Summary
En enkel metod för att fastställa primär human placenta (villösa) och decidual organkulturer beskrivs. Villös och decidual organkulturer är ovärderliga verktyg för att studera patogenesen vid mänsklig moder och foster gränssnitt. Infektion med fakultativa intracellulära bakterien Listeria monocytogenes kan påvisas.
Abstract
Moderkakan visar en hög grad av mellan arter anatomiska variationer. För att bäst förstå biologin och patofysiologi av human placenta, är det absolut nödvändigt att utforma experiment med användning av mänskliga celler och vävnader. En fördel med organodling är underhåll av tredimensionella (3D) strukturella organisationen och extracellulära matrisen. Målet med den här beskrivna metoden är framgångsrik etablering av ex vivo kulturer mänskliga graviditets vävnad organ och deras sund kultur underhåll för 72-96 timmar. Protokollet detaljer omedelbar bearbetning av forskning godkänd, placenta och decidual prover färskt från operations svit. Dessa är rikliga prover som annars skulle kasseras. Detaljerade anvisningar om den sterila insamling av dessa prover, inklusive morfologiska detaljer om hur man väljer lämpliga vävnader för att etablera 3D organkulturer, tillhandahålls. Placental villösa och decidual vävnader microdissected i 2-3 mm 3 stoch placeras separat på matriskantade Transwell filter och odlades under flera dagar. Villi och decidual organkulturer är väl lämpade för att studera värdpatogen interaktion människa. Jämfört med andra modellorganismer, är dessa mänskliga kulturer är särskilt fördelaktiga för att undersöka mekanismen för infektion för patogener som uppvisar variabla mönster av värdspecificitet. Som ett exempel, visar vi infektion av moderkakan och decidual organkulturer med kliniskt relevanta, fakultativa intracellulära bakteriell patogen Listeria monocytogenes.
Introduction
Infektion och inflammation vid moder och foster gränssnitt utgör en stor källa till sjuklighet och dödlighet hos kvinnor och barn. Att förstå hur patogener infektera dessa vävnader är kritisk för utvecklingen av nya strategier för att förebygga och behandla sjukdomar såsom tidig förlossning och fosterdöd. Men höga variationen mellan olika arter av moderns-fetala gränssnitt komplicerar experimentella undersökningar. Vidare, de flesta mikrobiella patogener visar värdspecificitet, kan således många djurmodeller inte helt rekapitulera mänskliga infektionssjukdomar. Vissa organismer (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, och många andra) är strikt patogena i människor, medan andra, såsom Listeria monocytogenes, visar en mer medelnivå i värdspecificitet 1. Värdspecificitet har dokumenterats i många aspekter av patogenes, inklusive kolonisering 2, spridning 3, immun skatteflykt 4 5. Således är det av yttersta vikt att välja optimala värdmodellsystem.
Består av fetala celler och moderns blod, är moderkakan ett organ som snabbt utvecklas under loppet av dräktigheten 6. I enklaste form är human placenta konstruerad av foster "villösa" trädliknande strukturer badade i moderns blod. Gas och närings utbyte sker över specialiserade fetala cellager som kallas trofoblaster som kantar ytan av villösa träd. Moderns livmoder mucosal lining, benämnd endometrium i den icke-gravid kvinna, omvandlar strukturellt och funktionellt in i decidua att rymma den fetoplacental enheten. Villösa träd är förankrade i livmodern genom extravillous trofoblaster (EVT) som migrerar från förankringscell kolumner i decidua. Den moder till foster gränssnittet består därför av decidua och placenta.
