Summary
שיטה פשוטה להקים השליה אדם מן המעלה הראשונה (villous) ותרבויות איבר decidual מתואר. תרבויות איבר Villous ו decidual הם כלי שלא יסולא בפז ללימוד בפתוגנזה בממשק האם והעובר האדם. זיהום עם חיידקים ליסטריה חיידק תאי פקולטטיבי מודגם.
Abstract
השליה מראה מידה רבה של השתנות אנטומיים interspecies. כדי להבין בצורה הטובה ביותר בביולוגיה והפתופיזיולוגיה של השליה האנושית, זה הכרחי כדי לעצב ניסויים באמצעות תאים ורקמות אנושיים. יתרון של תרבות איברים הוא תחזוקה של תלת ממדי (3D) מבנה ארגוני ואת מטריקס. מטרת השיטה המתוארת כאן היא הקמה מוצלחת של תרבויות איברי רקמות vivo לשעבר אדם הריונית ותחזוקת התרבות הבריאה שלהם עבור 72-96 שעות. הפרוטוקול מפרט את העיבוד המיידי של מחקר-הסכמתי, שלית דגימות decidual הטרי מסוויטת ההפעלה. אלה הם דוגמאות בשפע כי הייתה להיות מושלכת אחרת. הוראות מפורטות על אוסף סטרילי של דגימות אלה, כוללים פרטים מורפולוגיים על איך לבחור רקמות מתאימות להקים תרבויות איבר 3D, מסופקות. רקמות villous ו decidual השליה הם microdissected לתוך 2-3 מ"מ 3 חתיכותוהניח בנפרד על מסנני transwell מרופדת מטריקס ותרבותי במשך כמה ימים. Villous ותרבויות איבר decidual מתאימים גם לחקר האינטראקציה מארח הפתוגן האנושי. לעומת אורגניזמים מודל אחרים, תרבויות האנושיות אלה הן יתרון במיוחד לבחון מנגנון של זיהום עבור פתוגנים הממחישים דפוסים משתנים ספציפי מארח. כדוגמא, אנחנו מדגימים זיהום של תרבויות איבר שלית decidual עם משמעות הקלינית, החיידקים ליסטריה פתוגן חיידקי תאיים פקולטטיבי.
Introduction
זיהום ודלקת בממשק האם והעובר מהווים מקור מרכזי לתחלואה ותמותה בנשים וילדים. ההבנה כיצד פתוגנים להדביק רקמות אלה היא קריטית להתפתחות של אסטרטגיות רומן למנוע ולטפל במחלות כגון צירים מוקדמים ומוות עובר. עם זאת, השתנות interspecies גבוהה של הממשק האם והעובר מסבכות חקירה ניסויית. יתר על כן, פתוגנים חיידקים ביותר להראות הספציפיות המארח, ובכך במודלים של בעלי חיים רבים אינם יכולים לשחזר מחלות זיהומיות אנושי לגמרי. אורגניזמים מסוימים (אינפלואנזה המופילוס, typhi סלמונלה, כולרה Vibrio, ועוד רבים אחרים) הם פתוגניים אך ורק בני אדם, בעוד שאחרים, כגון חיידקים ליסטריה, להראות רמה בינונית יותר של מארח סגולי 1. סגולי מארח תועד בהיבטים רבים של בפתוגנזה, כולל קולוניזציה 2, הפצה 3, התחמקות חיסונית 4 5 מזין. לכן, זה הוא בעל חשיבות עליונה לבחירת מערכות מודל מארח אופטימליות.
לחן של תאים העובר בדם האם, השליה היא איבר שמתפתח במהירות במהלך ההריון 6. במונחים פשוטים, השליה האנושית בנויה עובריים "villous" מבני עץ דמוי הטבולים בדם אימהי. גז וחילופי מזין מתרחשים על פני שכבות של תא עובריים מיוחדות הנקראות trophoblasts המרפד את השטח של עצי villous. רירית ברירית הרחם האימהי, כינה רירית הרחם אצל הנקבה שאינן בהריון, הופך מבנית והן מבחינה תפקודית לתוך decidua כדי להתאים את יחידת fetoplacental. עצים Villous מעוגנים לתוך הרחם על ידי trophoblasts extravillous (EVT) הנודדים עיגון עמודות התא לתוך decidua. ממשק האם והעובר, ולכן, מורכב decidua ואת השליה.
