Introduction
ヒト妊娠全体にわたって、単核幹細胞である胎盤栄養膜細胞は、急速に増殖し絨毛またはextravillous細胞栄養芽層細胞のいずれかに分化します。 Extravillous細胞栄養芽層が侵入し、子宮壁のらせん動脈を改造します。絨毛細胞栄養層は、他の一方で、多核合胞体（シンシチウム）1を形成するために、増殖し分化し、ヒューズを続けます。絨毛栄養膜の恒常性の維持は、胎児の幸福と健康な妊娠のために不可欠です。実際には、絨毛栄養膜は、酸素と栄養素の母体胎児の交換を可能にし、妊娠に不可欠なホルモンを産生します。また、合胞体栄養細胞は、母体の血液循環と直接接触している唯一の細胞型であり、本質的な物理的および免疫学的障壁を提供します。したがって、合胞体栄養細胞は恒常性維持のため、アポトーシスおよび交換を受けなければならないとAVOしますID胎盤病理2-5。
Kliman らによって開発された技術。1986年の6個のヒト胎盤からの一次絨毛細胞栄養層を分離するためには、絨毛栄養膜分化に関与する分子メカニズムの研究を可能にすることによって、胎盤の研究に革命をもたらしました。密度遠心分離メディア（ポリビニルピロリドン、またはパーコールによってコーティングされたコロイダルシリカ粒子）で分離に続いてトリプシンおよびDNアーゼによる逐次酵素消化に基づいて、この古典的な技術は、現在、絨毛栄養膜細胞を単離するためのゴールドスタンダードとして認識されています。技術は、磁気免疫精製、これらの細胞の表面上の特異的抗原の示差発現に基づいて、非栄養膜細胞から絨毛細胞栄養芽層を分離する手順によって最適化することができます。私たちは、原因絨毛細胞membran上のその発現の欠如にヒト白血球抗原ABC（HLA-ABC）を選びました電子7,8。
胎盤は、妊娠中の酸素レベルの劇的な変化を受ける器官です。妊娠初期では、酸素の比は、第二及び第三のトリメスターに生理学的に非常に低い（2％O 2）が、酸素の穏やかなレベルに増加する（8％O 2）です。 Tuuli ら 9は、胎盤絨毛内部の栄養膜環境のin vitroでの再生が酸素化レベルでの挑戦とばらつきがあっても表現型の変化につながる可能性があることを説明しました。したがって、妊娠8,9の第三期中の胎盤絨毛に見られる酸素分圧を模倣するために正常酸素として8％の酸素を採用することが示唆されます。 Chenら 10は、広く栄養膜細胞培養における酸素分圧に関連するいくつかの変数を検討し、細胞周囲環境の酸素レベルを決定することの重要性を実証しました。絨毛中の酸素の濃度が増加する傾向にあります脈管形成に起因します。常に胎盤絨毛増加の血流および過酸化水素（豊富な反応性酸素種）のレベルは、脈管11,12を制御する重要な信号です。妊娠合併症、脈管形成の欠如は、低酸素状態を生成し、そしてより重要なことには、酸素の間欠的な変形は、（低酸素/再酸素化と呼ばれます）。これらの条件は、胎盤と胎児の生存率13,14を損なう酸化ストレスの異常な増加につながります。次のように栄養膜細胞が低酸素/再酸素化のエピソードの間に生体内で受ける改変は、in vitroで模倣することができる。彼らは合胞体栄養細胞に分化するまで、絨毛細胞栄養層は、酸素正常状態（8％O 2）下に維持されています。次いで、それらを酸素正常状態（再酸素化）の追加の18時間、続いて4時間、低酸素条件（0.5％O 2）に供されます。この低酸素/再酸素化のアプローチを使用して、元のトロホブラスト特定の妊娠合併症で観察されているように、調節解除酸化還元状態と内因性アポトーシス8のレベルの増加をhibit。したがって、これは胎盤性低酸素症/再酸素化に関連した妊娠合併症に対処するために新たな予防・治療法を評価するインビトロモデルに有用です。
胎盤細胞は、例えば、酸化ストレスおよび胎盤機能不全15を回避する能力など、いくつかの重要な機能を有し、メラトニンを生成します。ここで、我々は、分子細胞および機能レベル8で胎盤栄養膜細胞におけるメラトニンの保護効果を実証するために使用される実験的なアプローチとセルモデルを提示します。
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Protocol
胎盤は、インフォ患者の同意と倫理委員会（CHUMサンリュック病院とINRS-研究所アルマン-フラピエの承認を得て、直ちにCHUMサンリュック病院、モントリオール、QC、カナダでの合併症のない妊娠からの自発的な膣分娩後に得ましたラバル、QC、カナダ）。
