontrolle DMSO 0,1%) unter normoxischen Bedingungen Zellen wurden für 96 h mit 1 mM Melatonin oder Dimethylsulfoxid behandelt. β-hCG-Konzentration in Kulturmedium wurden durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), gemessen nach 24, 48, 72 und 96 h of Primärkultur. Spiegel wieder normalisiert wurden auf den Proteingehalt des Ganzzell - Lysat aus jeder Vertiefung entspricht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Antioxidative Wirkung von Melatonin in Syncytiotrophoblast Exposed Hypoxie / Reoxygenierung (A) die Wirkung von Melatonin (M; 1 mM) auf die intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Ebenen in Synzytiotrophoblasten Zellen unter Normoxie (N) oder Hypoxie / Reoxygenierung (HR), nach 72 h der Kultur induziert wird, durch 5- beurteilt wurde (und-6) -Carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (carboxy-H2DCFDA) Fluoreszenz. Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD von 3 verschiedenen Plazenten ausgedrückt; *** P <0.001 (Lanoix, et al. 8). (B) Die zelluläre Wege in der putative Schutz von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Apoptose beteiligt. Primäre villous Zytotrophoblasten - Zellen wurden für 72 h unter Normoxie (8% O 2) Differenzierung in Synzytiotrophoblasten zu ermöglichen. Die Zellen wurden auf 1 mM von Melatonin oder Fahrzeugsteuerung ausgesetzt und dann für 4 Stunden durch einen 18 Stunden Zeitraum Reoxygenierung (8% O 2) und anschließend auf Hypoxie (0,5% O 2) unterzogen. Hypoxie / Reoxygenierung induzierte oxidative Stress aktiviert redox empfindliche Transkriptionsfaktoren wie nuclear factor kappa B (NF & kgr; B) und Hypoxie-induzierbaren Faktor 1 (HIF-1). NF & kgr; B induziert p53, das die Bax / Bcl-2-Weg der mitochondrialen Apoptose beteiligt die Spaltung und Aktivierung von Caspasen Caspase 9 und 3. 3 aktiviert löst Rho-associated, coiled coil-containing protein kinase 1 (ROCK-1), die Spaltung von Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) und die Beeinträchtigung der DNA-Reparatur. Melatonin Prevents die Induktion der mitochondrialen Apoptose durch als starkes Antioxidans wirkt, um den oxidativen Stress verursacht durch Hypoxie / Reoxygenierung zu reduzieren. Diese Zahl hat sich von Lanoix et al modifiziert. 2013 8. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Verdauung 1 | Digestion 2 | Digestion 3 | Verdauung 4 | |
| Modifizierte HBSS (ml) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNAse (ul) | 300 | 200 | 150 | 150 |
| (0,1 mg /ul) | ||||
| MgSO 4 (& mgr; l) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (800 mM) | ||||
| CaCl 2 (& mgr; l) | 150 | 100 | 75 | 75 |
| (100 mM) | ||||
| Trypsin (U) | 1824000 | 1200000 | 960.000 | 960.000 |
| P / S (ml) | 1 | 0 | 0 | 0 |
Tabelle 1: Die Mengen der Zutaten für die Aufschlußlösung Penicillin und Streptomycin (P / S);. Magnesiumsulfat (MgSO 4); Calciumchlorid (CaCl <sub> 2); Deoxyribonuclease IV (DNase IV).
Tabelle 2: Volumen der Dichtezentrifugation Media Solution und modifizierte HBSS Erforderlich für die Herstellung der Gradient - Lösung.