Den organkultur teknik som beskrivs härhar använts för att undersöka var och hur kliniskt relevanta humana patogener, inklusive L. monocytogene s och Toxoplasma gondii, passerar placentabarriären 2,7. Dessa ex vivo organkulturer replikera in vivo vävnadsarkitektur, och är utan tvekan fysiologiskt mycket relevanta modellsystem för mänsklig placentation. Ytterligare odlingstekniker omfatta hela explants organ, skivor organ och vävnader eller stamcells organoids inbäddade i 3D-matris. Mer information om dessa alternativ, se en omfattande senaste omdömet åtta. Observera att detta protokoll är för separat kultur decidua och placenta villi. För att studera interaktionen mellan placentaceller och decidualcell kan en co-kultur teknik vara att föredra. Vi hänvisar den intresserade läsaren till den tidigare beskrivna villi-decidual co-odlingsteknik, används av forskare som studerar trofoblaster-medierad decidual kärlremodellering 9-11.
Protocol
Experiment genomfördes i enlighet med de principer som uttrycks i Helsingforsdeklarationen. Studien godkändes av Institutional Review Board vid University of California, San Francisco (CHR # 11-05.530). Alla patienter som skriftligt informerat samtycke för provtagning och efterföljande analys. Tissue samlades som de-identifierade exemplar.
OBS: Forskaren måste få godkännande från deras institutionella försökspersoner prövningsnämnd. Undantaget för prover baserade på graviditets historia eller moderkakan avvikelser kommer att variera beroende på behoven hos någon specifik undersökning.
OBS: Lämpliga säkerhetsvillkor (skyddsnivå 2) bör användas för alla steg i detta protokoll 12.
1. Förberedelse, före samlingen Day
- Autoklav silar / pincett för insamling och sax / tång för mikro dissekering.
- Förbered lämplig volym (500 ml per prov) tvättbuffert (refer tabell 1 för recept).
- Förbered lämplig volym (100 ml per prov) av 0,22 | iM sterilfiltrerad Collection media (se tabell 1 för recept).
- Alikvotera Extracellulär Matrix (ECM, se tabell av reagenser för detaljer) för långtidsförvaring.
- Store ECM i fast form vid -20 ° C. För bästa prestanda, undvika upprepning frysning tina. Tö flaska till en viskös lösning vid 4 ° C, och förbereda 300 | il alikvoter i kylrummet med kylda pipettspetsar. Förvara alikvoter vid -20 ° C.
2. Insamling av färsk vävnad
VARNING: När du arbetar med färsk mänsklig vävnad, måste forskarna följa allmänna försiktighetsåtgärder (OSHA) för att förhindra överföring av blodburna patogener, och måste ha fått lämplig institutionell utbildning. Korrekt personlig skyddsutrustning, inklusive handskar, skyddsglasögon och rockar är nödvändiga.
- Transportautoklave-silar (en per prov), autoklaveras-pincett, tvättbuffert (damejeanne), Collection media (25 ml per prov i en 50 ml koniskt rör), sprayflaska, 10% blekmedel, 70% etanol, vävnadsuppsamlingstråg, sharpie och ishink / kylare till sjukhus / klinik.
OBS: Prover tas emot i en forsknings avsedda utrymmet ligger i ett rum nära den operativa sviten. En steril vävnadsodling huva krävs inte, men insamling bör ske snabbt och forskaren ska på lämpligt sätt desinficera ytor, såsom beskrivs nedan. - Plats damejeanne av tvättbuffert i anslutning till diskbänken, och spraya tapp med 10% blekmedel och 70% etanol. Plats glasfilt uppsamlingstråg på ljuskällan (ljus dyna eller ljuslåda), och desinficera med 10% blekmedel och 70% etanol. Låt lufttorka.
- Har klinikern carry prover från drifts suite till provberedningslokalen. Vid diskbänken, häll provet ovanpå steril handhållen sil, skölj vävnaden flera gånger varh buffert, och överföra hela provet i buffert till sanerad glasbricka ovanpå ljuskälla.
OBS: Bedömning av vävnad av klinikern är av högsta prioritet, och därmed följande steg utförs endast efter att klinikern har muntligen angett att han / hon är färdig utvärderingen. - Använd steril tång för att välja placenta villi och decidua (figurerna 2A och 3A) för insamling och överföring till separata 50 ml koniska rör. Märk rören med gestationsålder.