絨毛細胞栄養芽層細胞の1単離および精製
- ソリューションとメディア
- 4℃で1％の体積/体積の抗生物質（10,000単位/ mlペニシリンG、100 mg / mlでストレプトマイシン硫酸塩）とストアを含むダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（DMEM-HG）を補完することにより、トランスポートメディアを準備します。
- 10％ 体積/体積のウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM-HGを補充することにより一次培地を調製し、25 mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、1％ 体積/体積の抗生物質（10,000単位/ mlのペニシリンG、100 mg / mlでストレプトマイシン硫酸ナトリウム）し、4℃で保存します。 37°Cの前にウォームメディアつかいます。
- 生理食塩水（0.9％重量/容量の塩化ナトリウム）の4 Lを準備します。
- 1×HBSS（pH7.4）中に25mMのHEPESを添加することによって改変ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を準備します。
- 修正されたHBSS（1.1.4で調製した）で消化溶液、硫酸マグネシウム（MgSO 4）、塩化カルシウム（CaCl 2）、トリプシン、デオキシリボヌクレアーゼIV（DNアーゼIV）、および1％ 容量/容量の抗生物質（新鮮な4つのボトルを準備10,000単位/ mlのペニシリンG、100ミリグラム/ mlストレプトマイシン硫酸塩） を表1に示します。
- 密度遠心分離メディア勾配を準備
- 10％の体積/体積 HBSS 10倍で密度遠心分離培地を補充することによって密度遠心分離培地溶液を準備します。
- 密度遠心分離培地溶液で14アッセイチューブを準備し、 表2に記載されているように、HBSSを変更しました。
- 精力的にグラデーションにその内容を追加する前に、各濃度の溶液（ステップ1.1.6.2）を混ぜます。優しく最高濃度（70％）で始まる、蠕動ポンプ（1ml /分）を有する50mLのガラス遠心管に濃度溶液を加えます。勾配の各層の適切な分離を維持するために、管壁に対するソリューションを排出することによって液滴を避けてください。
- 蠕動ポンプの非存在下では、パスツールピペットで非常に優しく層を適用します。
- 2％ 容量/抗真菌体積抗生物質/（10,000単位/ mlペニシリンG、100 mg / mlで硫酸ストレプトマイシン）で（材料の表を参照）ランニング緩衝液を補充することにより、最終的なランニングバッファーを準備します。 4℃で保存。
- 絨毛細胞栄養芽層の分離
注意：使用無菌手術用機器、ガラス製品、ピペット、フラスコなど- 絨毛細胞栄養芽層の分離の日に、37℃の水浴中で、及びFBS 70mlを（ステップ1.1.5）からの消化液を温めます。注：FBSの使用50mlを消化し、遮断します一度解凍した氷の上に置くことができる凍結工程（1.2.22）用の20ミリリットルを残り。
- 出産後、できるだけ速やかに（ステップ1.1.1から）氷冷輸送媒体で実験室に（1時間未満）の胎盤をもたらします。
- 液体ゴミ箱に輸送媒体と胎盤血を捨てます。胎盤の重量を測定し、冷生理食塩水に浸します。
- 測定し、以下の機能解析：臍帯の長さを、臍帯ローカライズ;胎盤長さ、幅、形状（楕円形、円盤状）。膜の色;子葉構造病理。注：データは、結果セクションに提示されています。
- （コードの周りに追加の半径1cmの円とそのベースで、 すなわち ）その胎盤の挿入と一緒にへその緒を切ります。後で組織学的分析のために、組織学的、組織固定溶液（ホルマリンの10％）300mlに浸します。
- 5×5×5cmの立方体に全体胎盤をカット。生理食塩水ゾル中に完全に（4倍X〜1分）洗浄ution（0.9％）食塩水が透明になるまで、血液細胞を除去します。リンス液は捨ててください。
- 時計皿では、血管や石灰化を除去するために胎盤膜およびミンチ組織を削除します。鉗子でしっかりと血管を持ち、Metzenbaumはさみバックを使用して組織を削除します。
