Summary
Een eenvoudige methode om primaire humane placenta (villi) en decidua orgaankweken vast is beschreven. Villous en deciduale orgel culturen zijn van onschatbare waarde tools voor het bestuderen van de pathogenese bij de mens maternale-foetale interface. Infectie met de facultatief intracellulaire bacterie Listeria monocytogenes wordt aangetoond.
Abstract
De placenta laat een grote mate van interspecies anatomische variabiliteit. Om zo goed begrijpen biologie en pathofysiologie van menselijke placenta, is het noodzakelijk om experimenten met menselijke cellen en weefsels te ontwerpen. Een voordeel van orgelcultuur is handhaving van driedimensionale (3D) structurele organisatie en extracellulaire matrix. Het doel van de hier beschreven methode is een succesvolle invoering van ex vivo humane zwangerschapsduur weefsel orgaan culturen en hun gezonde cultuur onderhoud van 72-96 uur. Het protocol beschrijft de onmiddellijke verwerking van het onderzoek goedgekeurde, placenta en deciduale exemplaren vers uit de operatiekamer suite. Dit zijn overvloedig specimens die anders zouden worden weggegooid. Gedetailleerde instructies voor de steriele collectie van deze monsters, met inbegrip van morfologische informatie over hoe u de juiste weefsels te selecteren om 3D-orgel culturen vast te stellen, wordt verstrekt. Placenta villous en deciduale weefsels worden gemicrodissecteerde in 2-3 mm 3 stuksen afzonderlijk op matrix beklede Transwell filters geplaatst en gedurende verscheidene dagen. Villous en deciduale orgel culturen zijn zeer geschikt voor de studie van de menselijke gastheer-pathogeen interactie. In vergelijking met andere modelorganismen, deze menselijke culturen bijzonder voordelig mechanisme van infectie pathogenen die variabele patronen van gastheerspecificiteit tonen onderzoeken. Als voorbeeld tonen we infectie van placenta en decidua orgaankweken met klinisch relevante, facultatief intracellulaire bacteriële pathogenen Listeria monocytogenes.
Introduction
Infecties en ontstekingen aan de maternale-foetale-interface vormt een belangrijke bron van morbiditeit en mortaliteit bij vrouwen en kinderen. Begrijpen hoe pathogenen infecteren deze weefsels is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de preventie en behandeling van ziekten zoals vroeggeboorte en foetale dood. Echter, hoge interspecies variabiliteit van de maternale-foetale-interface bemoeilijkt experimenteel onderzoek. Daarnaast bieden de meeste microbiële pathogenen tonen gastheerspecificiteit, waardoor vele diermodellen niet volledig herhalen menselijke infectieziekten. Bepaalde organismen (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio cholera, en vele andere) streng pathogeen in mensen, terwijl andere, zoals Listeria monocytogenes, vertonen een gemiddeld niveau van gastheerspecificiteit 1. Gastheerspecificiteit is gedocumenteerd in veel aspecten van de pathogenese, met inbegrip van de kolonisatie 2, verspreiding 3, immuun ontduiking 4 5. Het is dus van het grootste belang voor een optimale ontvangst modelsystemen selecteren.
Samengesteld uit foetale cellen en bloed van de moeder, de placenta is een orgaan dat zich snel ontwikkelt in de loop van de dracht 6. In eenvoudige termen, is de menselijke placenta gemaakt van foetale "villous" boom-achtige structuren badend in het bloed van de moeder. Gas en voedingsstoffen uitwisseling gebeurt over gespecialiseerde foetale cel lagen genaamd trophoblasts dat het oppervlak van de villous bomen lijn. De de baarmoeder slijmvlies, genoemd endometrium in de niet-zwangere vrouwen, transformeert structureel en functioneel in de decidua aan de foetoplacentaire unit tegemoet. Villous bomen worden verankerd in de baarmoeder door extravilleuze trofoblasten (EVT), die migreren van verankering cel kolommen in de decidua. De maternale-foetale interface derhalve uit decidua en placenta.
