Summary
En simpel metode til at etablere primær human placental (villus) og decidua-organkulturer beskrives. Villøse og decidua-organkulturer er uvurderlige værktøjer til at studere patogenesen ved den humane maternel-føtal interface. Infektion med de fakultative intracellulære bakterien Listeria monocytogenes er påvist.
Abstract
Moderkagen viser en høj grad af interspecies anatomiske variation. For bedst forstå biologi og patofysiologi den humane placenta, er det bydende nødvendigt at designe forsøg med humane celler og væv. En fordel ved organkultur er vedligeholdelse af tredimensionale (3D) strukturelle organisation og ekstracellulær matrix. Målet med den her beskrevne metode er vellykket etablering af ex vivo humane gestationel væv organkulturer og deres sunde kultur vedligeholdelse 72-96 timer. Protokollen beskriver den umiddelbare behandling af forskningsbaseret givet samtykke, placenta og decidua prøver frisk fra operativsystemet suite. Disse er rigelige prøver, som ellers ville blive kasseret. Detaljerede instruktioner om den sterile samling af disse prøver, herunder morfologiske detaljer om, hvordan du vælger passende væv til at etablere 3D organkulturer, er forudsat. Placentale villøse og decidua væv mikrodissekeres i 2-3 mm 3 stykkerog anbringes separat på matrix-foret transwell filtre og dyrket i flere dage. Villus og decidua-organkulturer er velegnede til undersøgelse af humane vært-patogen interaktion. Sammenlignet med andre modelorganismer, disse humane kulturer er særligt fordelagtigt at undersøge mekanismen for infektion for patogener, der demonstrerer variable mønstre af værtsspecificitet. Som et eksempel udviser vi infektion af placenta og decidua-organkulturer med de klinisk relevante, fakultative intracellulære bakterielle patogen Listeria monocytogenes.
Introduction
Infektion og betændelse på maternel-føtal grænseflade udgør en væsentlig kilde til sygelighed og dødelighed i kvinder og børn. Forståelse hvordan patogener inficerer disse væv er kritisk for udviklingen af hidtil ukendte strategier til at forebygge og behandle sygdomme såsom præmatur fødsel og fosterdød. Imidlertid høje interspecies variation af maternel-føtal grænseflade komplicerer eksperimentel undersøgelse. Endvidere mest mikrobielle patogener viser værtsspecificitet, kan således mange dyremodeller ikke er fuldt rekapitulere humane infektionssygdomme. Visse organismer (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio kolera, og mange andre) er strengt patogene hos mennesker, mens andre, såsom Listeria monocytogenes, viser en mere mellemliggende niveau af værtsspecificitet 1. Host specificitet er blevet dokumenteret i mange aspekter af patogenese, herunder kolonisering 2, formidling 3, immun unddragelse 4 fem. Det er således af største vigtighed at vælge optimale vært modelsystemer.
Sammensat af føtale celler og moderens blod, moderkagen er et organ, der hurtigt udvikler sig i løbet af drægtighedsperioden 6. I simpleste form, er den humane placenta konstrueret af føtale "villøse" træ-lignende strukturer badet i moderens blod. Gas og næringsstoffer udveksling opstår tværs specialiserede føtale cellelag kaldet trofoblaster denne linje overfladen af villøse træer. Den maternelle uterine slimhindebelægning, betegnet endometrium i den ikke-gravide kvinder, transformerer strukturelt og funktionelt i decidua at rumme fetoplacental enhed. Villøs træer er forankret i livmoderen ved extravillous trofoblaster (EVT), der vandrer fra forankring celle kolonner i decidua. Den maternel-føtal grænseflade består derfor af decidua og placenta.
