Introduction
인간 임신 중, 단핵 줄기 세포 인 cytotrophoblast 태반 세포는 빠르게 증식 또는 융모 extravillous cytotrophoblast 세포로 분화하거나. Extravillous cytotrophoblasts는 침략과 자궁 벽의 나선형 동맥을 개조. 융모 cytotrophoblasts 반면에, 다핵는 syncytiotrophoblast합니다 (syncytium) (1)를 형성하기 위해 증식 분화 퓨즈 계속한다. 융모 영양막 세포의 항상성의 유지 보수는 태아 웰빙과 건강한 임신을 위해 필수적이다. 사실, 융모 trophoblasts는 산소와 영양소의 모체 - 태아의 교환을 허용하고, 임신을위한 필수적인 호르몬을 생산하고 있습니다. 또한,는 syncytiotrophoblast는 모체 혈액 순환과 직접 접촉만을 셀형이며 필수적인 물리적 면역 장벽을 제공한다. 따라서,는 syncytiotrophoblast는 항상성 유지를위한 세포 사멸 및 교체를 받아야하고 AVO하기아이디 태반은 2-5 병리.
인간의 태반에서 차 융모 cytotrophoblasts를 분리하기 위해 1986 년 Kliman 등. (6)에 의해 개발 된이 기술은 융모 영양막 세포의 분화에 관여하는 분자 메커니즘 연구를 허용하여 태반 연구에 혁명을 일으켰습니다. 밀도 원심 분리 미디어에서 분리 한 다음 트립신과 DNase를 순차적 효소 digestions에 따라이 고전적인 기술은, (콜로 이달 실리카 입자는 폴리 비닐 피 롤리 돈에 의해 코팅, 또는 퍼콜)는 지금 융모 cytotrophoblast 세포를 분리하기위한 황금 표준으로 인식하고 있습니다. 이 기술은 자기 immunopurification, 이들 세포의 표면에 특이 항원의 발현 차이에 기초하여 비 융모 세포 융모 cytotrophoblasts 분리 절차에 의해 최적화 될 수있다. 우리 때문에 융모 membran 세포에 발현의 부재에 사람 백혈구 항원 ABC (HLA-ABC)를 선택한전자 7, 8.
태반은 임신 중 산소 수준에 극적인 변화를 겪는다 기관이다. 임신 초기에, 산소 비율은 생리 매우 낮음 (2 % O 2) 그러나 두 번째 및 세 번째 임신에서 산소화 온화한 수준 (8 % O 2)로 증가한다. 툴리 등. (9)는 태반 융모 내부 영양막 환경 시험 관내 재생 산소화 수준의 도전 및 변형도 표현형 변화를 초래할 수 있음을 설명했다. 따라서, 임신 8,9의 세 번째 임신시 태반 융모에있는 산소 장력을 모방 normoxia로 8 % 산소를 도입하는 것을 제안한다. Chen 등. (10)는 광범위 영양막 세포 배양 산소 장력과 관련된 여러 변수를 검토하고 pericellular 환경에서의 산소 농도를 결정하는 중요성을 입증 하였다. 융모의 산소 농도가 증가하는 경향혈관 생성에 기인. 계속 태반 융모 증가 혈류량과 과산화수소의 수준 (풍부한 반응성 산소 종) 혈관 형성 (11, 12)을 제어하는 중요한 신호이다. 임신 합병증, 혈관 생성의 결핍은 저산소증, 더욱 중요한 것은, 산소 간헐적 변동 (호출 저산소증 / 재산 소화)를 생성한다. 이러한 조건은 태반과 태아의 생존 13,14 타협 산화 스트레스의 비정상적인 증가로 이어집니다. 융모 cytotrophoblasts 그들이는 syncytiotrophoblast로 분화 될 때까지 정상 산소 상태 (8 % O 2)에서 유지되는 다음과 같이 영양막 세포가 저산소증 / 재산 소화의 에피소드 중 생체 내에서 받아야 변화는 시험 관내에서 모방 할 수 있습니다. 그들은 다음 normoxia (재산 소화)의 추가 18 시간 뒤에, 4 시간 동안 저산소 조건 (0.5 % O 2)을 실시한다. 이 저산소증 / 재산 소화 방식을 사용하여, 예를 trophoblasts특정 임신 합병증에서 관찰 된 바와 같이, 하이드 록시 에틸는, 산화 환원 상태 및 고유 세포 사멸 (8)의 증가 수준을 규제 완화. 따라서, 이는 태반 저산소증 / 재산 소화와 관련 임신 합병증을 방지하기 위해 새로운 예방 및 치료 방법을 평가하기 위해 시험 관내 모델에서 유용하다.
태반 세포는 산화 스트레스와 태반 기능 부전 (15)를 미연에 방지 할 수있는 능력 등 여러 가지 중요한 기능을 가지고 멜라토닌을 생산하고 있습니다. 여기, 우리는, 분자 세포 및 기능 수준 8시 태반의 영양막 세포에서 멜라토닌의 보호 효과를 입증하는 데 사용되는 실험 방법 및 세포 모델을 제시한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
태반은 정보를 환자의 동의와 윤리위원회 (CHUM - 세인트 루크 병원 INRS - 인스 티 투트 아르망 - Frappier의 승인을 즉시 미끼 - 세인트 루크 병원, 몬트리올, QC, 캐나다에서 복잡하지 않은 임신에서 자연 질식 분만 후 얻었다 라발, QC, 캐나다).
산모 Cytotrophoblast 세포의 1. 분리 및 정제
- 솔루션 및 미디어
- 보완하여 전송 매체를 준비 둘 베코의 이글의 중간 높은 포도당 1 % 부피 /의 부피 항생제와 (DMEM-HG) (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장 4 ℃에서 수정.
- 10 % 부피 / 부피 소 태아 혈청 (FBS), 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1 % 부피 / 부피 항생제 (10,000 단위 / 가진 DMEM-HG를 보충하여 일차 배양 배지를 준비 ml의 페니실린 G 4 ° C에서 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장. 37 ° C에 따뜻한 미디어 전용도.
- 생리 식염수 (0.9 % 중량 / 부피의 염화나트륨)의 4 L를 준비한다.
- HBSS (PH 7.4) 1x에서 25 mM의 HEPES를 추가하여 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 수정 준비합니다.