De orgelcultuur techniek die hier beschrevenis gebruikt waar en hoe klinisch relevante menselijke pathogenen, waaronder L. onderzocht monocytogene s en Toxoplasma gondii, passeren de placenta 2,7. Deze ex vivo orgel culturen repliceren in vivo weefsel architectuur, en zijn misschien wel fysiologisch zeer relevant modelsystemen voor de menselijke placenta. Extra cultuur technieken omvatten hele orgel explantaten, orgel plakjes, en weefsel of stamceltransplantatie organoids ingebed in 3D-matrix. Voor meer informatie over deze opties vindt u in een uitgebreide recente beoordeling 8. Let op: dit protocol is voor de aparte cultuur van decidua en placenta villi. Voor het bestuderen van de interactie tussen cellen en placenta decidua cellen, kan een co-kweek techniek de voorkeur. We verwijzen de geïnteresseerde lezer de eerder beschreven villi-decidua co-kweek techniek gebruikt door onderzoekers bestuderen trofoblast-gemedieerde decidua vasculaire remodellering 9-11.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de principes die in de Verklaring van Helsinki. Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of California, San Francisco (CHR # 11-05530). Alle patiënten gaven schriftelijk toestemming voor het verzamelen van monsters en de daaropvolgende analyse. Weefsel werd verzameld als de-aangewezen exemplaren.
NB: De onderzoeker moet de goedkeuring van hun institutionele menselijke proefpersonen review board te verkrijgen. De uitsluiting van monsters op basis van zwangerschapsduur verhaal of placenta afwijkingen zijn afhankelijk van de behoeften van elke specifieke studie.
LET OP: Geschikte veiligheid (bioveiligheid niveau 2) moeten worden gebruikt voor alle stappen in dit protocol 12.
1. Voorbereiding, Voorafgaand aan Collection Day
- Autoclaaf zeven / tang voor het verzamelen, en schaar / pincet voor micro-dissectie.
- Bereid voldoende volume (500 ml per monster) van Wash buffer (refer naar tabel 1 voor recept).
- Bereid voldoende volume (100 ml per monster) van 0,22 pm steriel gefiltreerd Collection media (zie tabel 1 voor recept).
- Aliquot extracellulaire matrix (ECM, zie tabel van de reagentia voor meer informatie) voor de lange termijn opslag.
- WINKEL ECM in vaste vorm bij -20 ° C. Voor de beste prestaties te vermijden herhalen Vorstproef. Dooi fles een viskeuze oplossing bij 4 ° C, en 300 ul aliquots bereiden in de koude kamer met gekoelde pipetpunten. WINKEL aliquots bij -20 ° C.
2. Verzameling van Fresh Tissue
LET OP: Bij het werken met verse menselijk weefsel, moeten onderzoekers Universal Voorzorgsmaatregelen (OSHA) voor het voorkomen van de overdracht van Bloodborne Pathogens volgen en moet de juiste institutionele opleiding hebben gekregen. Persoonlijk beschermende uitrusting, met inbegrip van handschoenen, oogbescherming, en lab jassen zijn noodzakelijk.
- Vervoergeautoclaveerd-zeven (een per monster), geautoclaveerd-tang, Wash buffer (mandfles), Collection media (25 ml per monster in een 50 ml conische buis), spray fles, 10% bleekmiddel, 70% ethanol, weefsel opvangbak, sharpie en ijsemmer / koeler naar het ziekenhuis / kliniek.
OPMERKING: Modellen worden ontvangen in een onderzoek aangewezen ruimte gelegen in een kamer dicht bij de operatiekamer suite. Een steriele weefselkweek kap is niet verplicht, maar collectie moet snel gebeuren en de onderzoeker moet op de juiste wijze te ontsmetten oppervlakken, zoals hieronder beschreven. - Plaats mandfles wasbuffer naast de wastafel, en spuit spigot met 10% bleekmiddel en 70% ethanol. Plaats glasvlies opvangbak van de lichtbron (licht pad of lichtbak), en ontsmetten met 10% bleekmiddel en 70% ethanol. Laat aan de lucht drogen.
- Hebben de clinicus carry exemplaren uit de operatiekamer suite met het model voorbereiding kamer. Bij de gootsteen, giet het monster bovenop steriele hand-held zeef, spoel weefsel meerdere malen in wash buffer, en de overdracht van hele model in buffer om ontsmet glasdienblad bovenop lichtbron.
OPMERKING: Evaluatie van weefsel door de arts is de hoogste prioriteit, dus de volgende stappen worden alleen uitgevoerd nadat de arts mondeling heeft aangegeven dat hij / zij heeft de evaluatie afgerond. - Gebruik steriele tang om placenta villi en decidua (Figuren 2A en 3A) voor de inzameling te selecteren en over te dragen aan 50 ml conische buizen te scheiden. Label de buizen met zwangerschapsduur.