OBS: Föredragen graviditetstiden är mindre än 9 veckor och mindre än 16 veckor för moderkakan och decidua, respektive. Vid institutionen är bara en bråkdel av varje prov upphandlas för forskningsändamål, som lämplig vävnad måste förbli för klinisk patologisk diagnos. - Förvara och transportera provet på is till forskningslabb.
- Att samla in mer än ett exemplar, sanera glas fack som beskrivits ovan med 10% blekmedel och 70% etanol mellan ColleInsatser av varje prov.
3. Beredning av organodlingsplattor
OBS: Följande steg ska utföras med hjälp av steril teknik i en vävnadsodling huva. Den är idealisk för den dissektionsmikroskop att placeras i ett sterilt område. Detta är dock inte absolut nödvändigt så länge som mikro dissektion utförs snabbt, och instrument doppas frekvent i 70% etanol.
- Tina ECM flaska (s) på is. Späd ECM 1: 1 med iskall Collection media, blanda genom att pipettera. Pipett långsamt för att undvika att införa bubblor. Varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta kräver 100 | il av denna suspension och kommer att rymma 3-4 organkulturer.
- Plats Transwell skär (porstorlek 0,4 ^ M) i varje brunn i 6-brunnars vävnadsodlingsplatta.
- Coat varje Transwell infoga med ett tunt skikt (100 | j, l) av ECM / media suspension.
- Placera plattan på is och omedelbart gå vidare till establishmenton organkulturer. Alternativt förbereda plattan före vävnadsuppsamlings, i vilket fall packa in den i para-film och lagra vid 4 ° C för senare användning. rekommenderas inte lagring längre än 6 timmar eftersom ECM kommer att torka ut.
4. Fastställande av organ kulturer
OBS: Detta steg beskriver hur man placerar decidual organkulturer och villösa organkulturer i separata transwell. Vävnaderna inte är i kontakt. Forskare som är intresserade i en co-kultur teknik där decidua och villi är i direkt kontakt med varandra, kan hänvisa till tidigare litteratur 9,10.
- Skölj prover två gånger i samlingen media, och centrifugera vid 1000 xg mellan varje sköljning. Överför vävnaden till en steril petriskål och plats på scenen av en dissekera mikroskop. Hålla 6-brunnar på is intill mikroskopet.
- Mikro-dissekera vävnad med sterila springer dissekera sax och pincett, att etablera 2-3 mm villi organkulturs (Figur 2A).
OBS: villi organkulturer är små, väl vaskulariserade "träd" med 2 eller 3 grenar och med framstående extravillous trofoblasten (EVT) cellkolonner 11. Det är viktigt att utnyttja endast villi vävnad från <9 veckor första trimestern prover, som invasionen av extravillous trofoblaster i ECM är mest uttalad vid dessa unga åldrarna 13. - Välj väl vaskulariserad villi med framstående EVT cellkolonner. EVT-cellkolonner framkallas som uppsvällda, "fuzzy", "fluffiga" ändar (se pilspetsar i figur 2A).
- Använd sterila pincett för att överföra 3 eller 4 villösa träd i varje transwell. Justera grenar så trädet placeras plant ovanpå ECM och separata hopklumpade grenar.
- Mikro-dissekera decidual vävnad med sterila springer dissekera sax och pincett, för att upprätta 3 mm 3 decidual organkulturer (figur 3a).
OBS: Prover innehåller två distinct typer av decidual vävnader, decidua parietalis och decidua capsularis (vänster och höger vävnadsfragment, respektive figur 3A). - Trimma med sax för att skapa 3 mm 3 stycken decidua parietalis. Decidua capsularis används inte för dessa kulturer. Använd pincett för att retas bort någon koagulerat moderns blod.
- Använd sterila pincett för att överföra 3-4 bitar av decidua i varje transwell.
- Tillsätt 1 ml Collection media till botten av brunnen. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C i 5% CO2
- För experiment där det är viktigt att efterlikna normala första trimestern placental syrespänning, underhålla villösa organkulturer i relativ hypoxi (3% O2).