טכניקת תרבות האיבר מתוארת כאןנעשה שימוש כדי לבחון היכן וכיצד פתוגנים אנושיים משמעות קלינית, כולל L. monocytogene s ו Toxoplasma gondii, לחצות את מחסום השליה 2,7. תרבויות איבר vivo לשעבר אלה לשכפל באדריכלות רקמות vivo, הן ללא ספק פיסיולוגי מאוד מערכות מודל רלוונטיות עבור placentation אדם. טכניקות תרבות נוספות כוללות explants איבר שלם, פרוסות איברים, רקמות או תא גזע organoids מוטבע-מטריקס 3D. לקבלת פרטים אודות אפשרויות אלה, עיין בדיקה שנערכה לאחרונה מקיפה 8. יש לציין כי פרוטוקול זה הוא עבור התרבות הנפרדת של decidua ו villi שליה. ללימוד האינטראקציה בין תאי שליה ותאי decidual, טכניקת תרבות שיתוף עשויה להיות מועדפת. אנו מפנים את הקורא המעוניין לטכניקת שיתוף התרבות villous-decidual שתוארה לעיל, בשימוש על ידי חוקרים לומדים שיפוץ כלי דם decidual בתיווך trophoblast 9-11.
Protocol
ניסויים נערכו על פי העקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי. מחקר זה אושר על ידי הדירקטוריון סקירה מוסדיים באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (CHR # 11-05,530). כל החולים ספקו בכתב הסכמה מדעת לאיסוף דגימות לניתוח שלאחר מכן. רקמות נאספות כמו דגימות מזוהות-דה.
הערה: החוקר חייב לקבל את אישור ועדת הבדיקה בבני אדם המוסדית שלהם. הדרתם של דגימות המבוססות על אנומליות בהיסטוריה או שליה הריונית תשתנה בהתאם לצרכימים של כל מחקר ספציפי.
הערה: תנאי בטיחות מתאימים (biosafety ברמה 2) צריך להיות מנוצל עבור כל הצעדים בפרוטוקול זה 12.
1. הכנה, לפני יום האוסף
- מסננות / מלקחי חיטוי לאיסוף, ומספריים / מלקחיים דיסקציה מיקרו.
- כן נפח נאות (500 מיליליטר לכל דגימה) של חיץ לשטוף (מחדשFER טבלה 1 למתכון).
- כן נפח נאות (100 מיליליטר לכל דגימה) של 0.22 מיקרומטר תקשורת אוספת סטרילי, מסונן (עיין בטבלת 1 למתכון).
- Aliquot תאי מטריקס (ECM, עיין בטבלה של ריאגנטים לפרטים נוספים) עבור אחסון לטווח ארוך.
- ECM חנות בצורה מוצקה ב -20 מעלות צלזיוס. לביצועים הטובים ביותר, להימנע הפשרת הקפאה חוזרת. בקבוק הפשרה לפתרון צמיג ב 4 ° C, ולהכין 300 aliquots μl בחדר הקר עם טיפי פיפטה צוננים. aliquots חנות ב -20 ° C.
2. אוסף של רקמות טריות
זהירות: כשעובדים עם רקמה אנושית טריים, החוקרים חייבים לעקוב אחרי אמצעי זהירות יוניברסל (OSHA) למניעת העברת פתוגנים bloodborne, וחייב קיבלו הכשרה מוסדית ראויה. ציוד אישי מגן פרופר, כולל כפפות, הגנת עיניים, ומעילים מעבדה נחוצים.
- תַחְבּוּרָהautoclaved-מסננות (אחד לכל הדגימה),-מלקחיים autoclaved, חיץ לשטוף (קרונית), מדיה אוסף (25 מ"ל לכל הדגימה צינור חרוטי 50 מ"ל), בקבוק ספריי, אקונומיקה 10%, 70% אתנול, מגש איסוף רקמות, לנוכל , ודלי קרח / מצנן לבית חולים / קליניקה.
הערה: דוגמאות מתקבלות מרחב מחקר המיועד ממוקם בחדר קרוב חבילת ההפעלה. במנדף בתרבית רקמה סטרילית אינו נדרש, אבל האוסף אמור להתרחש בהקדם ואת החוקר צריך כראוי לטהר משטחים, כמפורט להלן. - קרונית מקום לשטוף חיץ סמוך לכיור, ולרסס ברז עם אקונומיקה 10% ו -70% אתנול. זכוכית רקמות מקום מגש איסוף על מקור האור (כרית אור או תיבת אור), לטהר עם אקונומיקה 10% ו -70% אתנול. אפשר לייבוש באוויר.
- יש דגימות ה- carry קלינאי מהסוויטה ההפעלה לחדר הכנת הדגימה. ליד הכיור, יוצקים את הדגימה על גבי מסננת סטרילי המוחזק ביד, לשטוף רקמות כמה פעמים היהחיץ h, ולהעביר הדגימה כולו במאגר למגש זכוכית מחוטא גבי מקור האור.
הערה: הערכת רקמות על ידי המטפל היא העדיפות הגבוהה ביותר, ובכך את הפעולות הבאות מבוצעות רק לאחר הקלינאיים ציינו בעל פה כי הוא / היא סיימה את הערכה. - שימוש במלקחיים סטרילי כדי לבחור villi השליה decidua (איורים 2 א ו 3A) לאיסוף, ולהעביר להפריד 50 מ"ל צינורות חרוטי. לייבל הצינורות עם גיל ההריון.