LET OP: De voorkeur zwangerschapsduur leeftijden zijn minder dan 9 weken en minder dan 16 weken voor de placenta en decidua, respectievelijk. Voor deze instelling wordt slechts een fractie van elk monster verkregen voor onderzoeksdoeleinden, zoals voldoende weefsel voor klinisch pathologische diagnose moet blijven. - Bewaren en transporteren specimen op het ijs aan het onderzoek lab.
- Om meer dan één exemplaar te verzamelen, ontsmetten de glazen schaal zoals hierboven beschreven met 10% bleekmiddel en 70% ethanol tussen de collectie van elk monster.
3. Voorbereiding van de orgelcultuur Plates
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van een steriele techniek in een weefselkweek kap. Het is ideaal voor de dissectiemicroscoop worden in een steriele omgeving. Dit is echter niet absoluut noodzakelijk zolang micro-dissectie spoed uitgevoerd en instrumenten worden vaak ondergedompeld in 70% ethanol.
- Dooi ECM flacon (s) op ijs. Verdun het ECM 1: 1 met ijskoude Collection media, meng door pipetteren. Pipet langzaam te voorkomen dat er bubbels. Elk putje van een 6-well weefselkweek plaat moet 100 ul van deze schorsing en zal plaats bieden 3-4 orgel culturen.
- Plaats Transwell inzetstukken (poriegrootte 0,4 uM) in elk putje van 6-well weefselkweekplaat.
- Coat elk Transwell inzet met een dunne laag (100 ui) van de ECM / Media suspensie.
- Plaats de plaat op ijs en onmiddellijk naar establishment van orgaankweken. Als alternatief, de voorbereiding van de plaat voorafgaand aan weefsel collectie, in welk geval wikkel het in para-film en bewaar bij 4 ° C voor later gebruik. Opslag langer dan 6 uur wordt niet aanbevolen als de ECM zal uitdrogen.
4. Vaststelling van Orgaan Cultures
OPMERKING: Deze stap wordt beschreven hoe u deciduale orgel culturen en villous orgel culturen plaatsen in aparte transwells. De weefsels niet in contact. Onderzoekers geïnteresseerd in een co-kweek techniek waarbij decidua en villi in direct contact met elkaar, kunnen verwijzen naar voorafgaande literatuur 9,10.
- Spoel exemplaren tweemaal in Collection media, en centrifugeer bij 1000 xg tussen elke spoeling. Transfer weefsel in een steriele petrischaal en plaats op het podium van een dissectie microscoop. Houd 6-well plaat op ijs naast de microscoop.
- Micro-ontleden weefsel met steriele springer ontleden schaar en pincet, tot 2-3 mm villous orgelcultuur te vestigens (Figuur 2A).
LET OP: Villous orgel culturen zijn kleine, goed doorbloed "bomen" met 2 of 3 takken, en met prominente extravilleuze trofoblast (EVT) cel kolommen 11. Het is belangrijk om alleen villus weefsel van <9 weken eerste trimester exemplaren gebruiken als invasie van extravilleuze trofoblasten in ECM is het meest uitgesproken op deze jonge leeftijd 13. - Selecteer goed doorbloed villi met prominente EVT cel kolommen. EVT cel kolommen worden gevisualiseerd als bolvormige "fuzzy", "pluizig" uiteinden (zie pijlen in figuur 2A).
- Gebruik steriele tang om 3 of 4 villous bomen dragen in elk Transwell. Stel takken dus boom vlak boven ECM en aparte samengeklonterd takken wordt geplaatst.
- Micro-ontleden deciduale weefsel met steriele springer ontleden schaar en pincet, tot 3 mm 3 deciduale orgel culturen (figuur 3A) vast te stellen.
LET OP: Monsters bevatten twee distinct typen decidua weefsels decidua parietalis en decidua capsularis (links en rechts weefselfragmenten respectievelijk Figuur 3A). - Trim met een schaar tot 3 mm 3 stuks decidua parietalis te creëren. Decidua capsularis wordt niet gebruikt voor deze culturen. Gebruik een tang om weg te plagen elke geronnen bloed van de moeder.
- Gebruik een steriel pincet tot 3-4 stukken decidua te zetten in elk Transwell.
- 1 ml Collection media toe te voegen aan bodem van de put. Incubeer plaat overnacht bij 37 ° C in 5% CO 2
- Voor experimenten waarbij het belangrijk om de normale eerste trimester placenta zuurstofspanning nabootsen, handhaven villous orgaankweken in relatieve hypoxie (3% O 2).