OBS: Laboratorie inkluderar små hypoxi inkubator kammare som passar inuti befintliga inkubatorer, eller en tri-gas inkubator som introducerar extern N2 gas för att sänka syrehalten. - Tillsätt 1 ml av villi eller decidual medium (Table 1) till toppen av transwell efter 12-16 timmar av kultur.
OBS: Frånvaron av media under den första natten i kultur tillåter extravillous trofoblasten cell kolumner för att invadera (villi kultur), och för vävnaden (både villi och decidual) blir säkert inbäddad i ECM. I vår erfarenhet, decidual organkulturer förbli livskraftig för 72 timmar och villi organkulturer för 96 timmar. Vi rekommenderar experimentella ändpunkter som faller inom denna tidsram. Se tabell 1 för sammansättningen av villi och decidual medium. Villous mediet har en hög andel av FBS, medan decidual mediet kompletteras med graviditetshormoner (progesteron, 17p-östradiol) som upprätthåller den decidualized tillstånd (tabell 1).
5. Framställning av L. monocytogenes kulturer
OBS: För detaljerad protokollet om långtidslagring av L. monocytogenes, och kulturen och tillväxt av this organism i hjärnhjärtinfusions (BHI) buljong och agar, se Wang et al. 14
- Välj en enda L. monocytogenes koloni från strimmig BHI agarplatta och ympa 3 ml BHI-buljong.
- Inkubera L. monocytogenes kultur över natten (16 h), i en lutande position, vid 30 ° C.
OBS:. Dessa odlingsbetingelser bakterietillväxten för att nå stationär fas L. monocytogenes är flagellated vid 30 ° C, vilket ökar värdcellinvasion 15.
6. Infektion av organ kulturer med L. monocytogenes
- Varm PBS och villös eller decidual-medium (tabell 1) till 37 ° C.
- Använd sterila pincett för att avlägsna eventuella organkultur bitar som inte invadera in i ECM, och därför flyter i brunnen.
- Försiktigt aspirera media från botten av transwell. Skölj övre och undre transwell två gånger genom att försiktigt pipettera 1 ml av krigM PBS till väl, och noggrant aspiration däremellan. Försiktigt pipettera 1 ml av antibiotikafritt villi eller decidual media till övre och undre transwell. Var noga med att inte störa organkultur.
- Låt vävnaden inkubera i antibiotikafritt medium under åtminstone en timme för att säkerställa att antibiotika har tagits bort.
OBS: Vid stationär fas densiteten av L. monocytogenes kultur är ungefär 1 x 10 9 kolonibildande enheter (CFU) per ml. Antalet bakterier som används för att infektera kulturer organ bör bestämmas empiriskt för att möta experimentella behov. - För vild typ L. monocytogenes rutin infektion experiment visar robust invasion med en 1:50 utspädning av natten (4 x 10 7 L. monocytogenes i 1 ml medium per brunn). Resuspendera det lämpliga antalet bakterier i antibiotikafritt villi eller decidual medium.
- Aspirera media från toppen av transwell. Försiktigt tillsätt 1 ml inokulum. Inkubera plattorna vid 37° C i 5% CO2 för att möjliggöra för bakteriell invasion.
- Ta bort extracellulära bakterier genom att aspirera media från övre och undre transwell. Skölj brunnarna två gånger med varm PBS. Tillsätt 1 ml villösa eller decidual medium kompletterat med 50 | j, g ml -1 Gentamicin. Inkubera plattorna vid 37 ° C i 5% CO2.
OBS: L. monocytogenes är en frivillig intracellulär bakterie som kan växa i extracellulära mediet, växa inuti celler, och sprids från cell till cell utan tillgång till extracellulära utrymmet. Gentamicin har en bakteriedödande effekt på extracellulärt L. monocytogenes, och därmed möjliggör mätning av intracellulära L. monocytogenes tillväxt och sprids genom organodling 16.