- (변성 (1.1.4에서 제조) HBSS, 황산 마그네슘 (MgSO4로), 염화칼슘 (CaCl2를) 트립신, 데 옥시 리보 뉴 클레아 제의 IV (DNase의 4) 및 1 % 부피 / 부피 항생제 분해 용액 신선 네병 준비 표 1에 나타낸 바와 같이 10,000 단위 / ㎖ 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트).
- 밀도 원심 분리 미디어 구배를 준비
- 10 % 부피 /의 부피 HBSS 10 배와 밀도 원심 분리 미디어를 보완하여 밀도 원심 분리 미디어 솔루션을 준비합니다.
- 표 2에 기재된 바와 같이, 밀도 원심 미디어 용액 변성 HBSS 14 분석 튜브를 준비한다.
- 적극적으로 그라데이션에 내용을 추가하기 전에 각각의 밀도 솔루션 (단계 1.1.6.2)를 섞는다. 부드럽게가장 높은 농도 (70 %)을 시작으로 연동 펌프 (1 ㎖ / 분)을 50 ㎖의 유리 원심 관에 밀도 솔루션을 추가한다. 구배의 각 층의 적절한 거리를 유지하기 관벽 용액을 배출하여 물방울을 피한다.
- 연동 펌프의 부재에서, 파스퇴르 피펫으로 매우 부드럽게 층을 적용합니다.
- 실행중인 버퍼를 보완하여 최종 실행 버퍼를 준비 (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트), 항진균제 2 % 부피 / 부피 항생제 /과 (재료의 표 참조). 4 ℃에서 보관하십시오.
- 융모 cytotrophoblast 분리
참고 : 사용 무균 수술 장비, 유리, 피펫, 플라스크 등- 융모 cytotrophoblast 분리 날에, 37 ℃의 수욕 및 FBS 70 ㎖ (단계 1.1.5에서)를 digestions 용액을 가온. 주 : FBS 50ml의 사용은 digestions 및 인터럽트 할일단 해동 얼음에 배치 할 수있는 냉동 공정 (1.2.22) 20 ml의 나머지.
- 전달 후, 수 (이하, 1 시간) 빨리 (1.1.1)에서 빙냉 전송 매체에 실험실 태반을 가져온다.
- 취소 전송 매체 및 액체 쓰레기통에 태반 혈액. 태반의 무게를 차가운 생리 식염수에 담가.
- 측정하고 다음과 같은 기능 분석 : 탯줄의 길이; 탯줄 현지화; 태반 길이, 폭, 모양 (타원형 원반 모양); 막 색상; 떡잎 구조 병변. 주 : 데이터는 결과 섹션에 표시됩니다.
- (코드 주위에 추가 1cm 반경 원과의 기지에서, 즉)의 태반 삽입과 함께 탯줄을 잘라. 이상 조직 학적 분석 학적 조직 고정액 수용액 (포르말린 10 %) 300 ㎖에 담근다.
- 5 × 5 × 5cm의 큐브로 전체 태반을 잘라. 식염수 졸 (4 시간 X ~ 1 분) 철저하게 세척생리 식염수가 선명해질 때까지의 ution (0.9 %)는 혈액 세포를 제거한다. 액체를 씻어 버리십시오.
- 시계 유리, 혈관 석회화를 제거하는 태반 막과 말하다 조직을 제거합니다. 집게로 단단히 혈관을 잡고 Metzenbaum 가위의 뒷면을 사용하여 조직을 제거합니다.
- 흡인 여과기에 다진 태반을 놓습니다. 식염수 버퍼의 약 100 ㎖로 씻어. 다진 조직의 35g (보트와 규모 무게 사용 플라스틱)를 얻을 수있다 - (30)가 될 때까지 닦지 계속합니다. 35g 제제 - 필요한 경우, 추가로 30 세까지 얻었다 태반의 나머지 말하다. 이 시간 동안 얼음에 무게 보트에 다진 조직을했습니다.
참고 :이 단계는 1 시간에 약 45 분 소요됩니다.
- 흡인 여과기에 다진 태반을 놓습니다. 식염수 버퍼의 약 100 ㎖로 씻어. 다진 조직의 35g (보트와 규모 무게 사용 플라스틱)를 얻을 수있다 - (30)가 될 때까지 닦지 계속합니다. 35g 제제 - 필요한 경우, 추가로 30 세까지 얻었다 태반의 나머지 말하다. 이 시간 동안 얼음에 무게 보트에 다진 조직을했습니다.
- trypsinizing 플라스크에 35g 다진 태반 조직 - 30를 추가합니다. 전송 150 trypsinizing 플라스크에 준비된 소화 용액 1 (표 1)의 용액과 잘 혼합한다.
- 에 trypsinizing 플라스크를 배치무 50 사이클 / 분의 속도로 30 분 동안 수욕 진탕 수동 trypsinizing 플라스크를 균일 소화 매 5 분 동안 혼합한다.
- 제 소화의 끝에, 수욕에서 trypsinizing 플라스크를 분리하고 태반 조직을 1 분 침강 대 (45)를 기울. 10 ㎖의 멸균 피펫으로 제거하고 상층 액의 약 80 ml의 폐기합니다. 조직을 흡입하지 마십시오.
- 전송합니다 trypsinizing 플라스크 소화 용액을 100㎖의 2 (표 1); 잘 혼합 단계 1.2.9를 반복합니다.
- 제 소화의 끝에, 수욕에서 trypsinizing 형틀을 제거하고 1 분 정도 45 ° 기울. 10 ㎖의 멸균 피펫으로, 80 ml의 상층 액을 제거하고 부드럽게 셀 스트레이너 (100 μm의 메쉬)와 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. FBS 2 ㎖ 원심 분리 튜브가 가득마다 들어있는 비이커에 여과하여 상층 액을 이동.
- 기술 한 바와 같이 제 소화를 수행병행하여 75 ml의 소화 용액 (3)을 사용하여 초 소화 (1.2.11 및 1.2.12)은, 소화 2 1.2.16.1에 단계 1.2.15를 수행합니다.