LET OP: Laboratorium opties omvatten kleine hypoxia incubator kamers die passen binnen de bestaande incubators, of een tri-gas incubator dat de externe N 2 gas introduceert om de zuurstofconcentratie te verlagen. - Voeg 1 ml Villous of decidua medium (Table 1) naar boven van transwell na 12-16 uur van de cultuur.
LET OP: De afwezigheid van de media tijdens de eerste overnachting in de cultuur maakt het extravilleuze trofoblast cel kolommen binnen te vallen (villous cultuur), en voor het weefsel (zowel villous en deciduale) veilig ingebed in ECM geworden. In onze ervaring, deciduale orgel culturen blijven nog gedurende 72 uur en villous orgel culturen voor 96 uur. We raden experimentele eindpunten dat binnen deze periode valt. Zie tabel 1 voor samenstelling van villi en decidua medium. Villous medium een hoog percentage FBS, terwijl decidua medium aangevuld met zwangerschap hormonen (progesteron, 17β-oestradiol) de gedecidualiseerde toestand (tabel 1) te handhaven.
5. Bereiding van L. monocytogenes Cultures
NB: Voor gedetailleerde protocol over de lange termijn opslag van L. monocytogenes, en de cultuur en de groei van this organisme in de hersenen het hart infusie (BHI) bouillon en agar, verwijzen wij u naar Wang et al. 14
- Kies een enkele L. monocytogenes kolonie van uitgestreken BHI agar plaat en het enten van 3 ml BHI bouillon.
- Incubeer de L. monocytogenes cultuur overnacht (16 uur), in een schuine stand, bij 30 ° C.
LET OP:. Deze kweekomstandigheden toelaten de groei van bacteriën aan stationaire fase te bereiken L. monocytogenes wordt flagellated bij 30 ° C, welke gastheercel invasie 15 toeneemt.
6. Infectie van Organ culturen met L. monocytogenes
- Warme PBS en villi of decidua medium (tabel 1) tot 37 ° C.
- Gebruik steriele pincet één orgaankweek stukken die niet binnendringen in de ECM, en daarom drijven in de put te verwijderen.
- Zorgvuldig aspireren media van de onderkant van Transwell. Spoel de bovenste en onderste transwells tweemaal door voorzichtig pipetteren 1 ml van de oorlogben PBS in goed en zorgvuldig opzuigen in tussen. Voorzichtig pipet 1 ml van antibiotica-vrij Villous of deciduale media om de bovenste en onderste transwell. Wees voorzichtig met de orgelcultuur niet te verstoren.
- Laat het weefsel incuberen in een antibiotisch-vrij medium gedurende ten minste een uur zodat antibiotica zijn verwijderd.
OPMERKING: Bij stationaire fase de dichtheid van de L. monocytogenes cultuur is ongeveer 1 x 10 9 kolonievormende eenheden (CFU) per ml. Het aantal bacteriën gebruikt om orgaankweken infecteren moet empirisch bepaalde experimentele behoeften voldoet. - Voor wild type L. monocytogenes infectie routine experimenten tonen robuuste invasie met een 1:50 verdunning van de nacht (4 x 10 7 L. monocytogenes in 1 ml medium per putje). Resuspendeer het juiste aantal bacteriën in antibioticumvrij Villous of deciduale medium.
- Aspireren media van de bovenkant van transwells. Zachtjes voeg 1 ml van de entstof. Incubeer de platen bij 37° C in 5% CO 2 om voor bacteriële invasie.
- Verwijder extracellulaire bacteriën door opzuigen media van de bovenste en onderste transwells. Spoel putten tweemaal met warm PBS. Voeg 1 ml van de villi of decidua medium aangevuld met 50 ug ml Gentamicine -1. Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO2.
LET OP: L. monocytogenes is een facultatief intracellulaire bacterie die kan groeien in extracellulair medium te groeien binnen cellen en verspreiden van cel tot cel zonder naar de extracellulaire ruimte. Gentamicine een bactericide effect op extracellulaire L. monocytogenes, en staat aldus meten van intracellulair L. monocytogenes groei en verspreid via de orgelcultuur 16.
LET OP: Reproduceerbare L. monocytogenes infectie van villi en decidua orgaankweken optreedt bij 5 uur incubatie tijden. De incubatietijd voor toevoeging van gentamicine kan worden gemodificeerd op basis van experimentele behoeften en abiliteit van het organisme om het weefsel binnen te dringen. Om een beter inzicht anatomische plaatsen meest vatbaar voor infecties kunnen kortere incubatietijden gebruikt 2. - Handhaaf platen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende de duur van het experiment. Wijzig hele media in elk putje dagelijks.