OBS: Reproducerbar L. monocytogenes infektion av villösa och decidua organkulturer inträffar med 5 hr inkubationstider. Tiden för inkubation före tillsats av gentamicin kan modifieras baserat på experimentella behov och abbilitet av organismen att invadera vävnaden. För att bättre förstå de anatomiska platser är mest utsatta för infektion, kan kortare inkubationstider kan användas 2. - Bibehålla plattorna vid 37 ° C i 5% CO2 under hela experimentet. Förändra hela media i varje brunn dagligen.
OBS: Enligt vår erfarenhet, L. monocytogenes infekterade decidual organkulturer förbli livskraftig för 48 h och villi organkulturer under 72 timmar.
7. Skörd av Organ kulturer för Histopatologi
- Bered en färsk lösning av 4% paraformaldehyd genom att späda 10 ml av en 16% stam ampullen i 30 ml PBS. Store 4% paraformaldehyd vid 4 ° C, skyddat från ljus och använd inom en vecka. Ta till rumstemperatur före användning.
- Aspirera media från övre och undre transwell. skölj försiktigt brunnarna två gånger med PBS vid rumstemperatur. Försiktigt Tillsätt 1 ml 4% paraformaldehyd till toppen transwell att helt täcka organkultur.
- inkuberai 4% paraformaldehyd vid rumstemperatur under 20 min. Undvika längre inkubationstider eftersom detta skulle kunna leda till över fixering av vävnaden.
- Aspirera paraformaldehyd och skölj brunnarna två gånger med PBS vid rumstemperatur. Bädda kulturerna fasta organ i oktober medium, frysa, och avsnittet om en kryostat ( "fast fryst"). I allmänhet är fast frusen vävnad lättare att avsnitt än fryst vävnad utan föregående fixering.
OBS: För fullständig protokoll på oktober inbäddning och fryst sektionering, var vänlig gå relevanta avsnitt från publicerade protokoll 17,18. Beroende på experimentella behov och tillgänglig laboratorieutrustning och lagring, kan vävnad istället vara paraffininbäddade och sektioneras på en mikrotom 19. - Ytterligare förbereda vävnads diabilder för rutin Hematoxylin & Eosin färgning, immunofluorescens eller immunohistokemi 18,20,21.
Representative Results
Figur 1 (modifierad från Zeldovich & Bakardjiev 22) diagram relevant placenta och livmoder anatomi. Figur 2 visar representativa brutto och histologiska bilder av placenta villi, medan figur 3 visar decidual vävnad.
Detta protokoll först beskriver insamling av färsk placenta och decidual vävnad på sjukhus eller klinik. Det insamlade provet är en blandning av foster placenta (villi) och moderns livmoder komponenter (decidua). Efter sköljning med buffert innehållande antibiotika och antimykotika bredspektrum, är hela provet inspekteras med ögat med användning av en ljuslåda. Villi och decidua placeras i separata rör och transporteras på is till laboratoriet. I laboratoriet är ett dissektionsmikroskop som används för att uppskatta de fina morfologiska känne frisk vävnad. Representativa fotografier avvillous (Figur 2A) och decidual vävnader (Figur 3A) som förvärvades med ett dissektionsmikroskop med två externa svanhals ljuskällor visas för referens.
Villösa organkulturer genereras från första trimestern prover. Kulturer består av små terminala villösa träd med 2-6 grenar. Det är viktigt att dissekera villösa grenar som slutar i extravillous trofoblasten kolumner och är väl vaskulariserad. Dessa funktioner ses som "fluffig" eller "fuzzy" grenändar (pilspetsar) och svag rosa-röd linjär nyans som kurser genom trädets grenar till vänster i figur 2A. Däremot är kärl och extravillous trofoblaster inte lätt visualiseras för trädet till höger på bilden, vilket skulle vara suboptimalt för kultur. Under den första dagen av kultur, extravillous trofoblaster vandrar in i ECM, thus förankra villösa träden i matrisen på transwell.