- 소화 용액 (4) (75 ㎖)를 사용하여 제 소화 정확히 제 소화를 수행하지만, 상등액의 최대 양을 수집한다. 소화 3 병렬 1.2.16.1에 단계 1.2.15를 수행하고, 마지막으로 소화 4.
- 제 (digestions이 3 내지 4), 13.5 mL의 상층 액 부분으로 한 15 mL의 원심 분리 튜브에 나누어지는 각 부품. 22.8 cm 길이 유리 파스퇴르 피펫으로 아주 부드럽게 천천히 개별 층을 생성하기 위해 각 튜브의 하단 FBS 1.5 ㎖에 놓는다. FBS와 상층 액을 혼합하지 마십시오. 실온에서 1,250 × g으로 20 분 동안 브레이크없이 튜브를 원심 분리기.
참고도 1에 나타낸 바와 같이 원심 분리 후에, 4 층의 튜브를 볼 수 트립신 및 영양막 세포의 분리 과도한 세포 분해를 피한다.. - 진공 펌프와 aspir먹고 두 층 사이에 백탁 막을 포함 상청액 (분해 용액) 및 FBS 층을 버린다. 따뜻한 세포 배양 배지 1 mL를 펠렛합니다 (trophoblasts과 적혈구 층) 재현 탁한다 (단계 1.1.2 아니오 FBS없이 HEPES로).
- 모든 관에서 재 부유 세포를 수집하고 1 관에서 그들을 결합. 튜브 모든 digestions이 끝날 때까지 실온에 서 보자. 참고 : 모든 digestions 후, 보통의 수율은 재현 탁 세포 (소화 당 하나)의 3 관입니다.
- 따뜻한 세포 배양 배지 15 ml의에 볼륨을 확인합니다. 실온에서 10 분 동안 1250 × g으로 원심 분리기. 진공 펌프와 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 흡입하지 마십시오.
- 부드럽게 따뜻한 세포 배양 배지 1 ㎖로 3 개의 튜브에서 얻은 펠렛을 재현 탁. 1 관에서 자신의 콘텐츠를 풀. 8 ml의 수득 따뜻한 세포 배양 배지 부피를 완료.
- 아주 부드럽게 분리 래드에 세포 현탁액 레이어파스퇴르 피펫 ient. 실온에서 507 XG에 30 분 동안 브레이크없이 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 다시 조명 기울기에 세포의 다른 레이어를 식별합니다. 밀도 원심 분리 매체의 50 % - 레이어 영양막 세포를 포함하는 40 사이에 세포 오염을 찾습니다. 진공 펌프로, 상위 계층들 (> 50 %)을 제거한다.
- 파스퇴르 피펫 관심 층에있는 세포를 수집하고 50 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 세포 배양 배지 50 ㎖에 볼륨을 확인합니다. 상온에서 1,250 XG에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 멸균 조건 하에서, 상층 액을 제거 FBS 20 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산. 얼음 멸균 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 2.22 mL를 추가하고 젖혀 부드럽게 혼합한다. 저온 바이알에 세포 현탁액의 분취 량 1.5 ㎖를, -80 ° C에서 밤새 냉동 및 액체 질소 탱크로 옮긴다.
<리> 영양막 세포 정화 - 헹굼 및 실행 버퍼와 제조업체의 지침에 따라 자기 정화 장비에 새 필터 컬럼을 설치합니다. 음 1, 양 1, 양 2 포트를 청소하고 제조업체의 지침에 따라 각 포트에서 50 ml의 튜브를 소개하는 "클린 프로그램"을 수행합니다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 빠르게 단계 1.2.22에 동결 된 세포를 해동. 50 ㎖의 튜브에 세포를 전송 천천히 차가운 완충액 20 ㎖로 재현 탁 셀. 450 XG에 5 분, 4 ℃로의 튜브를 원심 분리기.
- 상층 액을 버린다. 차가운 버퍼로 세척 단계를 반복합니다. 생존을 결정하는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 원심 분리를 반복합니다 (5 분, 4 ° C에서 450 XG의 경우). 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 1 % 권 / 마우스 항 - HLA-ABC 항체의 부피를 포함하는 차가운 버퍼의 1 ML을 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 품어, 믹시부드럽게 매 5 분 ng를.
- 차가운 버퍼 6 ML을 추가합니다. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 뜨는을 취소하고이 단계를 반복합니다. 10 % 부피 / 항 - 마우스 이차 항체 결합 된 자성 비드의 체적을 포함하는 차가운 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포. 부드럽게 매 5 분을 혼합, 15 분 동안 4 ° C에서 품어.
- 차가운 버퍼 6 ML을 추가합니다. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 5 ml의 차가운 버퍼에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오.
- 자기 정화 장비를 사용하여 영양막 세포를 분리합니다. 부정적인 포트에서 세포를 수집하고 차가운 버퍼 20 ㎖를 추가합니다.
주 : 영양막 세포는 복잡한 HLA-ABC 포함하지 않으며, 따라서 음의 1 포트쪽으로 다른 유형의 세포로부터 분리에 관한 것이다. - 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 부드럽게 20 ㎖ 따뜻한 차 배지에서 세포를 재현 탁. 저기서 세포를 계산조지아 혈구는 가능성을 확인합니다.
- 판 다음 밀도의 세포 : 0.15 × 10 6 세포 / 웰에서 96 웰 플레이트, 1.6 × 10 6 세포 / 웰에서 24 웰 플레이트 4.5 × 10 6 세포 / 웰 6 웰 플레이트. 37 ° C와 5 % CO 2에서 접시를 품어.
- 16, 17 계측법 및 / 또는 18 면역 세포에 의해 흐름에 의해 영양막 세포의 순도를 확인합니다.
주 : immunopurified 세포의 순도는 사이토 케라틴 -7- 멘틴 및 17-19에 대해 FITC 접합 된 모노클로 날 항체를 사용하여 측정 하였다. 이 프로토콜은 Lanoix 등의 알 잘 상세한입니다. 2008 년 7. - 적어도 4 시간 후 비 부착 세포를 제거하고 8 % O 2 (도 2, 섹션 2 참조)로 구성된다 normoxia 챔버에 플레이트를 전송하는 따뜻한 배지로 두 번 세포를 씻어.
2. 체외 유도 전열Normoxia의 n 및 저산소증 / 재산 소화
- 인큐베이터 챔버 작업 (셋업에 대한도 2A 참조).