NB: In onze ervaring, L. monocytogenes geïnfecteerde deciduale orgel culturen levensvatbaar blijven voor 48 uur en villous orgel culturen voor 72 uur.
7. Harvest of Organ Cultures for Histopathologie
- Bereid een verse oplossing van 4% paraformaldehyde door verdunning 10 ml van een 16% stock ampul in 30 ml PBS. Store 4% paraformaldehyde bij 4 ° C, beschermd tegen licht en gebruik binnen een week. Breng aan kamertemperatuur voor gebruik.
- Aspireren media van de bovenste en onderste transwell. Voorzichtig spoelen putjes tweemaal met PBS bij kamertemperatuur. Voorzichtig toe te voegen 1 ml 4% paraformaldehyde naar boven transwell volledig te bedekken de orgelcultuur.
- Incuberenin 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Vermijd langere incubatietijden daar dit kan leiden tot over- fixatie van het weefsel.
- Aspireren paraformaldehyde en spoelen putjes tweemaal met PBS bij kamertemperatuur. Integreer de vaste orgel culturen in oktober medium, te bevriezen, en sectie over een cryostaat ( "vaste bevroren"). In het algemeen vaste bevroren weefsel makkelijker punt dan bevroren weefsel, zonder voorafgaande fixatie.
NB: Voor de volledige protocol over oktober inbedding en bevroren snijden, dan kunt u toegang krijgen tot relevante hoofdstukken van gepubliceerde protocollen 17,18. Afhankelijk van de experimentele behoeften en de beschikbare laboratoriumapparatuur en opslag, kan het weefsel in plaats daarvan in paraffine ingebedde en coupes op een microtoom 19. - Verder voor te bereiden weefsel dia's voor routine hematoxyline & eosine kleuring, immunofluorescentie, of immunohistochemie 18,20,21.
Representative Results
Figuur 1 (gewijzigd vanaf Zeldovich & Bakardjiev 22) diagrammen de relevante placenta en uteriene anatomie. Figuur 2 toont representatieve grove en histologische beelden van placenta villi, terwijl Figuur 3 toont deciduale weefsel.
Dit protocol beschrijft eerst het verzamelen van verse placenta en deciduale weefsel in het ziekenhuis of de kliniek. De collectie-exemplaar is een mengsel van foetale placenta (villi) en de baarmoeder componenten (decidua). Na spoelen met buffer die breedspectrumantibiotica en antischimmelmiddelen, wordt het gehele monster geïnspecteerd op het oog met een lichtbak. Villi en decidua in gescheiden buizen geplaatst en getransporteerd op ijs naar het laboratorium. In het laboratorium is een dissectie microscoop gebruikt om de fijne morfologische kenmerken van gezond weefsel waarderen. Representatieve foto's vanvillous (Figuur 2A) en deciduale weefsels (Figuur 3A), die met een dissectie microscoop met twee externe zwanenhals lichtbronnen werden verworven, worden opgenomen als referentie.
Villous orgaankweken worden gegenereerd uit eerste trimester specimens. Culturen bestaan uit kleine terminal villous bomen met 2-6 takken. Het is belangrijk om villous takken die eindigen in extravilleuze trofoblast kolommen en zijn goed gevasculariseerd ontleden. Deze functies worden gezien als "pluizige" of "fuzzy" bijkantoor uiteinden (pijlpunten) en de zwakke roze-to-rood lineaire tint die cursussen door de takken van de boom aan de linkerzijde in figuur 2A. Daarentegen worden vaatstelsel en extravilleuze trofoblasten niet gemakkelijk zichtbaar voor de boom aan de rechterkant van dit beeld, dat suboptimaal voor cultuur zou zijn. Over de eerste dag van de cultuur, de extravilleuze trophoblasts migreren naar de ECM, thus verankering van de villi bomen in de matrix op de Transwell.