- ブフナー漏斗でみじん切り胎盤を置きます。生理食塩水緩衝液の約100ミリリットルですすいでください。細分化した組織の35グラムが得られる（プラスチック計量ボートとスケールを使用） - 30までミンチ続けます。 35グラムの準備 - 必要に応じて、3つの追加30まで得ることが胎盤の残りの部分をミンチ。この間、氷の上に秤量ボートにみじん切りの組織を置きます。
注：このステップは1時間に約45分かかります。
- ブフナー漏斗でみじん切り胎盤を置きます。生理食塩水緩衝液の約100ミリリットルですすいでください。細分化した組織の35グラムが得られる（プラスチック計量ボートとスケールを使用） - 30までミンチ続けます。 35グラムの準備 - 必要に応じて、3つの追加30まで得ることが胎盤の残りの部分をミンチ。この間、氷の上に秤量ボートにみじん切りの組織を置きます。
- トリプシン処理フラスコに35グラムみじん切り胎盤組織 - 30を追加します。トリプシン処理フラスコに調製した消化溶液1（ 表1）の150ミリリットルを移し、よく混ぜます。
- でトリプシン処理フラスコを置きますこれ以上50未満サイクル/分の速度で30分間水浴を振って、手動で均質な消化のために5分ごとにトリプシン処理フラスコを混ぜます。
- 最初の消化の終わりに、水浴からトリプシン処理フラスコを削除し、胎盤組織を沈降するために1分間それ（45°）を傾けます。 10ミリリットルの滅菌ピペットを用いて、上清の約80ミリリットルを除去し、廃棄します。組織を吸引することは避けてください。
- トリプシン処理フラスコに消化溶液2（ 表1）100mlのを転送します。よく混ぜ、ステップ1.2.9を繰り返します。
- 第二の消化の終了時に、水槽からトリプシン処理フラスコを取り外し、1分間それを45°傾けます。 10ミリリットルの滅菌ピペットを用いて、80ミリリットルの上清を除去し、静かにセルストレーナー（100μmのメッシュ）で遠心分離管に移します。 FBSの2ミリリットルの遠心分離管がいっぱいになるたびに入ったビーカーに濾過した上清を転送します。
- 記載したように、第3の消化を行います第二の消化（1.2.11および1.2.12）並行して75ミリリットル消化溶液3を用いて、消化2用の1.2.16.1にステップ1.2.15を実行します。
- 消化溶液4（75ミリリットル）を用いた第3の消化とまったく同じように第四の消化を実行しますが、上清の最大量を収集します。消化3並列に1.2.16.1に、手順1.2.15を実行し、そして最終的に消化4。
- （消化2、3から4）上清13.5ミリリットルの部分に、1 15ミリリットル遠心管に各部分を等分。 22.8センチメートル長いガラスパスツールピペットで、非常に静かに、ゆっくりと別のレイヤーを作成するために、各チューブの底にFBSの1.5ミリリットルを配置します。 FBSおよび上清を混在させないでください。室温で1250×gで20分間ブレーキなしのチューブを遠心。
注： 図1に示すように遠心分離した後、4つの層は、チューブ内に表示されているトリプシンおよび栄養膜細胞の分離は、過剰な細胞消化を回避します。 - 真空ポンプ、aspirと食べたし、上清（消化液）と2層の間に白っぽい膜を含むFBS層を捨てます。温かい細胞培養培地1ml（; NO FBSなしHEPESとステップ1.1.2）と（トロホブラストと赤血球層）ペレットを再懸濁します。
- すべてのチューブから再懸濁した細胞を収集し、1チューブでそれらを組み合わせます。チューブはすべて消化の終わりまで室温で放置します。注：すべて消化した後、通常の収量は再懸濁された細胞（消化あたり1）の3つのチューブです。
- 暖かい細胞培養培地で15ミリリットルにボリュームを構成しています。室温で10分間、1250×gで遠心分離します。真空ポンプで上清を取り除きます。ペレットを吸引しないでください。
- 優しく暖かい細胞培養培地の1ミリリットルで3つの管から得られたペレットを再懸濁します。 1チューブでその内容をプール。 8ミリリットルを得るためには、温かみの細胞培養培地でボリュームを完了します。
- 非常に静かに分離卒業生に細胞懸濁液をレイヤーパスツールピペットでient。室温で507×gで30分間ブレーキなしで遠心します。