- 층류 후드에서 건조 함을 방지하기 위해 인큐베이터 챔버의 바닥에 멸균 수를 함유하는 페트리 접시로; 그 실의 우수한 가구에 미리 제조 세포 배양 플레이트 또는 플라스크 (단계 1.3.10)을 배치했다.
- 후드 이외의 가스 호스 챔버 (입구 포트) 연결 (그림 2A : 5A, B 및 C) 가스 (8 % O 2 0.5 % O 2)의 튜브에 도달하는 (그림 2A : 7). 챔버의 양쪽 입구와 출구 포트를 엽니 다. 이 때, 가스 레귤레이터 (그림 2A : 4) 폐쇄 상태를 유지해야합니다.
- 조심스럽게 가스 조절 밸브를 엽니 다 (그림 2A : 4). 25 L의 공기 흐름을 4 분 동안 세척 / min으로 완전히 챔버 내부의 공기를 대체한다.
- 챔버를 세척 한 후, 그 입구 및 OU를 가스 조절기를 닫고챔버의 tlet 포트.
- 유량계 출구 호스 빼고 (도 2a를 : 5C) 상기 챔버의 입구로부터 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터 챔버를 배치했다.
- 단계 2.1.3 후 가스를 1 시간으로 챔버를 작성하여 배지에서 현재 판, 플라스크에 존재하는 용존 공기를 교체합니다.
- 를 반복하여 다른 가스 조성에 대한 2.1.6에 2.1.1 단계 (예를 들어, 2 % 임신 초기의 영양막 세포 배양 9 O 2).
- 산소 비율을 확인 (도 2B-C)
- 상기 챔버 내부 (셀)없이 세포 배양 배지 내의 산소의 농도를 확인하기 위해, 산소 어댑터에 연결된 산소 전극을 사용한다. 전압계에 산소 전극을 연결합니다.
- 동일한 용액에서 검량선을 작성 (예를 들어, 세포 배양 배지) 공지의 산소 함량 (기체로 용액에 노출시킴으로써 예를 들어, 0 % 및21 % 산소). 판독은 각 농도에 대해 안정화 된 후, 챔버 내의 매질에 전극을 소개한다.
주 : 산소 농도 10 편견을 피하기 위해 동일한 깊이에서 모든 측정을 수행.
- trophoblasts에서 normoxia 및 저산소증 / 재산 소화 유도.
- 적절한 세포 배양 플라스크, 플레이트 또는 페트리 접시에 차 영양막 세포를 추가 한 후, 필요에 따라 치료를 수행합니다.
- 병행하여, 챔버 내부 특정 조건마다 24 시간 (도 3)를 재생하기 원하는 가스 혼합물에 셀을 노출.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
질식 분만에 의해 얻어진 일반 용어 태반에서 분리 및 융모 cytotrophoblast 세포의 immunopurification 1 × 10 8 가능한 세포를 얻었다. 태반은 350g 무게 원반 모양과 투명 막에 4cm 높이 직경 19cm였다. 더 자엽 기형은 발견되지 않았다. 탯줄은 paracentral 현지화 및 56cm의 길이를 가지고 있었다. 순도는 멘틴 및 사이토 케라틴-7 마커를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 평가되었다. 세포의 98 % 이상은 immunopurification 얻은 융모 trophoblasts 세포의 순도를 확인하는 사이토 케라틴-7 멘틴 대한 음성 및 양성이었다. 융모 cytotrophoblast 세포는 1mM의 멜라토닌의 존재 또는 부재하에 정상 산소의 조건 하에서 96 웰 배양 플레이트에 첨가 하였다. 융모 cytotrophoblasts의 생화학 적 분화는 β-인간 융모 성 성선 자극 호르몬의 수준을 결정하여 모니터링 하였다 (β-hCG의) 분비로이전 1,7,20,21 설명했다. 형태 학적 분화와 세포 사멸을 방지 desmoplakin 및 안티 카스파 제 절단 사이토 케라틴 18 중간 필라멘트 7,22를 사용하여 면역 형광에 의해 평가되었다. 4 일 (주로 syncytiotrophoblasts)에 1 일 (주로 융모 cytotrophoblasts)에서 세포 배양 매체는 수집 원심 분리 및 β-hCG의 수준은 상층 액에서 측정 하였다되었다. 는 syncytiotrophoblast에 배타적 인 β-hCG를, 생산은 배양 시간 (그림 4) 증가 하였다. 뿐만 저산소증 / 재산 소화하지만, 고농도 산소 (> 20 % O 2) 또한 활성화 아폽토시스 23. 따라서, 8 % O 2 농도 채택 융모 영양막 세포 임신 (10)의 세 번째 임신 동안 노출 될 수있는 산소의 양을 대표했다. 72 시간 관찰 β-hCG의 농도의 피크는 이러한 조건에서 분화 융모 cytotrophoblasts의 용량을 확인했다.멜라토닌은 이러한 연구 조건에서 β-hCG의 분비를 변경하지 않았다. 96 시간에서 β-hCG의 수준의 감소는 가능성이 차 문화에 장기간 5,7,22,24,25 (그림 4) 이후 증가 영양막 세포의 세포 사멸에 의해 발생했다. 이 β-hCG의 수준 (26, 27)에 영향을 미치지 않았기 때문에 DMSO (0.1 % 부피 / 부피)가 선정되었다. 멜라토닌의 보호 역할은 강력 항산화 특성과 관련되었다. 융모 영양막 세포 배양에 의한 산화 스트레스의 72 시간 후 저산소증 / 재산 소화. 멜라토닌의 보호 효과는 활성 산소 종 (ROS) 검출 시약 (도 5a)으로 평가 하였다. 배양 96 시간 후, 영양막 세포를 10 5- μM (및 -6) 7'-dichlorodihydrofluorescein 아세테이트 (카르복시 H2DCFDA)은 ROS의 총량은 8 제조 검출하는 '-2- 카르복시로 45 분 동안 배양 하였다. 저산소증 / 재산 소화을 시행 융모 영양막 세포는 있었다크게 normoxia 아래에 비해 ROS 수준 (54 %)를 증가했다. 이러한 증가는 1mM의 멜라토닌 처리함으로써 역전되었다. 또한, normoxia 멜라토닌에서. 비 처리 융모 영양막 세포 (그림 5A)과 유사했다 ROS 수준 (항상성), 변조 normoxia에서 멜라토닌이 산화 스트레스 또는 β-hCG의 분비 수준을 변경하지 않았다 4, 5A 쇼도하지 않았다 영양막 세포의 세포에있는 정상 상태 (28, 29)에서 세포 항상성 더 변조를 보여주는 이전의 연구를 확증.