Deciduale orgel culturen worden gegenereerd op basis van de eerste en het begin van de tweede trimester exemplaren. Het volledige baarmoederslijmvlies wordt omgezet in decidua zeer kort na de implantatie. Meer specifiek decidua basalis definieert de baarmoeder slijmvlies direct achter de placenta / implantatieplaats, decidua capsularis definieert mucosa die over de foetus en decidua parietalis verwijst naar de rest van het baarmoederslijmvlies. Visualisatie onder een stereomicroscoop blijkt dat de vroege zwangerschap specimen bestaat grotendeels uit decidua parietalis en decidua capsularis (links en rechts weefselfragmenten, respectievelijk in figuur 3A). De decidua capsularis is herkenbaar aan de dunne, vliezige natuur. Voor orgel culturen wordt decidua parietalis bijgesneden tot 3 mm 3 fragmenten met micro-dissectie schaar en Adhehuur geronnen bloed wordt verwijderd met een pincet.
Na incubatie gedurende de nacht, zijn weefsels die besmet zijn met L. monocytogenes. De infectie hierboven beschreven protocol is gebaseerd op de gentamicine protectie-analyse gebruikt voor intracellulaire groei en verspreiding van facultatief intracellulaire bacteriën 16 te bestuderen. Orgaankweken in een antibiotisch-vrij medium geïncubeerd met L. monocytogenes werd gedurende 5 uur. Kweken werden gewassen met steriele PBS om bacteriën uit het medium te verwijderen. Daarna gentamicine toegevoegd aan extracellulaire organismen wordt voorkomen. Voorafgaand literatuur uit ons laboratorium gebruikt immuunfluorescentie en confocale microscopie om bacteriële weefsel lokalisatie op verschillende tijdstippen te bepalen na infectie 2. Orgaankweken worden gespoeld in PBS met 4% paraformaldehyde gefixeerd en ingebed ofwel ingevroren in OCT medium en bewaard bij -80 ° C, of in paraffine ingebed en bewaard bij kamertemperatuur. Weefselcoupes kunnen stained voor immunofluorescentie (IF) of analyse immunohistochemische (IHC) van bacteriën en eukaryote cel lokalisatie. Figuur 2B is een representatief IF beeld van een vriescoupe bereid uit een 8,3 week villous orgelcultuur in 72 uur na infectie. Let op de zware bacteriële belasting (groene fluorescentie) in de EVTS aan de uiteinden van de takken villi en het relatieve gebrek aan bacteriën in het boom-bekleding syncytiotrophoblast (rode fluorescentie) laag. In eerdere werk, we gebruikten soortgelijke IF kleuring om L. te lokaliseren monocytogenes in villous orgaankweken op verschillende tijdstippen na infectie. Meer dan 72 uur, infectie verspreid van EVT in sub-syncytieel cytotrofoblasten en de onderliggende villous stroma. Met name de synyctiotrophoblast laag was gevoeliger voor infecties 2.
Vertegenwoordiger van licht microscopische beelden van H & E-gekleurde paraffine ingebedde deciduale weefselcoupes bereid van 14,3 week specimens worden in figuren 3B en 3C. Deze ECM beklede transwell membraan werd verankerd aan de orgelcultuur in situ (figuur 3B) tonen. De afbeelding toont-epitheel beklede klieren (asterisk) en endotheliaal-beklede bloedvaten (diamant) gepositioneerd heterogeen binnen de deciduale stromale cel compartiment. Daarnaast zijn er maternale immune cellen verspreid over de deciduale stroma met een variabele dichtheid. IHC en IF kleuring kan worden gebruikt om bacteriële microanatomical lokalisatie ten opzichte van specifieke resident immuuncellen bepalen. Als voorbeeld, CD14 + macrofagen (groene fluorescentie) gelokaliseerd aan de binnenkant van bloedvaten en worden verspreid in de stroma (figuur 3D), terwijl grote aggregaten van L. monocytogenes (rode fluorescentie) worden voornamelijk waargenomen in de deciduale stroma op 48 uur na infectie (Figuur 3D).
| wasbuffer | Collection medium | villous medium | deciduale medium |
| PBS | DMEM / F-12 met GlutaMAX | DMEM / F-12 met GlutaMAX | DMEM / F-12 met GlutaMAX |
| Penicilline 100 IE / ml | Foetaal runderserum 2,5% | Foetaal runderserum 20% | Foetaal runderserum 2,5% |
| Streptomycine 100 ug / ml | Penicilline 100 IE / ml | Penicilline 100 IE / ml | 17β-oestradiol 300 pg / ml |
| Gentamicine 50 ug / ml | Streptomycine 100 ug / ml | Streptomycine 100 ug / ml | Progesteron 20 ng / ml |
| Amfotericine B 1,25 ug / ml | Gentamicine 50 ug / ml | ||
| < / Td> | Amfotericine B 1,25 ug / ml |
Tabel 1:. Media recepten componenten en concentraties voor de bereiding van Wash buffer, Collection medium, Villous medium en deciduale medium.