Decidual organkulturer genereras från första och början andra trimestern exemplar. Hela livmoderslemhinnan omvandlas till decidua mycket kort tid efter implantation. Mer specifikt definierar decidua basalis livmoderslemhinnan direkt underliggande moderkakan / implanteringsstället, definierar decidua capsularis slemhinna som ligger över fostret, och decidua parietalis hänvisar till återstoden av livmoderslemhinnan. Visualisering under ett dissektionsmikroskop visar att den tidiga graviditets provet består till stor del av decidua parietalis och decidua capsularis (vänster och höger vävnadsfragment, respektive, i figur 3A). Är decidua capsularis lätt utmärker sig genom sin tunna, membran natur. För organkulturer är decidua parietalis trimmas till 3 mm 3 fragment med mikro-dissektion sax och adhEhyra levrat blod avlägsnas med pincett.
Efter inkubation över natten, är vävnader infekterade med L. monocytogenes. Infektionen protokoll som beskrivits ovan baseras på den Gentamicin-skyddsanalys användes för att studera intracellulära tillväxt och spridning av fakultativa intracellulära bakterier 16. Organkulturer i antibiotikafritt medium inkuberas med L. monocytogenes i 5 h. Kulturerna tvättades med steril PBS för att avlägsna bakterier från mediet. Därefter Gentamicin sätts för att eliminera extracellulära organismer. Tidigare litteratur från vårt laboratorium använt immunofluorescens och konfokalmikroskopi att avgöra bakteriell vävnadslokalisering vid olika tidpunkter efter infektion 2. Organkulturer sköljs i PBS, fixerades i 4% paraformaldehyd, och antingen frysta-inbäddade i oktober-medium och förvarades vid -80 ° C, eller paraffin-inbäddad och lagrades vid rumstemperatur. Vävnadssnitt kan vara stagranskat för immunofluorescens (IF) eller immunohistokemisk (IHC) analys av bakterier och eukaryota celler lokalisering. Figur 2B är en representant IF bild av en fryst sektion framställd av en 8,3 vecka villous organkultur vid 72 h efter infektion. Notera den tunga bakteriell belastning (grön fluorescens) i EVTs vid ändarna av de villösa grenar, och den relativa avsaknaden av bakterier inom trädet-beklädnad syncytiotrofoblast (röd fluorescens) skikt. I tidigare arbete, använde vi samma IF färgning för att lokalisera L. monocytogenes i villösa organkulturer vid olika tidpunkter efter infektion. Över 72 timmar, infektion sprids från EVT i under syncytial cytotrofoblaster och underliggande villi stroma. Noterbart är att synyctiotrophoblast skiktet var resistenta mot infektion 2.
Representativa ljusmikroskopiska bilder av H & E-färgade paraffininbäddade decidual vävnadssnitt framställd från 14,3 vecka specimens visas i figurerna 3B och 3C. Denna ECM-belagda transwell-membran var inbäddad för att visa organodling in situ (figur 3B). Bilden visar epitelceller kantade körtlar (asterisk) och endotel-fodrade kärl (diamant) placerad heterogent inom decidual stromal cellfacket. Dessutom finns det maternella immunceller utspridda i decidual stroma vid en variabel densitet. IHC och IF färgning kan användas för att bestämma bakteriell microanatomical lokalisering, i förhållande till specifik bosatta immunceller. Som ett exempel, CD14 + makrofager (grön fluorescens) lokalisera till slemhinnan i kärlsystemet och är utspridda i stroma (Figur 3D), medan stora aggregat av L. monocytogenes (röd fluorescens) observeras främst i decidual stroma vid 48 timmar efter infektion (Figur 3D).
| tvätt~~POS=TRUNC buffert~~POS=HEADCOMP | uppsamlingsmediet | villös mediet | decidual mediet |
| PBS | DMEM / F-12 med GlutaMAX | DMEM / F-12 med GlutaMAX | DMEM / F-12 med GlutaMAX |
| Penicillin 100 lU / ml | Fetalt bovint serum 2,5% | Fetalt bovint serum 20% | Fetalt bovint serum 2,5% |
| Streptomycin 100 | j, g / ml | Penicillin 100 lU / ml | Penicillin 100 lU / ml | 17β-östradiol 300 pg / ml |
| Gentamicin 50 | ig / ml | Streptomycin 100 | j, g / ml | Streptomycin 100 | j, g / ml | Progesteron 20 ng / ml |
| Amfotericin B 1,25 mikrogram / ml | Gentamicin 50 | ig / ml | ||
| < / Td> | Amfotericin B 1,25 mikrogram / ml |
Tabell 1:. Medie recept Komponenter och koncentrationer för beredning av tvättbuffert, Collection medium, villi medium och decidual medium.