그림 1. 소화 튜브를 원심 분리 한 후, 4 층이 형성되어있다. 상층 소화 용액으로 구성되고; 바로 아래의 소 태아 혈청 (FBS). 두 층을 진공 펌프로 폐기되어야한다. 낮은 층은 아칸소즉 다음과 같이 구성된 : 섬유 아세포, 백혈구, 대식 세포 및 trophoblasts을 함유하는 백색 층; 적혈구로 구성된 바닥 층. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
.도 2 저산소증 챔버와 용존 산소 농도의 측정 / 계산 구성 요소 (A) 저산소증 챔버와 가스 실린더 어셈블리 (1) 가스 실린더; (2) 가스 조절기; (3) 가스 호스 클램프; (4) 실린더 가스 호스; (5) 입구 필터; (6) 입구 호스; (7) 유량계; (8) 출구 호스; (9) 모듈 식 인큐베이터 챔버. 공지 된 산소 농도로 제조 한 표준 곡선을 이용하여 세포 배양 배지에서 실제의 산소 농도 (B) 계산. (C 및 D)용액 "0 % O 2"및 "21 % O 2"에서 얻어진 상대 값은 세포 배양 배지에서의 산소 농도를 결정하는 선형 함수 "? %의 O 2"로 그래픽 플롯. 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전.
그림 3 :. 모듈 형 보육 회의소 Normoxia에서 세포 배양의 일반 실험 설계 (8 % O 2, 5 % CO 2, 87 % N 2) 및 저산소증 / 재산 소화 (H / R) (0.5 % O 2, 5 % CO 2, 94.5 %의 N 2) 융모 cytotrophoblast (vCTB)과는 syncytiotrophoblast (STB) 세포 병리학 적 조건을 연구하는 데 사용 조건입니다. 또는 멜라토닌없이 모든 24 시간, 매체 (1 mM)을 변경가스 혼합물을 갱신한다. H / R에서 STB 세포는 4 시간 동안 저산소증 (0.5 % O 2)를 거쳐 다음 normoxia (8 % O 2)로 돌아갑니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 산모 영양막 세포의 분화 동안 베타 - 인간 태반 성 성선 자극 호르몬 (β-hCG의) 분비에 멜라토닌의 효과 산모 cytotrophoblast 세포를 분리하고 인간의 건강 용어 태반에서 정제 하였다. (5 % CO 2에서 87 %의 N이 8 % O 2) 정상 산소의 조건 하에서 (차량 제어 DMSO 0.1 %) 세포를 1 mM의 멜라토닌 또는 디메틸 술폭 시드와 96 시간 동안 처리 하였다. 배지에서 β-hCG의 농도는 24, 48, 72 및 96 시간 후에 오 효소 면역 분석법 (ELISA)으로 측정 하였다F 주 문화. 레벨이 잘 대응하는 각각의 전체 세포 용 해물의 단백질 함량을 표준화 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 저산소증 / 재산 소화 (A) 멜라토닌 (M; 1 ㎜)의 효과에 노출는 syncytiotrophoblast에서 멜라토닌의 항산화 효과 세포 내 활성 산소 종에 (ROS) normoxia 아래는 syncytiotrophoblast 세포 수준 (N) 또는 저산소증 / 배양 72 시간 후에 유도 재산 소화 (HR)가, 5- (및 -6)에 의해 평가 하였다 ω- 카르복시 - 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein 디 아세테이트 (카르복시 H2DCFDA) 형광. 결과는 3 가지 태반의 평균 ± 표준 편차로 표현된다 *** P <0.001 (Lanoix, 등. 8). (B) 저산소증 / 재산 소화 - 유도 된 세포 사멸에 대한 멜라토닌 추정의 보호에 관련된 세포질 통로. 주 융모 cytotrophoblast 세포 normoxia에서 72 시간 (8 % O 2)는 syncytiotrophoblast에 차별화를 허용하기 위해 배양 하였다. 세포는 멜라토닌 또는 비히클 대조군 1 mm로 노출 된 후 18 시간의 재산 소화 시간 (8 % O 2)이어서 4 시간 동안 저산소증 (0.5 % O 2)을 행 하였다. 저산소증 / 재산 소화에 의한 산화 스트레스는 핵 인자 카파 B (NF-κB)와 저산소증 유도 인자 1 (HIF-1)와 같은 산화 환원에 민감한 전사 인자를 활성화합니다. NF-κB는의 Rho 관련된 활성화 절단 및 카스파 제 9와 3 카스파 제 3의 활성을 포함하는 미토콘드리아 아폽토시스 백스 / BCL-2 경로를 트리거 p53의를 유도 코일 된 코일을 포함하는 단백질 키나제 1 (ROCK-1) 폴리 절단 (ADP 리보오스) 중합 효소 (PARP) 및 DNA 수리의 손상. 멜라토닌 방지저산소증 / 재산 소화에 의한 산화 스트레스를 줄일 수있는 강력한 항산화 제 역할을하여 미토콘드리아 아폽토시스 유도 S는. 이 그림은 Lanoix 등에서 수정되었습니다. 2013 년 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 소화 (1) | 소화 (2) | 소화 3 | 소화 4 | |
| 수정 된 HBSS (㎖) | (150) | (100) | (75) | (75) |
| DNase의 (μL) | (300) | (200) | (150) | (150) |
| (0.1 밀리그램 /μL) | ||||
| 황산 (μL) | (150) | (100) | (75) | (75) |
| (800 밀리미터) | ||||
| 염화칼슘 2 (μL) | (150) | (100) | (75) | (75) |
| (100 밀리미터) | ||||
| 트립신 (U) | 1824000 | 1,200,000 | 960000 | 960000 |
| P / S (㎖) | 1 | 0 | 0 | 0 |
표 1 : 소화 솔루션 페니실린과 스트렙토 마이신 (P / S)에 대 한 재료의 수량;. 황산 마그네슘 (MgSO4로); 염화 칼슘 (염화칼슘 <서브> 2); 디옥시리보 뉴 클레아 제 IV (DNase의 4).