Figuur 1. Placenta structuur. (A) Structuur van foeto-placentale eenheid moederlijke uterus, (B) Uitbreiding van box aan (A) toont dat foetale trofoblast (T) bekleed placenta villi baden in bloed van de moeder en verankerd in de decidua van extravilleuze trophoblasts (EVT). Vervat in villi zijn foetale vaten (FV), fibroblasten, en foetale macrofagen. Gewijzigd ten opzichte van Zeldovich & Bakardjiev 22. "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Villous orgaankweken - Representatieve grove en microscopische afbeeldingen (A) Twee terminal villous bomen met een zwangerschapsduur van 6 weken, zoals gezien onder een stereomicroscoop.. Let op de "zachte" uiteinden (pijlpunten) en prominente foetale vaatstelsel dwars door de takken van de boom aan de linkerkant kwam dit stuk geschikt is voor orgelcultuur te maken. (B) Immunofluorescentie microscopie van orgelcultuur (zwangerschapsduur 8,3 weken) 72 uur na infectie met Listeria monocytogenes, met de nadruk zware bacteriële last [groen] in extravilleuze trophoblasts. DAPI wordt weergegeven in het blauw en βHCG + syncytiotrofoblasten in het rood. Schaalbalken = 1 mm (A), 250 um (B).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Deciduale orgelcultuur - Vertegenwoordiger bruto en microscopische beelden (A) Decidua parietalis [left] en decidua capsularis [right] op zwangerschapsduur 6 weken, zoals gezien onder een dissectie microscoop. (B) H & E-gekleurde coupe van 14,3 weken zwangerschapsduur decidua parietalis orgelcultuur toont klieren en vaatstelsel heterogeen hele deciduale stroma georganiseerd. De (diamant, ◆) en de (asterisk, *) markeert vertegenwoordiger vat en klier, respectievelijk. Bruine lijn aan de onderkant is transwell membraan, aan de rand. (C) H & E-gekleurde coupe van 14,3 weken zwangerschapsduur decidua parietalis orgelcultuur bij hogere vergroting demonstrates gespierde wanden spiraal arteriolen ingebed in deciduale stroma. Maternale immune cellen met kleine donkere round kernen en onregelmatig verdeeld over het stroma. (D) Immunofluorescentie microscopie van orgelcultuur 48 uur na infectie met L. monocytogenes, met de nadruk grote zones van bacteriën [red] in deciduale stroma, en de moeder CD14 + macrofagen [groen] voering een kronkelige vasculaire ruimte en verspreid in het stroma. Schaal bars = 1 mm (A), 250 pm (B), 50 pm (C en D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Aangeboren, transgene en knockout muizenstammen kan dienen in experimentele systemen om stevig te testen mechanismen. Ondanks algemene instandhouding van kern genetisch materiaal, de functionele genomen van muizen en mensen tonen significante verschillen in regulerende elementen 23. Het is dan ook niet verwonderlijk, dat veelbelovende preklinische studies in diermodellen worden soms niet gerecapituleerd in menselijke patiënten. De placenta toont zeer hoge interspecies diversiteit, aldus waardoor diermodellen minder dan ideaal voor de studie van de ziekte bij de mens 24. Erkennen zowel de opmerkelijke verschillen tussen mens en muis immunologie 25, en de uitgesproken uiteenlopende evolutie in de placenta anatomie, is het verstandig om het gebruik van ex vivo orgaan culturen van menselijke weefsels zwangerschapsduur voor experimenteel onderzoek te overwegen.
De beschrijvingen, fotografische afbeeldingen en educatieve video in dit protocol instrueren onderzoekershoe villous en deciduale orgel culturen te vestigen op het ECM-gecoate transwell weefselkweek inserts. Voordelen van deze techniek zijn de relatieve eenvoud van het micro-dissectie en mechanische ondersteuning transwell systeem, vooral ten opzichte van alternatieve methoden zoals 3D-matrices ingebed of orgaan slice cultures. Opschorting van de orgelcultuur op membraan ondersteuning zorgt voor voedingsstoffen uitwisseling op alle weefseloppervlakken en de levensvatbaarheid in stand wordt gehouden voor de korte termijn cultuur (96 uur voor villous culturen, 72 uur voor deciduale culturen) .Deze techniek maakt het mogelijk voor de studie van de menselijke placenta biologie aan het weefsel niveau, onmiskenbaar meer biologisch relevante dan monolaag celcultuur modellen.