Den organkultur teknikken beskrevet herer blevet brugt til at undersøge, hvor og hvor klinisk relevante humane patogener, herunder L. monocytogene s og Toxoplasma gondii, krydse placentabarrieren 2,7. Disse ex vivo organkulturer replikere in vivo væv arkitektur, og er velsagtens fysiologisk yderst relevante modelsystemer til human placentation. Ekstra kultur teknikker omfatter hele orgel eksplantater, orgel skiver, og væv eller stamcelletransplantation organoids indlejret i 3D-matrix. For nærmere oplysninger om disse muligheder henvises til en omfattende seneste revision 8. Bemærk, at denne protokol er for særskilt kultur decidua og placenta villi. For at studere interaktionen mellem placentale celler og moderhindeceller, kan en co-kultur teknik foretrækkes. Vi henviser den interesserede læser til den tidligere beskrevne villøs-decidua co-kultur teknik, der bruges af forskere studerer trofoblasten-medieret decidua vaskulær remodellering 9-11.
Protocol
Eksperimenter blev udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board ved University of California, San Francisco (CHR # 11-05.530). Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyse. Væv blev indsamlet som de-identificerede eksemplarer.
BEMÆRK: Forskeren skal indhente godkendelse fra deres institutionelle forsøgspersoner Review Board. Udelukkelsen af prøver baseret på svangerskabsuge historie eller placentale anomalier vil variere i henhold til behovene fra en bestemt undersøgelse.
BEMÆRK: Passende sikkerhedsbetingelser (biosikkerhed niveau 2) bør udnyttes til alle trin i denne protokol 12.
1. Forberedelse, Før Collection Day
- Autoklave sier / pincet til indsamling og sakse / tænger til mikro-dissektion.
- Forbered tilstrækkelig volumen (500 ml pr eksemplar) vaskebuffer (refer til tabel 1 for opskrift).
- Forbered tilstrækkelig volumen (100 ml pr eksemplar) af 0,22 uM sterilfiltreret Collection medier (se tabel 1 for opskrift).
- Delprøve ekstracellulære matrix (ECM, se tabel af reagenser for detaljer) for langtidsopbevaring.
- Store ECM i fast form ved -20 ° C. Den bedste ydelse undgå at gentage fryse tø. Thaw flaske til en viskos opløsning ved 4 ° C, og forberede 300 pi prøver i det kolde rum med kølet pipettespidser. Opbevar portioner ved -20 ° C.
2. Indsamling af frisk væv
ADVARSEL: Når du arbejder med frisk humant væv, må forskerne følge Universal forholdsregler (OSHA) til at forhindre overførsel af blodbårne patogener, og skal have modtaget rette institutionelle uddannelse. Korrekt personlige værnemidler, herunder handsker, øjenbeskyttelse og kitler er nødvendige.
- Transportereautoklaveres-sier (en pr prøve), autoklaveres-pincet, vaskebuffer (syreballonen), Collection medier (25 ml pr modellen i en 50 ml konisk rør), spray flaske, 10% blegemiddel, 70% ethanol, væv opsamlingsbakke, Sharpie og isspand / køler til hospital / klinik.
BEMÆRK: Prøver modtages i en forskningsbaseret udpeget rum placeret i et rum tæt på operativsystemet suite. En steril vævskultur hætte er ikke påkrævet, men indsamlingen skal ske hurtigt og forskeren bør passende desinficere overflader, som beskrevet nedenfor. - Sted ballon vaskebuffer støder op til vasken, og spray tap med 10% blegemiddel og 70% ethanol. Sted glasvæv opsamlingsbakke af lyskilden (lys pad eller lyskasse), og desinficere med 10% blegemiddel og 70% ethanol. Lad det lufttørre.
- Har kliniker carry prøver fra operativsystemet suite til prøvepræparation værelse. Ved vask, hæld prøven oven steril håndholdt si, skyl væv flere gange i varh buffer, og overføre hele modellen i buffer til steriliserede glas bakke oven lyskilde.
BEMÆRK: Vurdering af væv af klinikeren, er af højeste prioritet, og dermed følgende trin kun udføres efter klinikeren verbalt har tilkendegivet, at han / hun er færdig med evalueringen. - Brug steril pincet til at vælge placenta villi og decidua (figur 2A og 3A) for indsamling, og overføre til at adskille 50 ml koniske rør. Mærk rørene med gestationsalder.