הערה: הגילאים הריונית מועדפת פחות מ 9 שבועות ופחות מ -16 שבועות עבור השליה decidua, בהתאמה. במוסד, רק חלק קטן של כל דגימה הוא רכש למטרות מחקר, כמו רקמה נאותה חייבת להישאר לאבחון פתולוגי קליני. - דגימה לאגור ולהעביר על קרח למעבדת המחקר.
- כדי לאסוף יותר הדגימה אחד, לטהר את מגש הזכוכית כמתואר לעיל עם אתנול אקונומיקה 10% ו -70% בין Collection של כל דגימה.
3. הכנת צלחות תרבות איברים
הערה: השלבים הבאים יש לבצע באמצעות טכניקה סטרילית במנדף בתרבית רקמה. הוא אידיאלי עבור מיקרוסקופ לנתח כדי להיות ממוקם בתוך שדה סטרילי. עם זאת, זה לא הכרחי כל עוד דיסקציה מייקרו מבוצעת בזריזות, ומכשירים הם טבלו לעתים קרובות באתנול 70%.
- בקבוקון ECM הפשרה (ים) על קרח. לדלל את ECM 1: 1 עם התקשורת אוסף קר כקרח, ומערבבים על ידי pipetting. פיפטה לאט, כדי למנוע החדרת בועות. כל גם צלחת בתרבית רקמה 6 גם דורש 100 μl של השעיה זו ויהיה להכיל 3-4 תרבויות איברים.
- מוסיף מקום transwell (גודל נקבובי 0.4 מיקרומטר) לבאר כל צלחת בתרבית רקמה היטב 6.
- מעיל כל Transwell להכניס בשכבה דקה (100 μl) של ההשעיה ECM / מדיה.
- מניחים את הצלחת על קרח מיד להמשיך establishment של תרבויות איברים. לחלופין, להכין צלחת לפני לאוסף רקמות, ובמקרה לעטוף אותו בפיסקה סרט ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר. חפץ יותר מ -6 שעות לא מומלץ כמו ECM יתייבש.
הקמת 4. של תרבויות איברים
הערה: שלב זה מתאר כיצד למקם תרבויות איבר decidual ותרבויות איבר villous ב transwells נפרד. הרקמות אינן באות במגע. חוקרים מעוניינים טכניקת שיתוף בתרבות שבה decidua ו villi נמצאים בקשר ישיר אחד עם השני, יכולים להתייחס לעבודות קודמות בספרות 9,10.
- לשטוף דגימות פעמים במדיה אוספים, צנטריפוגות XG ב 1000 בין כל שטיפה. העברת רקמות צלחת ומניחים פטרי סטרילית על הבמה של מיקרוסקופ לנתח. שמור צלחת 6-היטב על קרח סמוך המיקרוסקופ.
- רקמות מיקרו לנתח עם מספריים מלקחיים לנתח ספרינגר סטרילי, כדי לבסס את התרבות איבר 2-3 מ"מ villouss (איור 2 א).
הערה: תרבויות איבר Villous הם קטנים, היטב vascularized "עצים" עם 2 או 3 סניפים, ועם trophoblast extravillous בולט (EVT) עמודות תא 11. חשוב לנצל רקמות villous רק דגימות <9 שבוע בשליש הראשון, כמו הפלישה של trophoblasts extravillous לתוך ECM בלט בעיקר בגילאים צעירים אלה 13. - בחר villi היטב vascularized עם עמודות תא EVT בולטות. עמודות תא EVT הם דמיינו כמו בולבוסים, "מטושטש", "רכים" קצוות (עיינו ראשי חץ באיור 2 א).
- שימוש במלקחיים סטרילי להעביר 3 או 4 עצי villous לתוך כל transwell. התאם ענפים כדי עץ ממוצבת שטוח גבי ECM וענפים בכבדות נפרד.
- מיקרו-לנתח רקמות decidual עם לנתח מספריים מלקחיים ספרינגר סטרילי, להקים 3 מ"מ 3 תרבויות איבר decidual (איור 3 א).
הערה: דוגמאות מכילות שני דיססוגים tinct של רקמות decidual, parietalis decidua ואת decidua capsularis (משמאל ושברי רקמות ימינה, בהתאמה, איור 3 א). - חתוך במספריים כדי ליצור 3 מ"מ 3 חתיכות של parietalis decidua. capsularis decidua אינו משמש תרבויות אלה. שימוש במלקחיים כדי להקניט משם כל דם אימהי קורש.
- שימוש במלקחיים סטרילי להעביר 3-4 חתיכות של decidua לתוך כל transwell.