표 2 : 밀도 원심 분리 미디어 솔루션의 볼륨과 그라디언트 솔루션의 제조를 위해 HBSS 필수 수정.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
포유 동물에서 태아의 발달은 적절한 태반 기능에 직접적으로 의존한다. 건강 장애의 발달 기원은 이후의 삶에서 나타난 질환의 원인은 초기 개발 및 태반 태아 프로그래밍 30-32에서 기계적 역할을하고 있음을 다시 추적 될 수 있다는 가설에 기초한다. 그것은 영양 전달을 조절 유해한 노출 방지 및 주요 내분비 기능을 가지고 : 태반은 태아의 성장과 발전의 중요한 매개체이다. Kliman 등으로 개발. 실행 가능한 기본 cytotrophoblasts을 분리하는 재현 기술의 정상 및 비정상 태반 기능 (6)의 연구의 이정표입니다. 많은 연구자 태반 18,20,33,34 생리를 이해 시험 관내에서 특정 조건을 재현하기 위해이 기술을 채택했다. Petroff 등의 알에 의해 설명 된 바와 같이. 많은 단계가 격리 된 사이토의 정제하고 강력한 수율을 보장하는 것이 중요합니다영양막 세포 18. 예를 들어, 소화 단계가 가능한 절연 cytotrophoblasts 더 많은 수의 결과 등 digestions의 증가 된 수 및 길이뿐만 아니라, 소화 효소의 조성과 양을 1988의 기술의 개발 이후 여러 변형을받은 18. 이 전류 프로토콜은 세 가지 주요 장점이 있습니다 가능성 cytotrophoblast 순도의 사용 증가 프로토콜 나중에 면역 자기 정화, 계속 허용 냉동 보존, 세포 부착 7,34-36을 향상 마이크로 플레이트 사전 코팅. 기존 문헌 cytotrophoblast 세포의 분리 기술의 다양한 변형 예는 여러 가지가 있지만 밀도 원심 매체의 특성 (37)는 사실상 변형되지 않은 남아있다. 절연 / immunopurification의 발표 기술은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 따라서, 그 순도를 평가하는 것이 중요각 immunopurification 끝에 융모 cytotrophoblast 셀. 사이토 케라틴-7 (융모 마커), 분화 (45) (CD45) 및 멘틴의 클러스터 (비 영양막 세포 마커) 18,38,39 : 마커로 적절한 항체를 사용하여 세포 계측법이는 흐름에 의해 수행 할 수 있습니다. 다른 중요한 양태는 모든 셀 20,40의 수율과 품질에 영향을 미칠 수 얻어진 태반 품질의 FBS 밀도 원심 분리 배지 구배뿐만 아니라, 원심 분리 속도이다.
널리 사용되지만, 본 기술은 피할 수없는 한계가있다. 우선, immunopurification 후의 cytotrophoblasts 생존 세포의 양이 상대적으로 낮고, 테스트 될 수있는 가능한 상태 / 치료의 수가 주요 제한 요인이다. 둘째, 기본 영양막 세포의 수명이 짧고는 syncytiotrophoblast로 체외 분화 밀접 셀 viabili의 감소로 이어진다 타이 및 세포 사멸의 증가. 세포 사멸이 비가 역적 문화 7,41의 약 4 일 후에 발생하기 때문에 체외에서 증식하지 않습니다 영양막 세포의 세포 생존 능력의 짧은 길이는, 장기 치료의 평가를 제한합니다. 셋째, interplacental 변동이 크고, 그래서 태반 비교적 많은 수의 통계적 해석 결과를 얻는 것이 필요하다. 한편, 기본 영양막 세포 배양은 분화의 다양한 단계에 따라 상이한 세포 표현형의 조건으로 치료 연구를 허용 syncytium로 분화 할 수있는 세포의 능력과 같은 독특한 장점을 갖는다. 이 프로토콜에 제시된 산소 방법은 매우 적응력과 구성은 normoxia 9,42,43에 대한 낮은 산소 긴장에 노출되어야한다 임신 초기 임신에서 차 영양막 세포의 배양과 같은 다른 상황에 맞게 조정 할 수 있습니다.
ntent는 "> 체외에서 인간 태반의 기능을 연구하는 다른 방법이 있습니다. 스냅 동결 태반 조직은 멀티 오 믹스 가능하지만, 중앙에서 감소 산소 구배로 인해 예 신진 대사 변화에 대한 방지하기 위해, 태반 다중 샘플링을 필요로 분석 외주 (44)에 융모. 그러나, 거주 영양막 세포 생물학 및 동작이 방법 (45)을 이용하여 연구 할 수 없다. 산모의 구성 세포 유형 및 통신로 전체 융모 구조를 유지하는 장점이 있지만, 치료에 대한 반응이 고유하지 않은 영양막 세포 23. 시판 영양막 형상 융모막 암종 세포주 등 BeWo, JEG-3 JAR 등은 융합, 분화 및 태반 전송으로 태반 기능을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 그러나, 최근의 연구는 일차 유전자 발현 보여 cytotrophoblasts BeWo 및 종양 세포가 제대로 46-48 상관된다. THUS 차 융모 영양막 세포 배양은 한계에도 불구하고, 정상 또는 비정상 태반의 생체 내 환경을 흉내 낸의 독특한 장점을 갖는다.차 문화와 융모 외식에 융모 영양막 세포를 사용하는 연구는 저산소증과 저산소증 / 재산 소화 체계적으로 산화 스트레스, 염증, 자식 작용과 세포 사멸 43,49-52의 증가 수준 영양막 세포의 세포 생존, 동반 감소 것을 보여줍니다. 이 저산소증 / 재산 소화 세포 배양 모델, 즉, 우리가 융모 영양막 세포에서 멜라토닌의 항산화 제 및 항 - 세포 사멸 효과를 입증 할 수있다. 저산소증 / 재산 소화에 노출 차 융모 영양막 세포에서 멜라토닌은 다음 방지 : 산화 스트레스의 유도를, 항산화 효소 활성, 산화 환원에 민감한 신호 전달 경로의 활성이 증가하고, 미토콘드리아 세포 사멸의 유도 (그림 5B)를 감소 8. 숨바꼭질poxia / 재산 소화 모델은 산화 스트레스에 의한 손상 및 태반 멜라토닌의 합성이 53 감소 자간전증 등의 임신 합병증의 가능한 보호 역할 멜라토닌의 예방 역할을 확인하는 유일한 도구입니다. 멜라토닌은 타겟 (54)의 넓은 범위의 강력한 항산화 제이다. 또한, 치료제로 멜라토닌의 안전성이 크게 설정되어있다. 멜라토닌과 함께 유익한 결과를 여러 연구자들에 의해 재현하고 멜라토닌은 자간전증 또는 자궁 내 성장 제한 (55, 56)에 의해 복잡 임신의 가능성이 예방 또는 치료로 임상 시험 중이다.