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Discussion
Bei Säugetieren ist die Entwicklung des Fötus direkt abhängig von ausreichend Plazentafunktion. Die Entwicklungs Ursprünge von Gesundheitsstörungen werden auf der Hypothese aus , dass die Ursache von Krankheiten im späteren Leben manifestieren können zu frühe Entwicklung zurückverfolgt werden und dass die Plazenta hat eine mechanistische Rolle in der fötalen Programmierung 30-32. Die Plazenta ist der Schlüsselmediator der fetalen Wachstum und Entwicklung: es Nährstofftransfer regelt, schützt vor schädlichen Expositionen, und die wichtigsten endokrinen Funktionen. Die Entwicklung von Kliman et al. Einer reproduzierbaren Technik vitaler primärer Cytotrophoblasten zu isolieren , ist ein Meilenstein in der Erforschung von normalen und abnormen Lage der Plazenta Funktionen 6. Viele Forscher haben diese Technik angepasst spezifischen Bedingungen in vitro zu reproduzieren Plazenta Physiologie 18,20,33,34 zu verstehen. Wie von Petroff et al . Beschrieben, sind viele Schritte wichtig Gereinigtes und robust Ausbeute an isoliertem cyto zu garantierenTrophoblastzellen 18. Zum Beispiel haben die Verdauung Schritte 1988, wie eine erhöhte Anzahl und Länge der Verdauungen sowie auf die Zusammensetzung und Menge der Verdauungsenzyme mehrere Änderungen seit der Entwicklung der Technik unterzogen, in eine größere Anzahl von lebensfähigen isolierten Zytotrophoblasten ergeb 18. Das aktuelle Protokoll hat drei wesentliche Vorteile: Kryokonservierung, die für die Möglichkeit , das Protokoll später immunomagnetischer Reinigung weiterhin erlaubt, die Cytotrophoblast Reinheit und die Verwendung erhöht vorbeschichtet 7,34-36 Zellanheftung Mikrotiterplatten zu verbessern. Die bestehende Literatur enthält mehrere Beispiele für diverse Modifikationen der Isolationstechnik für Zytotrophoblastzellen, aber die Eigenschaften der Dichtezentrifugation Medien praktisch nicht modifizierten 37 geblieben. Die vorgestellte Technik der Isolierung / Immunoreinigung hat mehrere wichtige Schritte. Daher ist es wichtig, die Reinheit zu bewerten,der villösen Zytotrophoblasten-Zellen am Ende jedes Immun. Dies kann durch die Strömung erfolgen Zytometrie unter Verwendung geeigneter Antikörper als Marker: Cytokeratin-7 (trophoblastic Marker), Cluster der Differenzierung 45 (CD45) und Vimentin (nicht Trophoblastzellen Marker) 18,38,39. Weitere wichtige Aspekte sind die Qualität der erhaltenen Plazenten, die FBS und Dichte Zentrifugationsmedien Gradienten sowie Zentrifugierungsgeschwindigkeit, die alle den Ertrag und die Qualität der Zellen 20,40 beeinflussen können.
Obwohl weit verbreitet ist, hat die vorliegende Technik unvermeidbare Einschränkungen. Erstens ist die Menge an lebensfähigen Zellen nach Zytotrophoblasten Immunreinigung erhaltenen relativ gering und ist der Hauptbegrenzungsfaktor in der Anzahl der möglichen Bedingungen / Behandlungen, die getestet werden können. Zweitens ist die Lebensdauer von primären Trophoblastzellen kurz und in vitro Differenzierung in Synzytiotrophoblasten eng ist durch eine Reduktion der Zell viabili gefolgt ty und eine Zunahme der Apoptose. Die kurze Länge von Trophoblastenzelle Lebensfähigkeit , die nicht in vitro nicht wuchern, begrenzt die Bewertung der langfristigen Behandlungen, weil die Apoptose irreversibel nach etwa 4 Tagen Kultur 7,41 ausgelöst wird. Drittens ist interplacental Variabilität groß, so dass eine relativ große Anzahl von Plazenten ist erforderlich, um statistisch interpretierbare Ergebnisse erhalten. Auf der anderen Seite hat primäre Trophoblasten Kultur einzigartige Vorteile, wie beispielsweise die Kapazität der Zellen in Syncytium zu differenzieren, die für die Untersuchung der Bedingungen und Behandlungen in verschiedenen Zell Phänotypen nach den verschiedenen Stadien der Differenzierung ermöglicht. Die Oxygenierung Verfahren in diesem Protokoll vorgestellt , ist sehr anpassungsfähig und seine Konfiguration kann auch für andere Situationen, wie die Kultur von primären Trophoblastzellen aus ersten Trimesters der Schwangerschaft zugeschnitten werden, die für Normoxie 9,42,43 auf eine niedrigere Sauerstoffspannung ausgesetzt werden sollte.