- הוסף 1ml של תקשורת האוספת אל תחתית הבאר. דגירה צלחת לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2
- בניסויים שבהם חשוב לחקות מתח החמצן השליה הראשון השליש רגיל, לשמור על תרבויות איבר villous היפוקסיה יחסית (3% O 2).
הערה: אפשרויות מעבדה כוללות תאי חממת היפוקסיה קטנים שמתאימות בתוך חממות קיימות, או חממה תלת-גז מציג גז N 2 חיצוני להנמיך ריכוז חמצן. - הוסף 1 מ"ל של Villous או בינוני Decidual (Table 1) לראש של transwell לאחר 12-16 שעות של תרבות.
הערה: היעדר התקשורת במהלך הלילה הראשון בתרבות מאפשר העמודים extravillous תא trophoblast לפלוש (תרבות villous), ועבור רקמה (הן villous ו decidual) להיות מוטבע בבטחה ECM. מניסיוננו, תרבויות איבר decidual נשארים קיימא במשך 72 שעות ועוגב villous תרבויות במשך 96 שעות. אנו ממליצים נקודות קצה ניסיוניות שנופלים בפרק זמן זה. ראה טבלה מס '1 עבור הרכב בינוני Villous ו Decidual. יש בינוני Villous אחוז גבוה של FBS, בעוד בינוני Decidual הוא השלים עם הורמונים הריון (פרוגסטרון, 17β-אסטרדיול) המקיימות המדינה decidualized (טבלה 1).
5. הכנת L. חיידקי תרבויות
הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט על אחסון לטווח ארוך של L. חיידקים, ואת התרבות וצמיחה של תיהאורגניזם של ב עירוי לב המוח (BHI) מרק אגר, עיין וואנג et al. 14
- בחר אחת ל חיידקי המושבה מהצלחת BHI אגר מפוספס לחסן 3 מ"ל של מרק BHI.
- דגירת L. חיידקי תרבות הלילה (16 שעות), במצב אלכסוני, על 30 מעלות צלזיוס.
הערה:. תנאי התרבות אלה מאפשרים התפתחות חיידקים להגיע בשלב נייח L. חיידקים הוא והולקה בשוט על 30 מעלות צלזיוס, דבר מגדיל תא מארח פלישה 15.
6. זיהום של תרבויות איברים עם L. חיידקי
- PBS ו Villous חם או בינוני Decidual (טבלה 1) עד 37 מעלות צלזיוס.
- להשתמש בפינצטה סטרילי כדי להסיר כל חתיכות תרבות איבר שלא לפלוש לתוך ECM, ולכן הם צפים בתוך הבאר.
- בזהירות לשאוב תקשורת מתחתית transwell. לשטוף transwells העליונים והתחתונים פעמיים על ידי pipetting בעדינות 1 מ"ל של המלחמהמ PBS לתוך הבאר, aspirating בין בזהירות. בעדינות פיפטה 1 מיליליטר של תקשורת אנטיביוטיקה ללא Villous או Decidual כדי transwell העליון והתחתון. היזהר שלא להפריע את תרבות האיברים.
- תן רקמות דגירה בתקשורת ללא אנטיביוטיקה עבור לפחות שעה על מנת להבטיח כי אנטיביוטיקה הוסרה.
הערה: בשלב נייח הצפיפות של L. תרבות חיידקים היא כ 1 x 10 9 יחידות מושבה להרכיב (CFU) לכל מיליליטר. מספר החיידקים המשמשים להדביק תרבויות איבר יש לקבוע באופן אמפירי כדי לענות על צרכים ניסיוני. - עבור סוג בר L. חיידקי ניסויי זיהום שגרו להראות פלישה חזקה עם דילול 1:50 של הלילה (חיידקי L. 7 4 x 10 ב 1 מיליליטר של תקשורת לכל טוב). Resuspend את המספר המתאים של חיידקים במדיום Villous או Decidual ללא אנטיביוטיקה.
- התקשורת לשאוב מלמעלה של transwells. בעדינות להוסיף 1 מ"ל של הבידוד. דגירה צלחות ב 37מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 כדי לאפשר פלישה חיידקי.
- סר חיידקים תאיים על ידי aspirating תקשורת מן transwells העליון ותחתון. לשטוף בארות פעמים עם PBS החם. הוסף 1 מ"ל של Villous או מדיה Decidual בתוספת 50 מיקרוגרם מ"ל -1 גנטמיצין. דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
הערה: L. חיידקים הוא חיידק תאי פקולטטיבי שיכול לצמוח במדיום תאי, לגדול בתוך תאים, להתפשט מתא אל תא מבלי לגשת במרחב התאי. יש גנטמיצין שפעת bactericidal על L. התאי חיידקים, ובכך מאפשר מדידת תאיים L. חיידקי צמיחה התפשטה תרבות איבר 16.