BEMÆRK: Foretrukne gestationsalder er mindre end 9 uger og mindre end 16 uger for placenta og decidua hhv. På institutionen, er kun en brøkdel af hver prøve indkøbt til forskningsformål, som tilstrækkelig væv skal forblive til klinisk patologisk diagnose. - Opbevar og transport eksemplar på is til Research Lab.
- At indsamle mere end én prøve, sanitize glasbakken som beskrevet ovenfor med 10% blegemiddel og 70% ethanol mellem collektion af hver prøve.
3. Udarbejdelse af Organ Culture Plates
BEMÆRK: bør udføres Følgende trin ved hjælp af steril teknik i en vævskultur hætte. Den er ideel til dissektionsmikroskop at være placeret i et sterilt område. Men dette er ikke absolut nødvendigt, så længe mikro-dissektion udføres hurtigt, og instrumenter dyppes hyppigt i 70% ethanol.
- Tø ECM hætteglas (er) på is. Fortynd ECM 1: 1 med iskolde Collection medier, bland ved pipettering. Pipette langsomt for at undgå at indføre bobler. Hver brønd i en 6-brønds vævsdyrkningsplade kræver 100 pi af denne suspension og vil rumme 3-4 organkulturer.
- Sted transwell inserts (porestørrelse 0,4 um) i hver brønd på 6-brønds vævskulturplade.
- Coat hver Transwell indsætte med et tyndt lag (100 pi) af ECM / media suspension.
- Pladen anbringes på is og straks gå videre til establishment organkulturer. Alternativt forberede pladen før væv kollektion, i hvilket tilfælde pak det ind i para-film og opbevares ved 4 ° C til senere brug. Opbevaring længere end 6 timer anbefales ikke, da ECM vil tørre ud.
4. Etablering af Organ Cultures
BEMÆRK: Dette trin beskriver, hvordan du placerer decidua orgel kulturer og villøse organkulturer i separate transbrøndene. Vævene er ikke i kontakt. Forskere interesseret i en co-kultur teknik, hvor decidua og villi er i direkte kontakt med hinanden, kan henvise til tidligere litteratur 9,10.
- Skyl prøver to gange i Samling medier, og der centrifugeres ved 1.000 xg mellem hver skylning. Overfør væv til en steril petriskål og sted på scenen af et dissektionsmikroskop. Hold 6-brønds plade på is ved siden af mikroskopet.
- Micro-dissekere væv med sterile Springer dissekere saks og pincet, til at etablere 2-3 mm villøs orgel kulturs (figur 2A).
BEMÆRK: villøs organkulturer er små, godt vaskulariserede "træer" med 2 eller 3 afdelinger, og med fremtrædende extravillous trofoblasten (EVT) celle kolonner 11. Det er vigtigt at udnytte kun villus væv fra <9 ugers første trimester prøver, som invasion af extravillous trofoblaster i ECM er mest udtalt ved disse unge aldre 13. - Vælg godt vaskulariserede villi med fremtrædende EVT celle kolonner. EVT celle kolonner visualiseres som løgformet, "fuzzy", "fluffy" ender (se pilespidser i figur 2A).
- Brug steril pincet til at overføre 3 eller 4 villøse træer i hver transwell. Juster grene så træet er placeret fladt oven ECM og separate sammenklumpede grene.
- Micro-dissekere decidua væv med sterile Springer dissekere saks og pincet, at etablere 3 mm 3 decidua organkulturer (figur 3A).
BEMÆRK: Prøver indeholder to disdistinkt typer af decidua væv, decidua parietalis og decidua capsularis (venstre og højre vævsfragmenter henholdsvis figur 3A). - Trim med en saks til at skabe 3 mm 3 stykker af decidua parietalis. Decidua capsularis anvendes ikke til disse kulturer. Brug pincet til at drille væk enhver størknet moderens blod.
- Brug sterile pincetter til at overføre 3-4 stykker af decidua i hver transwell.
- Tilføj 1 ml Collection medier til bunden af brønden. Inkuber plade natten over ved 37 ° C i 5% CO2
- For eksperimenter, hvor det er vigtigt at efterligne den normale første trimester placenta oxygenspænding, vedligeholde villøse organkulturer i relativ hypoxi (3% O2).