- 遠心分離した後、バックライトでの勾配で細胞の異なる層を識別します。密度遠心分離培地の50％ - 層栄養膜を含むと40の間の細胞の混入を探します。真空ポンプで、上位層（> 50％）を取り外します。
- パスツールピペットで関心のある層に位置して細胞を回収し、50mlの遠心管に移します。細胞培養培地で50ミリリットルにボリュームを構成しています。室温で1250×gで10分間遠心します。
- 無菌条件下で、上清を捨て、FBS 20mlでペレットを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。氷の上で、無菌ジメチルスルホキシド（DMSO）の2.22ミリリットルを追加し、反転させる穏やかに混合します。極低温バイアルへの細胞懸濁液のアリコート1.5ミリリットルを、-80℃で一晩凍結し、液体窒素タンクに移します。
<LI>栄養膜精製 - 製造元の指示に従ってすすぎとバッファを実行し、磁気浄化機器の新しいフィルターカラムを取り付けます。負の1、正1と正の2ポートをきれいにしてから、製造元の指示に従って、各ポートの下に50ミリリットルチューブを紹介する「クリーンプログラム」を実行します。
- 37℃の水浴中で迅速ステップ1.2.22で凍結した細胞を解凍。冷たいランニング緩衝液の20ミリリットルと穏やかに50ミリリットルチューブを再懸濁細胞に細胞を移します。 450×gで5分間、4℃のためのチューブを遠心。
- 上清を捨てます。冷たいランニング緩衝液で洗浄ステップを繰り返します。生存率を測定する血球計数器を用いて細胞を数えます。遠心分離を繰り返して（5分、4℃で450×gでの場合）。上清を注意深く取り除きます。抗HLA-ABC抗体をマウスの1％ 容量/容量を含有する冷ランニング緩衝液1mlを追加します。 4℃で30分間インキュベートし、ミクシィ静かに5分ごとにngの。
- 冷たいランニング緩衝液の6ミリリットルを追加します。 450×gで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、このステップを繰り返します。抗マウス二次抗体結合磁気ビーズの10％ 容量/容量を含有する冷ランニング緩衝液1mlで再懸濁細胞。静かに5分ごとに混合、15分間4℃でインキュベートします。
- 冷たいランニング緩衝液の6ミリリットルを追加します。 450×gで4℃で5分間遠心します。 5ミリリットルの冷ランニングバッファーで上清と再懸濁を捨てます。
- 磁気精製装置を用いて栄養膜細胞を分離します。負のポートで細胞を回収し、冷ランニングバッファーの20ミリリットルを追加します。
注：栄養膜細胞は複雑なHLA-ABCが含まれていない、したがって、他の細胞型から分離し、負の1ポートに向けられています。 - 450×gで4℃で5分間遠心します。上清を捨て、ゆっくりと20ミリリットル暖かい初代培養培地で細胞を再懸濁します。 usin細胞を数えますGAの血球計数器は、生存率を決定します。
- プレート以下の密度で細胞：0.15×10 6細胞/ウェルで96ウェルプレート、1.6×10 6細胞/ウェルで24ウェルプレートおよび4.5×10 6細胞/ウェルで6ウェルプレート。 37℃で、5％CO 2でプレートをインキュベートします。
- および/ または18を免疫細胞化学により16,17フローサイトメトリーによって栄養膜細胞の純度を確認してください。
注：免疫精製細胞の純度は、サイトケラチン7およびビメンチン17-19に対するFITC結合モノクローナル抗体を用いて決定しました。このプロトコルは、。Lanoixらにも詳述されている2008年7。 - 少なくとも4時間後、未付着細胞を除去した後、8％O 2（ 図2およびセクション2を参照）で構成されて正常酸素室にプレートを転送するために温かい培地で細胞を2回洗浄します。
2.インビトロ Inductio酸素正常状態のnおよび低酸素/再酸素化
- インキュベータ室操作（セット・アップするための図2Aを参照）。
- 層流フード中で、乾燥を避けるために、インキュベーターチャンバーの底に滅菌水を含むペトリ皿を置きます。その後、チャンバーの優れた棚の上に先に調製した細胞培養プレートまたはフラスコ（ステップ1.3.10）を配置。
- フード外、ガスホース（ 図2A：図5a、b及びc）にチャンバー（入口ポート）を取り付けたガス（8％O 2または0.5％O 2）のチューブに到達する（ 図2A：7）。チャンバーの両方の入口および出口ポートを開きます。このとき、ガスレギュレータ（ 図2（a）は ：4）閉じたままにする必要があります。