결론적으로, 분리, 정제 및 저산소증의 기술과 함께 세포 cytotrophoblast 고품질의 일차 배양에서 / 재산 소화가 잘 산화 관련 임신 합병증을 이해 유망한 실험 방법의 광범위한 사용스트레스와 태반의 건강을 향상시킬 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Splinter Forceps Fine 41/2 in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
| Gauze Sponge 10 cm x 10 cm | Cardinal Health | 361020733 | |
| Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8 L) |
| Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114 mm diameter) |
| Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
| Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
| Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
| 250 ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
| Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
| 50 ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
| 15 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 50 ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 10 ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
| Cell Strainer 100 μm Nylon | Corning | 431752 | |
| Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
| 500 ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0.22 µm / medium and HBSS preparation | |
| 2 ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
| Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
| Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
| Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
| Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
| Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution |
| Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution |
| Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888 U |
| Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000 U |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100 mM |
| Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800 mM |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
| Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml |
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50 ml |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
| Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
| Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
| Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
| Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
| Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
| Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
| Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
| 50 mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
| Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
| Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
| 17 mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
| Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester's composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
| Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
| Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
| ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
| β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
| Anti-Vimentin purified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
| Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |
References
- Vaillancourt, C., Lanoix, D., Le Bellego, F., Daoud, G., Lafond, J. Involvement of MAPK signalling in human villous trophoblast differentiation. Mini Rev Med Chem. 9 (8), 962-973 (2009).
- Gauster, M., Moser, G., Orendi, K., Huppertz, B. Factors involved in regulating trophoblast fusion: potential role in the development of preeclampsia. Placenta. 30, Suppl A 49-54 (2009).
- Huppertz, B., Kadyrov, M., Kingdom, J. C. Apoptosis and its role in the trophoblast. Am J Obstet Gynecol. 195 (1), 29-39 (2006).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: the smart killer: the human trophoblast as a model. Mol Cell Endocrinol. 348 (1), 1-11 (2012).
- Huppertz, B., Frank, H. G., Reister, F., Kingdom, J., Korr, H., Kaufmann, P. Apoptosis cascade progresses during turnover of human trophoblast: analysis of villous cytotrophoblast and syncytial fragments in vitro. Lab Invest. 79 (12), 1687-1702 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F., 3rd, Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Lanoix, D., Beghdadi, H., Lafond, J., Vaillancourt, C. Human placental trophoblasts synthesize melatonin and express its receptors. J Pineal Res. 45 (1), 50-60 (2008).
- Lanoix, D., Lacasse, A. A., Reiter, R. J., Vaillancourt, C. Melatonin: The watchdog of villous trophoblast homeostasis against hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress and apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 381 (1-2), 35-45 (2013).
- Tuuli, M. G., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Review: Oxygen and trophoblast biology--a source of controversy. Placenta. 32, Supple 2 109-118 (2011).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Pericellular oxygen concentration of cultured primary human trophoblasts. Placenta. 34 (2), 106-109 (2013).
- Roberts, J. M., Hubel, C. A. Is oxidative stress the link in the two-stage model of pre-eclampsia. Lancet. 354 (9181), 788-789 (1999).
- Burton, G. J., Jauniaux, E. Oxidative stress. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 287-299 (2011).
- Ji, L., Brkic, J., Liu, M., Fu, G., Peng, C., Wang, Y. L. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Mol Aspects Med. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental stress and pre-eclampsia: a revised view. Placenta. 30, Suppl A 38-42 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., Soliman, A., Vaillancourt, C. Maternal and placental melatonin: actions and implication for successful pregnancies. Minerva Ginecol. 66 (3), 251-266 (2014).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21 (7), 733-741 (2000).
- Potgens, A. J., Gaus, G., Frank, H. G., Kaufmann, P. Characterization of trophoblast cell isolations by a modified flow cytometry assay. Placenta. 22 (2-3), 251-255 (2001).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol Med. 121, 203-217 (2006).
- Maldonado-Estrada, J., Menu, E., Roques, P., Barre-Sinoussi, F., Chaouat, G. Evaluation of Cytokeratin 7 as an accurate intracellular marker with which to assess the purity of human placental villous trophoblast cells by flow cytometry. J Immunol Methods. 286 (1-2), 21-34 (2004).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol Biol. 550, 73-87 (2009).
- Mounier, C., Barbeau, B., Vaillancourt, C., Lafond, J. Endocrinology and cell signaling in human villous trophoblast. Methods Mol Biol. 550, 89-102 (2009).
- Chen, B., et al. Pomegranate juice and punicalagin attenuate oxidative stress and apoptosis in human placenta and in human placental trophoblasts. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (9), 1142-1152 (2012).
- Reti, N. G., et al. Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures. Cell Tissue Res. 328 (3), 607-616 (2007).
- Pidoux, G., et al. Biochemical characterization and modulation of LH/CG-receptor during human trophoblast differentiation. J Cell Physiol. 212 (1), 26-35 (2007).
- Pidoux, G., et al. ZO-1 is involved in trophoblastic cell differentiation in human placenta. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (6), 1517-1526 (2010).
- Williams, J. L., Fyfe, G. K., Sibley, C. P., Baker, P. N., Greenwood, S. L. K+ channel inhibition modulates the biochemical and morphological differentiation of human placental cytotrophoblast cells in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (4), 1204-1213 (2008).