הערה: לשחזור L. זיהום חיידקים של תרבויות איבר villous ואת decidua מתרחש עם זמני דגירת hr 5. השעה של דגירה לפני תוספת של גנטמיצין ניתן לשנות על בסיס הצרכים ניסיוני ואת ability של האורגניזם לפלוש לרקמות. כדי להבין טוב יותר את אתרי אנטומי הפגיעים ביותר לזיהום, פעמי דגירה קצרות ניתן להשתמש 2. - לשמור על צלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עבור תקופת הניסוי. שנה שלמה תקשורת בכל טוב יומי.
הערה: מניסיוננו, L. חיידקי תרבויות איבר decidual -infected נשארים קיימא עבור 48 תרבויות hr ועוגב villous במשך 72 שעות.
קציר של איברים 7. תרבויות עבור Histopathology
- הכן פתרון חדש של paraformaldehyde 4% על ידי דילול 10 מ"ל של אמפולה המניה 16% ב 30 מ"ל PBS. חנות paraformaldehyde 4% ב 4 ° C, מוגן מפני אור, ולהשתמש תוך שבוע אחד. מביאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
- תקשורת לשאוב transwell העליון ותחתון. בעדינות ולשטוף בארות פעמים עם PBS בטמפרטורת חדר. בעדינות להוסיף paraformaldehyde 1ml 4% למעלה transwell כדי לכסות את התרבות איבר לחלוטין.
- לִדגוֹרב 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. הימנע פעמי דגירה כבר, שכן הדבר עלול להוביל יתר קיבוע של הרקמה.
- paraformaldehyde לשאוב ובארות שטיפה פעמיים עם PBS בטמפרטורת החדר. שבץ תרבויות איבר קבוע במדיום אוקטובר, הקפאה, וסעיף על cryostat ( "קבוע קפוא"). באופן כללי, רקמה קפוא קבועה קלה יותר בסעיף מאשר רקמה קפוא ללא קיבוע לפני.
הערה: לקבלת פרוטוקול מלא על הטבעת אוקטובר חתך קפוא, נא לגשת סעיפים רלוונטיים מתוך פרוטוקולים שפורסמו 17,18. בהתאם לצרכים ניסיוניים וציוד מעבדה זמין ואחסון, רקמה עשוי להיות במקום מוטבע פרפין מחולק על 19 microtome. - בהמשך להכין שקופיות רקמות מכתים Hematoxylin & Eosin שגרתית, immunofluorescence, או 18,20,21 אימונוהיסטוכימיה.
Representative Results
איור 1 (שונה מן זלדוביץ & Bakardjiev 22) דיאגרמה של השליה רלוונטי ואנטומיה הרחם. איור 2 מראה ברוטו נציג ותמונות היסטולוגית של villi השליה, בעוד איור 3 מדגים רקמות decidual.
פרוטוקול זה ראשון מתאר את האוסף של השליה טריה ורקמות decidual בבית החולים או במרפאת. הדגימה שנאספה היא תערובת של שליה עוברת (villi) ורכיבי רחם אימהיים (decidua). לאחר השטיפה עם מאגר המכיל אנטיביוטיקה רחבת טווח ו antifungals, הדגימה כולו נבדק לפי העין באמצעות תיבת אור. Villi ו decidua ממוקמים צינורות נפרדים והובלו על קרח למעבדה. במעבדה, מיקרוסקופ לנתח משמש להעריך את המאפיינים המורפולוגיים קנס של רקמה בריאה. תמונות נציגvillous (איור 2 א) ורקמות decidual (איור 3 א) אשר נרכשו באמצעות מיקרוסקופ לנתח עם שני מקורות אור מתכווננת חיצוניים מוצגים לעיון.
תרבויות איבר Villous נוצרות מתוך דגימות שליש ראשונות. תרבויות מורכבות עצי villous מסוף קטנים עם 2-6 סניפים. חשוב לנתח סניפים villous, המסתיימים עמודות extravillous trophoblast והם היטב vascularized. תכונות אלה נתפסות "רכים" או "מטושטשים" קצות סניף (ראשי חץ), ואת הגוון ליניארי ורוד-אל-אדום הקלוש כי קורסים דרך הענף העץ בצד שמאל האיור 2 א. לעומת זאת, כלי הדם ואת trophoblasts extravillous אינם דמיינו בקלות על העץ בצד ימין של התמונה, אשר יהיה הכי מוצלח לתרבות. במהלך היום של התרבות הראשון, trophoblasts extravillous נודד לתוך ECM, tהוס עיגון העצים villous לתוך המטריצה על transwell.