- 注意深くガス調整弁を開き（ 図2A：4）。完全にチャンバ内の空気を置換する25リットル/分の空気流で4分間のフラッシュ。
- チャンバーをフラッシュした後、次に入口をガスレギュレータを閉じ、OUチャンバーのtletポート。
- 流量計の出口ホース（ 図2A：5C）抜い室の入口ポートからの37℃で細胞培養インキュベーター内でチャンバを置きます。
- ステップ2.1.3の後にガス1時間でチャンバーを充填することにより、培養培地中で、現在のプレート、フラスコ内に存在し、溶存空気を交換してください。
- 繰り返して、他のガス組成のために2.1.6に2.1.1ステップ（ 例えば 、妊娠初期の栄養膜培養の9のための2％のO 2）。
- 酸素の割合（ 図2B-C）を確認
- チャンバ内（細胞なし）の細胞培養培地中の酸素の濃度を確認するために、酸素のアダプタに接続された酸素電極を使用します。電圧計に酸素電極を接続します。
- 既知の酸素含有量（ 例えば 、0％でのガスの溶液を曝露することによって、同じ溶液（ すなわち 、細胞培養培地）で検量線を作成し21％酸素）。測定値は各濃度について安定化された後、チャンバー内の媒体中に電極を導入します。
注：酸素濃度10内の任意の偏りを回避するために、同じ深さですべての測定を行います。
- 栄養芽細胞で正常酸素および低酸素/再酸素化の誘導。
- 適切な細胞培養フラスコ、プレートまたはペトリ皿に一次栄養膜細胞を追加した後、必要に応じて治療を行います。
- 並行して、チャンバ内に、特定の条件ごとに24時間（ 図3）を再生するために所望のガス混合物に細胞をさらします。
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Representative Results
経膣分娩で得られた正常期間胎盤から絨毛栄養膜細胞の単離と免疫精製は、1×10 8の生細胞が得られました。胎盤は、350グラムの重量を量った円盤状の形状と透明膜で4センチ、直径19センチ、でした。いいえ子葉奇形は検出されませんでした。臍帯は傍局在と56センチメートルの長さを有していました。純度は、ビメンチンおよびサイトケラチン7マーカーを用いたフローサイトメトリーによって評価しました。細胞の98％以上が免疫精製から得られた絨毛栄養膜細胞の純度を確認し、サイトケラチン7ビメンチンについて陰性および陽性でした。絨毛細胞栄養芽層細胞を1mMのメラトニンの存在下または非存在下で正常酸素条件下で96ウェル培養プレートに添加しました。絨毛細胞栄養芽層の生化学的分化は、以下のようにβヒト絨毛性ゴナドトロピン（β-hCGの）分泌のレベルを決定することによりモニターしました以前1,7,20,21説明。形態的分化とアポトーシスは、抗デスモプラキン及び抗カスパーゼ切断サイトケラチン18、中間フィラメント7,22を用いて免疫蛍光法により評価しました。 4日目（主に合胞体）に1日目（主に絨毛細胞栄養芽層）からの細胞培養培地を集め、遠心分離し、β-hCGのレベルは、上清中で測定しました。合胞体栄養細胞に排他的であるβ-hCGを、の生産は培養時間（ 図4）と増加しました。だけでなく、低酸素/再酸素化が、高酸素（> 20％のO 2）も活性化し、アポトーシス23。したがって、8％O 2濃度の採用は、絨毛栄養膜細胞は妊娠10の第三期中に露出されるであろうと酸素の量の代表的なものでした。 72時間で観察されたβ-hCGのレベルのピークは、これらの条件下で分化する絨毛細胞栄養芽層の能力を確認しました。メラトニンは、これらの研究条件下でのβ-hCGの分泌を変化させませんでした。 96時間でβ-hCGのレベルの低下は、おそらく初代培養5,7,22,24,25（ 図4）での長期間の後に増加する、栄養膜細胞のアポトーシスによって引き起こされました。それはβ-hCGのレベル26,27に影響を与えなかったので、DMSO（0.1％ 体積/体積）が選ばれました。メラトニンの保護的役割が強く、その抗酸化特性に関連していました。絨毛栄養膜細胞での培養による酸化ストレスの72時間後に低酸素/再酸素化。メラトニンの保護効果は、活性酸素種（ROS）検出試薬（ 図5A）を用いて評価しました。