BEMÆRK: Laboratorie muligheder omfatter små hypoxi inkubator kamre, der passer inde eksisterende inkubatorer, eller en tri-gas inkubator, der introducerer ekstern N2 gas til at sænke iltkoncentrationen. - Tilsæt 1 ml villøs eller decidua medium (Table 1) til top af Transwell efter 12-16 timers kultur.
BEMÆRK: Fraværet af medier under den første natten over i kultur tillader extravillous trofoblasten celle kolonner at invadere (villøs kultur), og for det væv (både villus og decidua) at blive sikkert indlejret i ECM. Det er vores erfaring, decidua organkulturer forbliver levedygtige i 72 timer og villøs orgel kulturer til 96 timer. Vi anbefaler eksperimentelle endpoints, der falder inden for denne tidsramme. Se tabel 1 for sammensætningen af villus og decidua medium. Villøs medium har en høj procentdel af FBS, mens decidua medium suppleret med graviditet hormoner (progesteron, 17p-østradio), der opretholder decidualized tilstand (tabel 1).
5. Fremstilling af L. monocytogenes Cultures
BEMÆRK: For detaljeret protokol om langtidsopbevaring af L. monocytogenes og kultur og vækst af this organisme i hjerne hjerte infusion (BHI) bouillon og agar, henvises til Wang et al. 14
- Vælg en enkelt L. monocytogenes koloni fra udstrøget BHI agar plade og inokulere 3 ml BHI-bouillon.
- Inkubér L. monocytogenes kultur natten over (16 timer), i en skrå stilling, ved 30 ° C.
BEMÆRK:. Disse dyrkningsbetingelser tillader bakterievækst at nå stationær fase L. monocytogenes er pisket ved 30 ° C, hvilket øger værtscelle invasion 15.
6. Infektion af Organ Kulturer med L. monocytogenes
- Varm PBS og villøs eller decidua medium (tabel 1) til 37 ° C.
- Brug sterile pincet til at fjerne eventuelle organkultur stykker, der ikke invaderer ind i ECM, og derfor flyder i brønden.
- aspireres forsigtigt medier fra bunden af Transwell. Skyl øvre og nedre transbrøndene to gange ved forsigtigt at pipettere 1 ml krigM PBS i godt, og omhyggeligt opsugning i mellem. Pipettér forsigtigt 1 ml antibiotikum-frit villus eller decidua medier til øvre og nedre transwell. Pas på ikke at forstyrre orgel kultur.
- Lad vævet inkuberes i antibiotikum-frit medium i mindst en time for at sikre, at antibiotika er blevet fjernet.
BEMÆRK: Ved stationær fase densiteten af L. monocytogenes kultur er cirka 1 x 10 9 kolonidannende enheder (CFU) pr ml. Antallet af bakterier, der anvendes til at inficere organkulturer bør bestemmes empirisk at imødekomme eksperimentelle behov. - For vildtype L. monocytogenes rutinemæssige infektion eksperimenter viser robust invasion med en 1:50 fortynding af natten (4 x 10 7 L. monocytogenes i 1 ml medier per brønd). Resuspender passende antal bakterier i antibiotika-fri villus eller decidua medium.
- Aspirer medier fra toppen af transbrøndene. Forsigtigt tilsættes 1 ml inokulum. Pladerne inkuberes ved 37° C i 5% CO2 for at muliggøre bakteriel invasion.
- Fjern ekstracellulære bakterier ved at aspirere medier fra øvre og nedre transbrøndene. Skyl brønde to gange med varm PBS. Tilsæt 1 ml villøs eller decidua medier suppleret med 50 mg ml -1 Gentamicin. Pladerne inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2.
BEMÆRK: L. monocytogenes er en fakultativ intracellulær bakterie, der kan vokse i ekstracellulære medium, vokser inde i celler, og spredes fra celle til celle uden adgang til ekstracellulære rum. Gentamicin har en baktericid effekt på ekstracellulær L. monocytogenes, og tillader således måling af intracellulær L. monocytogenes vækst og spredes gennem orglet kultur 16.