Figur 1. placenta struktur. (A) Strukturen på feto-placental enhet i moderns livmoder, (B) Utvidgningen av rutan i (A) framhåller att foster trofoblast (T) fodrade moderkakan villi badar i moderns blod och förankras i decidua genom extravillous trofoblaster (EVT). Innesluten i villi är fetala fartyg (FV), fibroblaster och fostermakrofager. Modifierad från Zeldovich & Bakardjiev 22. "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: villi organkulturer - representant brutto och mikroskopiska bilder (A) Två terminal villösa träd med en graviditets 6 veckors ålder, som tittade på under ett dissektionsmikroskop.. Notera "fluffiga" ändar (pilspetsar) och framstående fosterkärl coursing genom trädets grenar till vänster som gör detta stycke lämplig för organkultur. (B) Immunofluorescensmikroskopi av organkultur (gestationsålder 8,3 veckor) 72 timmar efter infektion med Listeria monocytogenes, lyfta tunga bakteriell belastning [grön] i extravillous trofoblaster. DAPI visas i blått, och βHCG + syncytiotrophoblasts i rött. Skalstrecken = 1 mm (A), 250 | j, m (B).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Decidual organkultur - representant brutto och mikroskopiska bilder (A) decidua parietalis [vänster] och decidua capsularis [höger] på gestationsålder 6 veckor, sett under ett dissektionsmikroskop. (B) H & E-färgade delen av 14,3 vecka gestationsålder decidua parietalis organkultur visar körtlar och kärl organiserade heterogent genom decidual stroma. Den (diamant, ◆) och (asterisk, *) markerar representativa kärl och körteln, respektive. Brun linje nederst är Transwell membranet, på kanten. (C) H & E-färgade delen av 14,3 vecka gestationsålder decidua parietalis organkultur vid högre förstoring demonstrates muskel väggar spiral arterioler inbäddade i decidual stroma. Moderns immunceller är små med mörka runda kärnor, och är oregelbundet fördelade över stroma. (D) Immunofluorescens mikroskopi av organkultur 48 timmar efter infektion med L. monocytogenes, belyser stora zoner av bakterier [red] i decidual stroma och moderns CD14 + makrofager [grönt] foder en slingrig kärl utrymme och utspridda i stroma. Skalstrecken = 1 mm (A), 250 m (B), 50 m (C och D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Inavlade, transgena och knockout musstammar kan tjäna i experimentella system för att kraftigt testa mekanismer. Trots allmän bevarande av kärn genetiskt material, funktionella genomen hos möss och människor visar betydande skillnader i reglerande element 23. Det är därför inte förvånande, att lovande prekliniska studier i djurmodeller ibland inte rekapituleras i humanpatienter. Moderkakan visar mycket hög mellan arter mångfald, vilket gör djurmodeller mindre än idealisk för studier av mänskliga sjukdomar 24. Erkänner både anmärkningsvärda skillnader i människa och mus immunologi 25, och den uttalade divergerande utvecklingen i moderkakan anatomi, är det klokt att överväga att använda ex vivo odlingar av humana graviditets vävnader för experimentell undersökning organ.