תרבויות איבר Decidual נוצרות מתוך דגימות שליש שניות ראשונות ותחילה. רירית הרחם כולו הופך decidua מאוד זמן קצר לאחר ההשתלה. באופן ספציפי יותר, decidua basalis מגדיר את רירית הרחם ישירות שבבסיס אתר שליה / השתלה, capsularis decidua מגדיר ריריים המכסה את העובר, ולאחר parietalis decidua מתייחסת שארית רירית הרחם. ויזואליזציה תחת מיקרוסקופ לנתח מראה כי הדגימה הריונית מוקדם מורכב בעיקרו parietalis decidua ואת decidua capsularis (משמאל ושברי רקמות ימינה, בהתאמה, ב איור 3 א). Capsularis decidua ניתן להפריד בקלות על ידי הטבע דק, קרומי שלה. עבור תרבויות איבר, parietalis decidua חיתוך עד 3 מ"מ 3 שברי במספריים לנתיחה מיקרו adheלהשכרה הדם הקרוש מוסר עם מלקחיים.
לאחר דגירת הלילה, רקמות נגועות ל חיידקים. פרוטוקול הזיהום כמתואר לעיל, מתבסס על assay גינת גנטמיצין בשימוש ללמוד צמיחה תאית והתפשטות של חיידקים תאיים פקולטטיבי 16. תרבויות איברים במדיום ללא אנטיביוטיקה מודגרת עם L. חיידקים במשך 5 שעות. תרבויות נשטפות עם PBS סטרילי כדי להסיר חיידקים מן המדיום. לאחר מכן, גנטמיצין מתווסף לחסל אורגניזמים תאיים. ספרות לפני מהמעבדה שלנו בשימוש immunofluorescence מיקרוסקופיה confocal כדי לקבוע לוקליזציה רקמות חיידקים ב timepoints השונה לאחר ההדבקה 2. תרבויות איברים הם שטופים ב PBS, קבוע paraformaldehyde 4%, ואו קפוא-מוטבע בינוני אוקטובר ומאוחסנים ב -80 ° C, או פרפין מוטבע לאחסן בטמפרטורת החדר. סעיפי רקמות יכולים להיות staשאינו עומד עבור immunofluorescence (IF) או immunohistochemical (IHC) ניתוח של חיידקים ולוקליזציה התא האיקריוטים. תרשים 2B הוא נציג אם התמונה של קטע קפוא מוכן מתרבות איבר 8.3 בשבוע villous ב 72 שעות לאחר ההדבקה. הערה הנטל חיידקי כבד (פלואורסצנטי ירוק) ב ד ^ בקצות הענפים villous, וחוסר היחסי של חיידקים בתוך שכבת עץ-רירית syncytiotrophoblast (אדום פלואורסצנטי). בעבודה קודמת, השתמשנו דומה אם מכתים למקם L. חיידקים בתרבויות איברי villous ב timepoints השונה לאחר הדבקה. מעל 72 שעות, זיהום התפשטות מן EVT לתוך cytotrophoblasts תת-סינסיציאלי ו stroma villous הבסיסית. יש לציין, כי שכבת synyctiotrophoblast הייתה חסינה לזיהום 2.
תמונות מיקרוסקופיות אור הנציג של H & חלקי רקמות decidual פרפין מוטבע E מוכתם שהוכנו 14.3 בשבוע specime ns מוצגים איורים 3B ו -3 ג. ECM מצופה זה קרום transwell ננעצה להראות התרבות איבר באתרם (איור 3B). התמונה מראה בלוטות מרופדות אפיתל (כוכבי) ואת כלי דם מרופד האנדותל (יהלום) ממוצבת הטרוגני בתוך תא תא סטרומה decidual. בנוסף, ישנם תאים אימהיים החיסונית הפזורים stroma decidual בצפיפות משתנה. IHC ואם יכול להיות מנוצל מכתים לקבוע לוקליזציה microanatomical בקטריאלי, ביחס תאים חיסוניים תושב הספציפי. כדוגמה, מקרופאגים CD14 + (פלואורסצנטי ירוק) למקם את הציפוי הפנימי של כלי הדם ואת מפוזרים בתוך stroma (איור 3D), בעוד אגרגטים גדולים של L. חיידקי (אדום פלואורסצנטי) הם נצפו בעיקר ב stroma decidual ב 48 שעות לאחר ההדבקה (איור 3D).
| חיץ לשטוף | בינוני אוסף | בינוני Villous | בינוני Decidual |
| PBS | DMEM / F-12 עם Glutamax | DMEM / F-12 עם Glutamax | DMEM / F-12 עם Glutamax |
| פניצילין 100 IU / ml | עוברי שור סרום 2.5% | עוברי שור סרום 20% | עוברי שור סרום 2.5% |
| סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל | פניצילין 100 IU / ml | פניצילין 100 IU / ml | 17β-אסטרדיול 300 pg / ml |
| גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מ"ל | סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל | סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל | הפרוגסטרון 20 ng / ml |
| Amphotericin B 1.25 מיקרוגרם / מ"ל | גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מ"ל | ||
| < / Td> | Amphotericin B 1.25 מיקרוגרם / מ"ל |
טבלה 1:. מדיה מתכונים רכיבים ריכוזים להכנת חיץ לשטוף, בינוני אוסף, בינוני Villous, ובינוניים Decidual.