ntent "> Es gibt auch andere Ansätze menschlichen Plazentafunktion in vitro zu studieren. Snap-Gefrieren plazentalen ermöglicht Gewebe für Mehr omics Analysen, aber plazentalen mehreren Systemen Probenahme erfordert, beispielsweise Stoffwechselschwankungen aufgrund der Oxygenierung Gradienten zu vermeiden, die von der zentralen abnimmt Zotten an die Peripherie 44. jedoch können Live - Trophoblasten Zellbiologie und Verhalten nicht 45 mit diesem Ansatz untersucht werden. villöse Explantate haben den Vorteil , die gesamte villous Struktur mit den konstituierenden Zelltypen zu erhalten und ihre Kommunikation, sondern antwortet Behandlungen sind nicht spezifisch für Trophoblastzellen 23. im Handel erhältliche Trophoblasten-like Chorionkarzinom - Zelllinien, wie BeWo, JEG-3 - und JAR kann zu studieren plazentalen Funktionen verwendet werden, wie zum Beispiel Fusions, Differenzierung und transplazentare Transport. die jüngsten Studien zeigen , dass die Genexpression in primären Cytotrophoblasten und BeWo Tumorzellen sind schlecht 46-48 korreliert. Thus, primäre villous Trophoblastenzelle Kultur trotz ihrer Einschränkungen, besitzen den einzigartigen Vorteil , die in - vivo - Umgebung des normal oder abnormal Plazenta nachahmt.Studien villous Trophoblastenzelle in Primärkultur und zottig Explantate mit zeigen , dass Hypoxie und Hypoxie / Reoxygenierung systematisch Trophoblastenzelle Lebensfähigkeit, gleichzeitig mit der erhöhten oxidativen Stress, Entzündungen, Autophagie und Apoptose 43,49-52 verringern. Diese Hypoxie / Reoxygenierung Zellkulturmodell, hat gesagt, erlaubt es uns, die antioxidative und anti-apoptotische Wirkung von Melatonin in villous Trophoblastzellen zu demonstrieren. In primären Zellen villous Trophoblasten ausgesetzt Hypoxie / Reoxygenierung, Melatonin verhindert die folgenden: Induktion von oxidativem Stress, verringerte Antioxidans Enzymaktivitäten, erhöhte Aktivität redoxsensitiven Signalwege, und die Induktion der mitochondrialen Apoptose (5B) 8. Die hypoxia / Reoxygenierung Modell ist ein einzigartiges Werkzeug , um die präventive Rolle von Melatonin in oxidativen Stress induzierte Schäden und deren mögliche schützende Rolle in der Schwangerschaft Komplikationen wie Präeklampsie, wo Plazentamelatoninsynthese reduziert wird 53 zu ermitteln. Melatonin ist ein starkes Antioxidans mit einer breiten Palette von Zielen 54. Außerdem wurde die Sicherheit von Melatonin als Behandlung weitgehend etabliert. Die vorteilhaften Ergebnisse mit Melatonin wurden von mehreren Forschern reproduziert und Melatonin wird derzeit in klinischen Studien als potentielles präventiven oder therapeutischen Behandlung in Schwangerschaften von Präeklampsie oder intrauterine Wachstumsretardierung 55,56 kompliziert.
Abschließend ermöglichen die Isolierung, Reinigung und Primärkultur von hoher Qualität Cytotrophoblastenzellen, zusammen mit der Technik der Hypoxie / Reoxygenierung ein breites Spektrum an vielversprechenden experimentellen Ansätze für eine bessere Schwangerschaftskomplikationen zu oxidativen Zusammenhang verstehenStress und Plazenta Gesundheit zu verbessern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
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