- Schild, R. L., Schaiff, W. T., Carlson, M. G., Cronbach, E. J., Nelson, D. M., Sadovsky, Y. The activity of PPAR gamma in primary human trophoblasts is enhanced by oxidized lipids. J Clin Endocrinol Metab. 87 (3), 1105-1110 (2002).
- Menendez-Pelaez, A., Reiter, R. J. Distribution of melatonin in mammalian tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J Pineal Res. 15 (2), 59-69 (1993).
- Perrone, S., Stazzoni, G., Tataranno, M. L., Buonocore, G. New pharmacologic and therapeutic approaches for hypoxic-ischemic encephalopathy in the newborn. J Matern Fetal Neonatal Med. 25, Suppl 1 83-88 (2012).
- Nelissen, E. C., van Montfoort, A. P., Dumoulin, J. C., Evers, J. L. Epigenetics and the placenta. Hum Reprod Update. 17 (3), 397-417 (2011).
- Barker, D. J. Intrauterine programming of adult disease. Mol Med Today. 1 (9), 418-423 (1995).
- Barker, J. R., Thomas, C. F., Behan, M. Serotonergic projections from the caudal raphe nuclei to the hypoglossal nucleus in male and female rats. Respir Physiol Neurobiol. 165 (2-3), 175-184 (2009).
- Yui, J., et al. Functional, long-term cultures of human term trophoblasts purified by column-elimination of CD9 expressing cells. Placenta. 15 (3), 231-246 (1994).
- Kilani, R. T., Chang, L. J., Garcia-Lloret, M. I., Hemmings, D., Winkler-Lowen, B., Guilbert, L. J. Placental trophoblasts resist infection by multiple human immunodeficiency virus (HIV) type 1 variants even with cytomegalovirus coinfection but support HIV replication after provirus transfection. J Virol. 71 (9), 6359-6372 (1997).
- Knofler, M., Stenzel, M., Husslein, P. Shedding of tumour necrosis factor receptors from purified villous term trophoblasts and cytotrophoblastic BeWo cells. Hum Reprod. 13 (8), 2308-2316 (1998).
- Douglas, G. C., King, B. F. Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres. J Immunol Methods. 119 (2), 259-268 (1989).
- Li, L., Schust, D. J. Isolation, purification and in vitro differentiation of cytotrophoblast cells from human term placenta. Reprod Biol Endocrinol. 13, 71 (2015).
- Stenqvist, A. C., et al. An efficient optimized method for isolation of villous trophoblast cells from human early pregnancy placenta suitable for functional and molecular studies. Am J Reprod Immunol. 60 (1), 33-42 (2008).
- Potgens, A. J., Kataoka, H., Ferstl, S., Frank, H. G., Kaufmann, P. A positive immunoselection method to isolate villous cytotrophoblast cells from first trimester and term placenta to high purity. Placenta. 24 (4), 412-423 (2003).
- Lanoix, D., Vaillancourt, C. Cell culture media formulation and supplementation affect villous trophoblast HCG release. Placenta. 31 (6), 558-559 (2010).
- Vaillancourt, C., Lafond, J. Human embryogenesis: overview. Methods Mol Biol. 550, 3-7 (2009).
- Armant, D. R., et al. Human trophoblast survival at low oxygen concentrations requires metalloproteinase-mediated shedding of heparin-binding EGF-like growth factor. Development. 133 (4), 751-759 (2006).
- McCaig, D., Lyall, F. Hypoxia upregulates GCM1 in human placenta explants. Hypertens Pregnancy. 28 (4), 457-472 (2009).
- Burton, G. J., et al. Optimising sample collection for placental research. Placenta. 35 (1), 9-22 (2014).
- Lanoix, D., et al. Quantitative PCR pitfalls: the case of the human placenta. Mol Biotechnol. 52 (3), 234-243 (2012).
- Bilban, M., et al. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31 (11), 989-996 (2010).
- Novakovic, B., et al. Wide-ranging DNA methylation differences of primary trophoblast cell populations and derived cell lines: implications and opportunities for understanding trophoblast function. Mol Hum Reprod. 17 (6), 344-353 (2011).
- Burleigh, D. W., et al. Microarray analysis of BeWo and JEG3 trophoblast cell lines: identification of differentially expressed transcripts. Placenta. 28 (5-6), 383-389 (2007).
- Hung, T. H., Skepper, J. N., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J. Hypoxia-reoxygenation: a potent inducer of apoptotic changes in the human placenta and possible etiological factor in preeclampsia. Circ Res. 90 (12), 1274-1281 (2002).
- Heazell, A. E., Moll, S. J., Jones, C. J., Baker, P. N., Crocker, I. P. Formation of syncytial knots is increased by hyperoxia, hypoxia and reactive oxygen species. Placenta. 28, Suppl A 33-40 (2007).
- Heazell, A. E., Lacey, H. A., Jones, C. J., Huppertz, B., Baker, P. N., Crocker, I. P. Effects of oxygen on cell turnover and expression of regulators of apoptosis in human placental trophoblast. Placenta. 29 (2), 175-186 (2008).
- Chen, B., Longtine, M. S., Nelson, D. M. Hypoxia induces autophagy in primary human trophoblasts. Endocrinology. 153 (10), 4946-4954 (2012).
- Lanoix, D., Guerin, P., Vaillancourt, C. Placental melatonin production and melatonin receptor expression are altered in preeclampsia: new insights into the role of this hormone in pregnancy. J Pineal Res. 53 (4), 417-425 (2012).
- Galano, A., Tan, D. X., Reiter, R. J. Melatonin as a natural ally against oxidative stress: a physicochemical examination. J Pineal Res. 51 (1), 1-16 (2011).
- Alers, N. O., Jenkin, G., Miller, S. L., Wallace, E. M. Antenatal melatonin as an antioxidant in human pregnancies complicated by fetal growth restriction--a phase I pilot clinical trial: study protocol. BMJ Open. 3 (12), 004141 (2013).
- Hobson, S. R., Lim, R., Gardiner, E. E., Alers, N. O., Wallace, E. M. Phase I pilot clinical trial of antenatal maternally administered melatonin to decrease the level of oxidative stress in human pregnancies affected by pre-eclampsia (PAMPR): study protocol. BMJ Open. 3 (9), 003788 (2013).