באיור 1. שלית מבנה. (א) מבנה של יחידת feto-שליה ברחם אימהי, (ב) גדלה של תיבה ב (א) מדגישה כי trophoblast העוברית (T) מרופדת villi השליה שטוף דם אימהי מעוגן לתוך decidua ידי trophoblasts extravillous (EVT). מוכל בתוך villi הוא כלי עוברי (ע"ע), פיברובלסטים, מקרופאגים עוברי. שונה מן זלדוביץ & Bakardjiev 22. "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תרבויות איבר Villous - ברוטו נציג ותמונות מיקרוסקופיות (א) שני עצי villous מסוף עם גיל הריון של 6 שבועות, כפי שמוצג תחת מיקרוסקופ לנתח.. הערת הקצוות "הרכים" (ראשי החץ) ו כלי הדם עוברי בולט זורמים דרך ענף העץ מהשמאל שהופך את היצירה הזאת מתאימה לתרבות איברים. (ב) מיקרוסקופיה immunofluorescence של התרבות איבר (גיל ההריון 8.3 שבועות) 72 שעות שלאחר זיהום חיידקי ליסטריה עם, הדגשת הנטל חיידקי כבד [ירוק] ב trophoblasts extravillous. DAPI מוצג בכחול, ואת βHCG + syncytiotrophoblasts באדום. ברי סולם = 1 מ"מ (א), 250 מיקרומטר (ב).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. תרבות איבר Decidual - ברוטו נציג ותמונות מיקרוסקופיים (א) parietalis decidua [left] ו capsularis decidua [right], בעמ 'הריונית גיל 6 שבועות, כפי שמוצג תחת מיקרוסקופ לנתח. (ב) H & E מוכתם סעיף תרבות איבר parietalis decidua גיל הריון 14.3 בשבוע תערוכות בלוטות בכלי דם המאורגנים הטרוגני ברחבי stroma decidual. ה (יהלום, ◆) ואת (כוכבית, *) להדגיש כלי ובלוטת נציג, בהתאמה. קו בראון בקצה התחתון transwell קרום, על קצה. (ג) H & E מוכתם סעיף של decidua גיל 14.3 בשבוע הריון parietalis תרבות איבר ב ד בהגדלה גבוהה יותרemonstrates arterioles ספירלה שריר דופן מוטבעת stroma decidual. תאי החיסון האמהית קטנים עם גרעינים כהים עגולים, ומופצים באופן בלתי סדיר לאורך stroma. (D) מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרבות איבר 48 שעות שלאחר זיהום עם L. חיידקים, הדגשת אזורים גדולים של חיידקים [אדום] ב stroma decidual, ו CD14 + מקרופאגים האימהית [ירוקה] ביטון שטח וסקולרית ומפותל ויתפזר stroma. ברי סולם = 1 מ"מ (א), 250 מיקרומטר (ב), 50 מיקרומטר (C ו- D). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
זנים טהורים, מהונדס ועכבר נוקאאוט יכולים לשרת מערכות ניסיוניות לבחון מנגנונים וחסונים. עם זאת, למרות שימור כללי של חומר גנטי ליבה, הגנום התפקודי של עכברים ובני אדם להפגין הבדלים משמעותיים גורמים רגולטוריים 23. אין זה מפתיע, אם כן, כי במחקרים פרה מבטיחים במודלים של בעלי חיים הם לפעמים לא לחזור בדיוק בחולים אנושיים. ההשליה מראה גבוה מאוד מגוון interspecies, ובכך טיוח במודלים של בעלי חיים פחות אידיאלי לחקר מחלות אנושיות 24. הכרה הוא ההבדלים הניכרים לעין באימונולוגיה אדם ועכבר 25, ואת האבולוציה מתבדר המבוטאת באנטומיה שליה, זה נבון לשקול את השימוש של תרבויות vivo לשעבר איבר של רקמות הריונית אדם לחקירה ניסיונית.