培養の96時間後に、栄養膜細胞は、ROSの総量を検出するために、5-10μMの（及び-6） -カルボキシ-2 '、7'-ジクロロアセテート（カルボキシ- H2DCFDA）で45分間インキュベートした8を生成しました 。低酸素/再酸素化を受けた絨毛栄養膜細胞が持っていましたかなり正常酸素下でのものと比較してROSレベル（54％）増加しました。この増加は、1mMのメラトニンで処理することにより逆転しました。また、酸素正常メラトニンの下で非処理絨毛栄養膜細胞（ 図5A）と同様であった、ROSレベル（ホメオスタシス）を調節しなかった。酸素正常メラトニンの下で酸化ストレスまたはβ-hCGの分泌のレベルを変化させなかったことを4と5Aショーを図通常の状態28,29の下での細胞の恒常性のない変調を示さない以前の研究を裏付ける栄養膜細胞、インチ
図1： 消化管遠心分離した後、4層が形成されています。上層は、消化液から構成されています。すぐ下、ウシ胎児血清（FBS）。両方の層は、真空ポンプで破棄されるべきです。下位層は、AReは以下のように構成される：線維芽細胞、白血球、マクロファージ、および栄養膜を含有する白色層と赤血球から成る底層。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 溶存酸素濃度の低酸素チャンバーと測定/計算の成分 （A）低酸素チャンバーとガスシリンダーアセンブリ：（1）ガスシリンダー、 （2）ガスレギュレータ。 （3）ガスホースクランプ。 （4）シリンダのガスホース; （5）インレットフィルタと、 （6）インレットホース; （7）流量計。 （8）アウトレットホースを。 （9）モジュラーインキュベーターチャンバー。既知の酸素濃度を用いて製造した標準曲線を用いて、細胞培養培地中での実際の酸素濃度（B）の計算。 （CおよびD）ソリューション「0％O 2」と「21％O 2」で得られた相対値は、細胞培養培地中の酸素濃度を決定するための線形関数としてグラフにプロットされている"？％O 2」。 表示するには、こちらをクリックしてください。この図の拡大版。
図3： モジュラーインキュベーションチャンバー内の細胞培養の一般的な実験設計正常酸素（8％O 2、5％CO 2、87％N 2）及び低酸素/再酸素化（H / R）（0.5％O 2、5％CO。 2; 94.5パーセントのN 2）が絨毛細胞栄養芽層（vCTB）と合胞体栄養細胞（STB）細胞中の病理学的状態を研究するために使用される条件です。とやメラトニンのない24時間毎に、培地（1 mM）を変更しますガス混合物が更新されます。 H / Rの下では、STBの細胞は4時間低酸素状態（0.5％O 2）を受け、その後、正常酸素（8％O 2）に戻ります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 絨毛栄養膜分化中のベータ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン（β-hCGの）分泌に対するメラトニンの効果絨毛細胞栄養芽層細胞を単離し、人間の健康用語胎盤から精製しました。細胞を、1mMのメラトニンまたはジメチルスルホキシド（DMSO、0.1％：ビヒクル対照）で96時間処理した正常酸素条件下（;、5％CO 2、8％O 2、87％N 2）。培養培地中のβ-hCGのレベルは、24、48、72及び96時間のO後、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって測定しました。F初代培養。レベルは十分に対応するそれぞれからの全細胞溶解物のタンパク質含有量に対して標準化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 低酸素/再酸素化にさらさ合胞体におけるメラトニンの抗酸化効果 （A）メラトニンの効果（M; 1 mM）の細胞内の活性酸素種に正常酸素下での合胞体栄養細胞中の（ROS）のレベル（N）または低酸素症/。培養の72時間後に誘導される再酸素化（HR）は、5-（および-6）によって評価したカルボキシ-2 '、7'-ジクロロアセテート（カルボキシ - H2DCFDA）蛍光。結果は、3つの異なる胎盤の平均±SDとして表現されています。 *** P <0.001（Lanoix ら。 8）。（B）低酸素/再酸素化によって誘導されるアポトーシスに対するメラトニンの推定上の保護に関与する細胞経路。