BEMÆRK: Reproducerbar L. monocytogenes infektion af villøse og decidua organkulturer sker med 5 timers inkuberingstider. Inkubationstiden før tilsætning af gentamicin kan ændres ud fra eksperimentelle behov og den ability af organismen til at invadere vævet. For bedre at forstå de anatomiske steder mest sårbare over for infektioner, kan kortere inkuberingstider anvendes 2. - Opretholde plader ved 37 ° C i 5% CO2 under hele forsøget. Skift hele medier i hver brønd dagligt.
BEMÆRK: Det er vores erfaring, L. monocytogenes inficerede decidua organkulturer forbliver levedygtige i 48 timer og villøs organkulturer for 72 timer.
7. Harvest af Organ kulturer til Histopatologi
- Der fremstilles en frisk opløsning af 4% paraformaldehyd ved fortynding 10 ml af en 16% stock ampul i 30 ml PBS. Store 4% paraformaldehyd ved 4 ° C, beskyttet mod lys, og bruge inden for en uge. Bring til stuetemperatur før brug.
- Aspirer medier fra øvre og nedre transwell. skylles forsigtigt brønde to gange med PBS ved stuetemperatur. tilføje forsigtigt 1 ml 4% paraformaldehyd til top Transwell til helt at dække orglet kultur.
- inkuberi 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 20 minutter. Undgå længere inkubationstider da dette kan føre til over-fiksering af vævet.
- Aspirer paraformaldehyd og skyl brøndene to gange med PBS ved stuetemperatur. Integrer de faste organkulturer i OCT medium, fryse, og afsnittet om en kryostat ( "Fixed frosset"). Generelt faste frosne væv er lettere at afsnittet undtagelse af frosset væv uden forudgående fiksering.
BEMÆRK: For fuldstændig protokol den okt indlejring og frosne sektionering, bedes du adgang relevante afsnit fra offentliggjorte protokoller 17,18. Afhængig af eksperimentelle behov og tilgængelige laboratorieudstyr og opbevaring, kan væv i stedet være paraffin-indlejret og sektioneret på en mikrotom 19. - Yderligere forberede væv slides til rutinemæssig Hematoxylin & Eosin-farvning, immunofluorescens eller immunhistokemi 18,20,21.
Representative Results
Figur 1 (modificeret fra Zeldovich & Bakardjiev 22) diagrammer det relevante placentale og uterin anatomi. Figur 2 viser repræsentative brutto og histologiske billeder af placental villi, mens figur 3 viser decidua væv.
Denne protokol først beskriver indsamling af frisk placenta og decidua væv på hospitalet eller klinikken. De indsamlede eksemplar er en blanding af føtal placenta (villi) og mødre uterine komponenter (decidua). Efter skylning med buffer indeholdende bredspektrede antibiotika og antifungale midler, er hele prøven inspiceret af øjet ved anvendelse af en lyskasse. Villi og decidua anbringes i separate rør og transporteret på is til laboratoriet. I laboratoriet er et dissektionsmikroskop bruges til at sætte pris på de fine morfologiske træk af sundt væv. Repræsentative fotografier afvilløs (figur 2A) og decidua væv (Figur 3A), som er anskaffet med et dissektionsmikroskop med to eksterne svanehals lyskilder er vist for reference.
Villøs organkulturer genereres fra første trimester prøver. Kulturer består af mindre varme- villøse træer med 2-6 grene. Det er vigtigt at dissekere villøse grene, der slutter i extravillous trofoblast kolonner og er godt vaskulariseret. Disse funktioner ses som "fluffy" eller "fuzzy" gren ender (pilespidser), og svag rosa-til-rød lineær nuance at kurser gennem grene af træet til venstre i figur 2A. I modsætning hertil er kar og extravillous trofoblaster ikke umiddelbart visualiseret for træet til højre på dette billede, som ikke vil være optimal for kulturen. I løbet af de første dage af kultur, de extravillous trofoblaster vandre ind i ECM, thus forankring af villøse træer i matrixen på transwell.