התיאורים, צילומי תמונות, סרט הדרכה בפרוטוקול זה להורות חוקרים עלאיך להקים villous ותרבויות איבר decidual על מוסיף תרבות ECM מצופה רקמה transwell. היתרונות של טכניקה זו כוללים את הפשטות היחסית של מיקרו-לנתיחה ומערכת transwell תמיכה מכאנית, במיוחד בהשוואה לשיטות חלופיות כגון מטריצות-מוטבע 3D או תרבויות פרוסה איברים. השעיה של תרבות האיבר על תמיכה הממברנה מאפשרת לחילופי מזין בכלל משטחי הרקמות כדאיים נשמרה לתרבות לטווח קצר (96 שעות עבור תרבויות villous, 72 שעות עבור תרבויות decidual) טכניקת .זה מאפשרת לחקר ביולוגית שליה אנושית על הרקמות רמה, ללא ספק יותר ביולוגי רלוונטי מאשר דגמי תרבית תאי monolayer.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא לנתיחה מיקרו של חתיכות villous ו decidual המתאים לתרבות איברים. חתיכות אופטימליות של רקמות מודגמות photographically (איור 2 א ו איור 3 א) כדי לעזור לחוקרים שעבורםהדמיה של דגימות הריונית היא חדשה. זה חשוב במיוחד כדי לבחור עצים villous שענפיו לסיים בעמודות EVT, כמו תאים אלה יעברו לתוך ECM ולעזור לעגן את villi הממברנה. עבור שני סוגי תרבויות איבר עוזר למזער הפרעות לרקמה במהלך שינויי תקשורת על ידי pipetting באופן זהיר חפוז.
טכניקה זו מקשה מינימאלית בלבד. בהזדמנות, דגימות להראות זיהום. זיהום הוא בדרך כלל חיידקים (מדי פעם פולי-מיקרוביאלי), ורק מתברר לאחר 1-2 ימים בתרבות. לאחר הזיהום הוא ציין, אקונומיקה צריכה להיות מיושמת, התרבות מושלכת, ואת החממה בתרבית הרקמה מעוקרת כדי למנוע בעיה לטווח ארוכה. ישנן מספר דרכים אפשריות זיהום שעלול להתעורר: זיהום ברחם, במהלך ניתוח, במהלך מסיק / עיבוד דגימה, או במהלך תחזוקת התרבות איברים. שלבי הקציר ועיבוד הם הזמן הסביר ביותרומקום זיהום להיות מוצג. לכן, חשוב להפחית את כמות זמן הדגימה היא מניפולציה במהלך איסוף דיסקציה מיקרו. זה יקטין חשיפת דגימת הסביבה, בסביבה לא סטרילית. בהתאם להגדרת מעבדה, מיקרוסקופ לנתח יכול להיות ממוקם בתוך מכסה מנוע רקמת סטרילית התרבות.
הניתוח histopathologic של תרבויות איברים לאחר ההדבקה עם הפתוגן רלוונטי מבחינה רפואית L. חיידקים, מוצגים כאן כיישום אפשרי אחד של הפרוטוקול. לוקליזציה immunofluorescence של שני החיידקים ותאי מארח חיסון לאחר תובנה חדשות תשואות זיהום לתוך תגובת המארח האנושית לפתוגנים. תרבויות איבר Decidual עשויות לשמש כטכניקת ניסוי vivo לשעבר משלימה לבחון נתונים שנוצרו מזיהומי עכבר vivo, לרבות דוחות מסקרן מראים פגמי תפקידי מערכת מקרופאג decidual murine 26,27. בנוסף, org אדםניתן השתמשו תרבויות אסטרטגיות מעורבת-זיהום, כגון בידוד תחרותי מורכב מכמה זני isogenic של L. חיידקים. זיהום תחרותי של תרבויות איברים הוא דרך רגישה לבדוק את הרלוונטיות של גורמים ארסיים בתוך הפונדקאי האנושי. אחת אילוץ של שיטה זו הוא כדאיות רקמות, אשר מוגבל לתרבות לטווח קצר (96 שעות עבור תרבויות villous, 72 שעות עבור תרבויות decidual). זה אידיאלי עבור זיהום עם גדל מהר חיידקים כגון L. חיידקים, אך בתרבויות עוד עשויים להיות נחוצים עבור פתוגנים כי לוקחים יותר זמן להקים ולהפיץ דרך רקמות.
כדי להפחית את הנטל העולמי של סיבוכי הריון, מחקר חייב להתמקד בהבנת פתופיזיולוגיה של ממשק האם והעובר האדם. חיידקים, פטריות, ופתוגנים ויראלי החוצות מאם לעובר גורם הרסני סיבוכים של הריון וזיהום עוברי. מבוקרת זיהום vivo של Ani מעבדהיונקים בדרך כלל נחשבים תקן הזהב לטיפול איך פתוגנים ליישב ולמעבר בין איברי 28. בגלל האנטומיה השליה משתנה במידה ניכרת על פני מינים של יונקים, זה הוא בעל חשיבות עליונה לשלב רקמה אנושית לתוך אסטרטגיות מחקר. תרבויות אדם איבר villous ו decidual הן מאוד מערכות מודל רלוונטיות לחקור אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן. כדי ללמוד עדיין חיוניים זה לא ידוע ולא מובנים איברים, חוקרים יכולים לנצל את השפע של שליה אנושית מושלכת אחר ודגימות decidual, באמצעות אסטרטגיות תרבות איבר כזה כפי שמתואר כאן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. Pathogens and the placental fortress. Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