プライマリ絨毛細胞栄養芽層細胞は、合胞体栄養細胞への分化を可能にするために、通常酸素下で72時間（8％O 2）で培養しました。細胞は、メラトニンまたはビヒクル対照の1 mMのに曝露し、その後、18時間の再酸素化期間（8％O 2）、続いて4時間、低酸素状態（0.5％O 2）に供しました。低酸素/再酸素化により誘導される酸化ストレスは、例えば、核因子カッパB（NF-κB）および低酸素誘導因子1（HIF-1）のような酸化還元敏感な転写因子を活性化させます。 NF-κBは、Rho関連活性化切断およびカスパーゼ9と3カスパーゼ3の活性化を含むミトコンドリアのアポトーシスのバックス/のBcl-2経路をトリガーのp53を誘導する、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ1（ROCK-1）、ポリ開裂（ADPリボース）ポリメラーゼ（PARP）およびDNA修復の機能障害。メラトニン防止低酸素/再酸素化によって引き起こされる酸化ストレスを減少させるために、強力な抗酸化物質として作用することによって、ミトコンドリアのアポトーシスの誘導は、S。この図は、Lanoix らから変更されている。2013年8。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 消化1 | 消化2 | 消化3 | 消化4 | |
| 修正されたHBSS（ミリリットル） | 150 | 100 | 75 | 75 |
| DNアーゼ（μL） | 300 | 200 | 150 | 150 |
| （0.1ミリグラム/μL） | ||||
| 硫酸マグネシウム（μL） | 150 | 100 | 75 | 75 |
| （800 mM）の | ||||
| CaCl 2（μL） | 150 | 100 | 75 | 75 |
| （100mMの） | ||||
| トリプシン（U） | 1824000 | 120万 | 96万 | 96万 |
| P / S（ml）を | 1 | 0 | 0 | 0 |
表1：消化ソリューションペニシリン及びストレプトマイシン（P / S） のための成分の量、。硫酸マグネシウム（MgSO 4）。塩化カルシウム（塩化カルシウム<サブ> 2）。デオキシIV（DNアーゼIV）。
表2：勾配溶液の調製のための密度遠心分離メディアソリューション、および修正されたHBSS必須のボリューム。
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Discussion
哺乳類では、胎児の発育が十分な胎盤機能に直接依存しています。健康障害の発生起源は、その後の人生で明らかに病気の原因は早期開発に胎盤が胎児プログラミング30-32で機構的な役割を持っていることをさかのぼることができ仮説に基づいています。胎盤は胎児の成長と発展の重要なメディエーターである：それは、栄養移動を規制する有害な暴露から保護し、主要な内分泌機能を有しています。 Kliman らによる開発。実行可能な一次細胞栄養層を分離するための再現可能な技術のは、正常および異常な胎盤機能6の研究で画期的な出来事です。多くの研究者は、胎盤生理18,20,33,34を理解するために、in vitroで特定の条件を再現するために、この技術を適応しています。 Petroff らによって記載されたように 、多くの手順は、単離されたCYTOの精製および堅牢な収率を保証するために重要です栄養膜細胞18。例えば、消化ステップは、生存可能な単離された細胞栄養層のより多く、その結果、そのような消化数の増加や長さ、ならびに消化酵素の組成および量に、1988年の技術の開発以来、いくつかの変更を受けています18。凍結保存、栄養膜細胞の純度および細胞付着7,34-36を改善するマイクロプレコーティングされたの使用を増加させるプロトコル後で免疫精製を、継続する可能性を可能にする：これは現在のプロトコルは、3つの主要な利点があります。既存の文献は、栄養膜細胞の分離技術の多様な修飾のいくつかの例が含まれていますが、密度遠心分離媒体の特性は、37が事実上変更されていないままです。アイソレーション/免疫精製の提示手法にはいくつかの重要なステップがあります。従って、純度を評価することが重要です各免疫精製の終わりに絨毛栄養膜細胞の。これは、マーカーとして適切な抗体を用いたフローサイトメトリーによって行うことができます。サイトケラチン7（絨毛性マーカー）、分化45（CD45）のクラスタおよびビメンチン（非栄養膜細胞のマーカー）は18,38,39。他の重要な側面は、すべてのセル20,40の収量と品質に影響を与える可能性が得られる胎盤、FBSおよび密度遠心分離メディア勾配と同様に、遠心分離速度の品質です。