Decidua organkulturer genereres fra første og tidlige andet trimester prøver. Hele livmoderslimhinden omdannes til decidua meget kort tid efter implantation. Mere specifikt decidua basalis definerer livmoderslimhinden direkte ligger til grund for placenta / implantation site, decidua capsularis definerer slimhinde overliggende fosteret, og decidua parietalis refererer til den resterende del af livmoderslimhinden. Visualisering under et dissektionsmikroskop viser, at den tidlige gestational eksemplar hovedsageligt består af decidua parietalis og decidua capsularis (venstre og højre væv fragmenter henholdsvis i figur 3A). Det decidua capsularis let udmærker sig ved sin tynde, membranøs natur. For orgel kulturer er decidua parietalis trimmet til 3 mm 3 fragmenter med mikro-dissektion saks og selvklæleje størknet blod fjernes med en pincet.
Efter inkubation natten over, er væv inficeret med L. monocytogenes. Infektionen forskrift ovenfor beskrevne er baseret på Gentamicin beskyttelse assay anvendt til at undersøge intracellulær vækst og spredning af fakultative intracellulære bakterier 16. Organkulturer i antibiotikum-frit medium inkuberes med L. monocytogenes i 5 timer. Kulturer vaskedes med sterilt PBS for at fjerne bakterier fra mediet. Derefter Gentamicin tilsættes for at fjerne ekstracellulære organismer. Forudgående litteratur fra vores laboratorium, som anvendes immunofluorescens og konfokal mikroskopi for at bestemme bakteriel vævslokalisering ved forskellige tidspunkter efter infektion 2. Organkulturer skylles i PBS, fikseret i 4% paraformaldehyd, og enten frosset-embedded i OCT medium og opbevaret ved -80 ° C, eller paraffin-indlejret og opbevaret ved stuetemperatur. Vævssnit kan være stained for immunfluorescens (IF) eller immunhistokemisk (IHC) analyse af bakterier og eukaryote celle lokalisering. 2B er en repræsentant IF billede af en frossen sektion fremstillet af en 8,3 uge villøs orgel kultur på 72 timer efter infektion. Bemærk den tunge bakteriel byrde (grøn fluorescens) i EVTs ved enderne af de villøse grene, og den relative mangel på bakterier i træ-foring syncytiotrophoblast (rød fluorescens) lag. I tidligere arbejde, vi brugte ligner IF farvning at lokalisere L. monocytogenes i villøse organ- kulturer på forskellige tidspunkter efter infektionen. Over 72 timer, infektion spredes fra EVT i sub-syncytial cytotrophoblaster og underliggende villus stroma. Navnlig vil synyctiotrophoblast lag var resistent over for infektion 2.
Repræsentative lys mikroskopiske billeder af H & E-farvede paraffinindlejrede decidua vævssnit fremstillet ud fra 14,3 uger specimens er vist i figur 3B og 3C. Dette ECM-coatede transwell membran blev indlejret for at vise organkultur in situ (figur 3B). Billedet viser epitel-foret kirtler (stjerne) og endotel-foret kar (diamant) placeret heterogent i decidua stromacelle- rum. Derudover er der maternelle immunceller spredt i hele decidua stroma ved en variabel densitet. IHC og IF farvning kan anvendes til at bestemme bakteriel microanatomical lokalisering i forhold til specifikke residente immunceller. Som et eksempel, CD14 + makrofager (grøn fluorescens) lokalisere til foring af vaskulatur og er spredt i stroma (figur 3D), medens store aggregater af L. monocytogenes (rød fluorescens) observeres overvejende decidua stroma ved 48 timer efter infektion (figur 3D).
| vaskebuffer | indsamling medium | villøs medium | decidua medium |
| PBS | DMEM / F-12 med GlutaMAX | DMEM / F-12 med GlutaMAX | DMEM / F-12 med GlutaMAX |
| Penicillin 100 IU / ml | Kalvefosterserum 2,5% | Kalvefosterserum 20% | Kalvefosterserum 2,5% |
| Streptomycin 100 pg / ml | Penicillin 100 IU / ml | Penicillin 100 IU / ml | 17β-estradiol 300 pg / ml |
| Gentamicin 50 ug / ml | Streptomycin 100 pg / ml | Streptomycin 100 pg / ml | Progesteron 20 ng / ml |
| Amphotericin B 1,25 ug / ml | Gentamicin 50 ug / ml | ||
| < / Td> | Amphotericin B 1,25 ug / ml |
Tabel 1:. Media opskrifter Komponenter og koncentrationer for udarbejdelse af vaskebuffer, Collection medium, villøs medium og decidua medium.