De meest kritische stap in dit protocol is de micro-dissectie van passende villous en deciduale stukken voor orgelcultuur. Optimale stukjes weefsel fotografisch aangetoond (Figuur 2A en Figuur 3A) onderzoekers voor wie steunvisualisatie van de zwangerschapsduur exemplaren is nieuw. Het is bijzonder belangrijk om villous bomen waarvan de takken beëindigen EVT lijnen te kiezen omdat deze cellen migreren naar de ECM en te verankeren aan het membraan villi. Voor beide typen orgaankweken is nuttig om verstoringen van het weefsel tijdens het verwisselen van media door pipetteren op een zorgvuldige en wijze zonder haast minimaliseren.
Deze techniek bevat slechts minimale problemen. Bij gelegenheid exemplaren tonen besmetting. Verontreiniging meestal bacteriële (soms poly-microbiële), en wordt pas duidelijk na 1-2 dagen kweek. Zodra verontreiniging wordt waargenomen, moet bleekmiddel worden toegepast, de kweek verwijderd en de weefselkweek incubator gesteriliseerd om lange-termijn probleem te voorkomen. Er zijn verschillende mogelijke manieren contaminatie kan optreden: in utero infectie, tijdens de operatie, tijdens de oogst specimen / verwerking of tijdens orgelcultuur onderhoud. De stappen die de oogst en de verwerking zijn de meest waarschijnlijke tijden plaats voor besmetting worden ingevoerd. Derhalve is het belangrijk om de hoeveelheid tijd die het monster tijdens het verzamelen en gemanipuleerd micro-dissectie verminderen. Dit specimen blootstelling aan de omgevingslucht, niet-steriele omgeving te beperken. Afhankelijk van het laboratorium setup, kan de microscoop ontleden worden zich in de steriele weefselkweek kap.
De histopathologische analyse van orgel culturen na infectie met de medisch relevante pathogeen L. monocytogenes, wordt hier getoond als een van de mogelijke toepassing van het protocol. Immunofluorescentie lokalisatie van zowel bacteriën als gastheer immune cellen na infectie levert nieuwe inzichten in de menselijke gastheer respons op pathogenen. Deciduale orgel culturen zou kunnen dienen als een aanvullende ex vivo experiment techniek om data gegenereerd op basis van in vivo muis infecties, waaronder intrigerende rapporten waaruit blijkt defecten in muizen deciduale macrofaag verdediging functies 26,27 te onderzoeken. Bovendien, de menselijke orgEen kweken kan worden gebruikt in gemengde infectiestrategieën, zoals concurrerende inoculum uit verschillende isogene stammen van L. monocytogenes. Concurrerende infectie van orgaankweken is erg gevoelig voor de relevantie van virulentiefactoren testen in de menselijke gastheer. Een beperking van deze methode is levensvatbaarheid van het weefsel, die beperkt is tot korte termijn cultuur (96 uur voor villous culturen, 72 uur voor deciduale culturen). Dit is ideaal voor infectie met snelgroeiende bacteriën zoals L. monocytogenes, maar langere culturen kan nodig zijn voor ziekteverwekkers die meer tijd om vast te stellen en te verspreiden door het weefsel te nemen.
Om de globale last van de zwangerschap complicaties te verminderen, moet het onderzoek zich richten op het begrijpen van de pathofysiologie van het menselijk maternale-foetale interface. Bacteriën, schimmels en virale ziekteverwekkers die oversteken van moeder op foetus verwoestende complicaties van zwangerschap en foetale infectie. Gecontroleerde in vivo infectie van laboratorium- animals wordt doorgaans beschouwd als de gouden standaard voor het aanpakken van hoe pathogenen koloniseren en de doorvoer tussen de organen 28. Omdat de placenta anatomie verschilt sterk tussen soorten zoogdieren, is het van het grootste belang om menselijk weefsel te nemen in het onderzoek strategieën. Human villous en deciduale orgel culturen zijn zeer relevant modelsystemen voor gastheer-pathogeen interacties te onderzoeken. Om deze vitale nog slecht begrepen orgaan te bestuderen, kunnen de onderzoekers gebruik maken van de overvloed van andere afgedankte menselijke placenta en deciduale exemplaren, met behulp van orgelcultuur strategieën, zoals hier beschreven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A.
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I.
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