Beskrivningarna, fotografiska bilder och instruktionsvideo i detta protokoll instruera forskare påhur man kan upprätta villi och decidual organkulturer på ECM-belagda transwell vävnadsodlingsinsatser. Fördelar med denna teknik inkluderar den relativa enkelheten hos mikro dissekering och mekaniskt stöd transwell systemet, i synnerhet i jämförelse med alternativa metoder, såsom 3D-inbäddade matriser eller organ slice kulturer. Suspension av organkultur på membranstöd möjliggör närings utbyte på alla vävnadsytor och livskraft upprätthålls för korttids kultur (96 tim för villösa kulturer, 72 timmar för decidual kulturer) .Detta teknik gör det möjligt att studera human placenta biologi vid vävnaden nivå, onekligen mer biologiskt relevanta än monolager cellodlingsmodeller.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är mikro dissektion av lämpliga villösa och decidual stycken för orgel kultur. Optimal vävnadsbitar demonstreras fotografiskt (Figur 2A och figur 3A) för att hjälpa forskare för vilkavisualisering av graviditetsprover är ny. Det är särskilt viktigt att välja villösa träd vars grenar slutar i EVT kolumner, eftersom dessa celler kommer att migrera in i ECM och hjälpa till att förankra villi till membranet. För båda typerna av organkulturer är användbart för att minimera störningar i vävnaden under medie förändringar genom att pipettera i en noggrann och lugnt sätt.
Denna teknik ger endast minimala svårigheter. Ibland prover visar kontaminering. Föroreningar är vanligtvis bakteriell (ibland poly-mikrobiell), och endast blir uppenbart efter 1-2 dagars odling. När förorening observeras ska blekmedel tillämpas kulturen kasseras, och vävnadsodling inkubatorn steriliseras för att förhindra ett långsiktigt problem. Det finns flera möjliga sätt förorening kan uppstå: i livmodern infektion, under operation, under prov skörd / bearbetning, eller under organkultur underhåll. Skörden och behandlingsstegen är den mest sannolika tidenoch plats för förorening att införas. Således är det viktigt att minska den tid som provstycket manipuleras under insamling och mikro-dissektion. Detta kommer att minska preparat exponering för den omgivande, icke-steril miljö. Beroende på laboratorie setup, kan dissekera mikroskop placeras inuti den sterila vävnadsodling huva.
Den histopatologiska analys av organkulturer efter infektion med medicinskt relevanta patogener L. monocytogenes, visas här som en möjlig tillämpning av protokollet. Immunofluorescens lokalisering av både bakterier och värdimmunceller efter infektion avkastningar nya insikter i mänsklig värd svar på patogener. Decidual organkulturer kan tjäna som en kompletterande ex vivo experiment teknik för att undersöka data som genereras från in vivo mus infektioner, inklusive spännande rapporter som visar defekter i murina decidual makrofag försvarsfunktioner 26,27. Dessutom, mänsklig orgen kulturer kan användas i blandad infektion strategier, såsom en konkurrenskraftig inokulum bestående av flera isogena stammar av L. monocytogenes. Konkurrenskraftig infektion av organkulturer är ett känsligt sätt att testa relevansen av virulensfaktorer inom den mänskliga värden. En begränsning med denna metod är vävnad livskraft, som är begränsad till korttids kultur (96 tim för villösa kulturer, 72 timmar för decidual kulturer). Detta är idealiskt för infektion med snabbt växande mikrober såsom L. monocytogenes, men längre kulturer kan vara nödvändiga för patogener som tar mer tid att etablera och sprida genom vävnad.
För att minska den globala bördan av graviditetskomplikationer, måste forskningen inriktas på att förstå patofysiologin av den mänskliga moder och foster gränssnitt. Bakterie-, svamp- och virala patogener som korsar från mor till foster orsaka förödande komplikationer av graviditet och fosterinfektion. Kontrollerade in vivo infektion av laboratorie animals vanligtvis vara den gyllene standarden för att ta itu med hur patogener kolonisera och transitering mellan organ 28. Eftersom placental anatomi varierar markant i däggdjursarter, är det av yttersta vikt att införliva mänsklig vävnad i forskningsstrategier. Mänskliga villösa och decidual organkulturer är mycket relevanta modellsystem för att undersöka värd-patogen interaktioner. För att studera denna viktiga men dåligt förstådd organ, kan forskarna dra nytta av det överflöd av annars kastas human placenta och decidual prover, med hjälp av organkultur strategier som beskrivs här.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A.
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I.
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