Figur 1. Placenta struktur. (A) Struktur af feto-placental enhed i maternelt uterus, (B) Udvidelse af boksen i (A) fremhæver, at føtalt trofoblasten (T) foret placentale villi er badet i moderens blod og forankret i decidua ved extravillous trofoblaster (EVT). Indeholdt i villi er føtale skibe (FV), fibroblaster og føtale makrofager. Modificeret fra Zeldovich & Bakardjiev 22. "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: villøs organkulturer - Repræsentant brutto og mikroskopiske billeder (A) To terminal villøse træer med en gestationsalder på 6 uger, som set under et dissektionsmikroskop.. Bemærk de "fluffy" ender (pilespidser) og fremtrædende føtal vaskulatur løbe gennem grenene af træet til venstre, der gør denne stykke egnet til orgel kultur. (B) Immunofluorescens mikroskopi af orgel kultur (gestationsalder 8,3 uger) 72 timer efter infektion med Listeria monocytogenes, fremhæver tung bakteriel byrde [grøn] i extravillous trophoblaster. DAPI vises med blåt, og βHCG + syncytiotrofoblaster i rødt. Scale barer = 1 mm (A), 250 um (B).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Decidua orgel kultur - Repræsentant brutto- og mikroskopiske billeder (A) decidua parietalis [venstre] og decidua capsularis [højre] på gestationsalder 6 uger, som ses under et dissektionsmikroskop. (B) H & E-farvede afsnit af 14,3 uger gestationsalder decidua parietalis orgel kultur viser kirtler og kar organiseret heterogent hele decidua stroma. Den (diamant, ◆) og (stjerne, *) fremhæve repræsentativ beholder og kirtel, hhv. Brun linje på nedre kant er Transwell membran, på kanten. (C) H & E-farvede afsnit af 14,3 uger gestationsalder decidua parietalis organkultur ved højere forstørrelse demonstrates muskuløs-walled spiral arterioler indlejret i decidua stroma. Maternal immunceller er små med mørke runde kerner, og er uregelmæssigt fordelt i stroma. (D) immunfluorescensmikroskopi af organkultur 48 timer efter infektion med L. monocytogenes, fremhæver store zoner af bakterier [red] i decidua stroma, og moderens CD14 + makrofager [grøn] foring et indviklet vaskulære rum og spredt i stroma. Scale barer = 1 mm (A), 250 um (B), 50 um (C og D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Indavlede, transgene og knockout musestammer kan tjene i eksperimentelle systemer til robust teste mekanismer. Men på trods af generel bevarelse af kerne genetisk materiale, de funktionelle genomer af mus og mennesker demonstrerer, betydelige forskelle i regulatoriske elementer 23. Det er ikke overraskende, derfor, at lovende prækliniske studier i dyremodeller er undertiden ikke blive gentaget i humane patienter. Placenta viser meget høj interspecies diversitet, hvilket således gør dyremodeller mindre derefter ideal for studiet af human sygdom 24. I erkendelse både de bemærkelsesværdige forskelle i mennesker og mus immunologi 25, og den udtalte divergerende udvikling i placenta anatomi, er det klogt at overveje brugen af ex vivo orgel kulturer af humane svangerskabsuge væv til eksperimentel undersøgelse.
Beskrivelserne, fotografiske billeder og instruktions-video i denne protokol instruere forskere påhvordan man etablerer villøs og decidua organkulturer på ECM-belagt transwell vævskultur skær. Fordele ved denne teknik indbefatter den relative enkelhed af mikro-dissektion og mekanisk støtte transwell-system, især sammenlignet med alternative fremgangsmåder, såsom 3D-indlejrede matricer eller orgel skive kulturer. Suspension af orglet kultur på membran støtte giver mulighed for udveksling af næringsstoffer på alle vævsoverflader og levedygtighed opretholdes til kortvarig kultur (96 timer for villøse kulturer, 72 timer for decidua kulturer) .Dette teknik gør det muligt for at studere den menneskelige placenta biologi på vævet niveau, unægtelig mere biologisk relevant end monolag cellekultur modeller.