広く使用されているが、本技術は避けられない制限があります。まず、免疫精製後に得られた生存細胞栄養層細胞の量が比較的低く、試験することができる可能な状態/処置の数の主な制限要因です。第二に、主要な栄養膜細胞の寿命が短く、合胞体栄養細胞へのインビトロ分化に密接に細胞viabiliの減少が続いています TYおよびアポトーシスの増加。アポトーシスは不可逆的文化7,41の約4日後にトリガされるため、 インビトロで増殖しない栄養膜細胞生存率の短い長さは、長期的な治療法の評価を制限します。第三に、interplacentalばらつきが大きいので、胎盤の比較的多数の統計的に解釈可能な結果を得るために必要とされます。一方、一次栄養膜培養物は、このような分化の様々な段階に応じて異なる細胞表現型における条件と治療の研究を可能にする合胞体に分化する細胞の能力、などのユニークな利点を持っています。このプロトコルで提示酸素化法は、高度に適応であり、その構成は、このような正常酸素9,42,43のためのより低い酸素分圧にさらされるべきである最初の学期の妊娠、からの一次栄養膜細胞の培養などの他の状況、に合わせて調整することができます。
ntent "> in vitroでヒト胎盤機能を研究するための他のアプローチがあります。スナップ凍結胎盤組織は、マルチオミックス解析を可能にしますが、例えば酸素勾配に起因する代謝変動を避けるために、胎盤マルチサイトのサンプリングを必要とし、中央から減少します外周44に絨毛。しかし、生栄養膜細胞生物学や行動が、このアプローチ45を用いて研究することはできません。絨毛外植片を構成する細胞の種類とその通信で全体絨毛構造を維持するという利点を持っていますが、治療に対する応答がに固有のものではありません栄養膜細胞23。例えばBeWo、JEG-3及びJARとして市販の栄養膜様絨毛癌細胞株は、そのような融合、分化、及び胎盤移送などの胎盤機能を研究するために使用することができる。しかし、最近の研究は、主にその遺伝子の発現を示します細胞栄養芽層およびBeWo腫瘍細胞はほとんど46-48相関している。THUS、一次絨毛栄養膜細胞培養は、その限界にもかかわらず、正常または異常な胎盤の生体内環境を模倣するユニークな利点を有しています。初代培養および絨毛外植片に絨毛栄養膜細胞を用いた研究は、低酸素症および低酸素/再酸素化が体系酸化ストレス、炎症、オートファジーとアポトーシス43,49-52のレベルの増加と栄養膜細胞の生存率、併用を減少させることを示しています。この低酸素/再酸素化細胞培養モデルは、具体的には、私たちは絨毛栄養膜細胞におけるメラトニンの抗酸化および抗アポトーシス効果を実証することができました。低酸素/再酸素化にさらされ、一次絨毛栄養膜細胞では、メラトニンは以下の防止：（ 図5B）、酸化ストレスの誘導を、抗酸化酵素活性を低下させ、レドックス感受性シグナル伝達経路の活性の増加、およびミトコンドリアのアポトーシスの誘導8。 HYpoxia /再酸素化モデルは、酸化ストレスによる損傷や、胎盤メラトニン合成が53減少し、子癇前症、などの妊娠合併症でその可能保護的役割におけるメラトニンの予防的役割を確認するユニークなツールです。メラトニンは、ターゲット54の広い範囲で強力な抗酸化物質です。また、治療薬としてメラトニンの安全性を大幅に確立されています。メラトニンとの有益な結果は、いくつかの研究者によって再現されているとメラトニンは、子癇前症または子宮内発育制限55,56によって複雑に妊娠中の潜在的な予防または治療的処置として、現在臨床試験中です。
結論として、単離、精製および高品質の栄養膜細胞の初代培養、一緒に低酸素/再酸素化の技術でよりよい酸化に関連した妊娠合併症を理解するための有望な実験的アプローチの広い範囲を可能にストレスや胎盤の健康を向上させます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
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