Det mest kritiske skridt i denne protokol er den mikro-dissektion af passende villøse og decidua stykker for orgel kultur. Optimale stykker væv er påvist fotografisk (figur 2A og figur 3A) støtte forskere, for hvemvisualisering af svangerskabsuge prøver er nyt. Det er især vigtigt at vælge villøse træer, hvis grene afsluttes i EVT kolonner, da disse celler vil vandre ind i ECM og hjælpe forankre villi til membranen. For begge typer af orgel kulturer er nyttigt at minimere forstyrrelser i væv under medieændringer ved pipettering i en omhyggelig og tøvende måde.
Denne teknik viser kun minimale vanskeligheder. Den lejlighed, prøver viser forurening. Forurening er normalt bakteriel (lejlighedsvis poly-mikrobiel), og kun bliver tydeligt efter 1-2 dage i kultur. Når der observeres forurening, bør blegemiddel anvendes, kulturen kasseret, og vævsdyrkningsinkubator steriliseret for at forhindre en langsigtet problem. Der er flere mulige måder forurening kan opstå: i livmoderen infektion, under operation, under specimen høst / behandling, eller i løbet af orgel kultur vedligeholdelse. trin høsten og forarbejdning er de mest sandsynlige tidspunktog sted for forurening skal indføres. Således er det vigtigt at reducere den mængde tid, prøven manipuleres under indsamling og mikro-dissektion. Dette vil reducere prøve udsættelse for omgivende, ikke-sterile miljø. Afhængigt af konfigurationen laboratorium, kan dissektionsmikroskop være placeret inde i sterile vævskultur hætte.
Den histopatologiske analyse af organkulturer efter infektion med den medicinsk relevante patogen L. monocytogenes, er her vist som en mulig anvendelse af protokollen. Immunofluorescens lokalisering af både bakterier og værtsceller immunceller efter infektion udbytter nye indsigter i den menneskelige vært reaktion på patogener. Decidua organkulturer kan tjene som et supplerende ex vivo eksperiment teknik til at undersøge data fra in vivo mus infektioner, herunder spændende rapporter, der viser fejl i murine decidua makrofag forsvar funktioner 26,27. Derudover humant organ kulturer kan anvendes i blandet infektion strategier, såsom en konkurrencedygtig inokulum sammensat af flere isogene stammer af L. monocytogenes. Konkurrencedygtig infektion af organkulturer er en følsom måde at teste relevansen af virulensfaktorer i det menneskelige vært. En begrænsning af denne metode er væv levedygtighed, som er begrænset til kortvarige kultur (96 timer for villøse kulturer, 72 timer for decidua kulturer). Dette er ideelt for infektion med hurtigt voksende mikrober såsom L. monocytogenes, men længere kulturer kan være nødvendigt for patogener, der tager mere tid til at etablere og sprede sig gennem væv.
For at reducere den globale byrde af graviditet komplikationer, skal forskningen fokusere på at forstå patofysiologi af den menneskelige maternel-føtal interface. Bakterier, svampe, og virale patogener, der krydser fra mor til foster årsag ødelæggende komplikationer i graviditeten og føtal infektion. Kontrolleret in vivo infektion af laboratorieudstyr animals typisk betragtes som den gyldne standard for adressering hvordan patogener kolonisere og transit mellem organerne 28. Fordi placenta anatomi varierer markant tværs pattedyrarter, er det af yderste vigtighed at inkorporere humant væv i forskningsstrategier. Humane villøse og decidua orgel kulturer er yderst relevante modelsystemer til at undersøge vært-patogen interaktioner. For at undersøge dette afgørende endnu dårligt forstået organ, kan forskerne drage fordel af den overflod af ellers kasseret human placental og decidua-prøver under anvendelse organkultur strategier såsom beskrevet her.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A.
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I.
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
