Summary
Un metodo semplice per stabilire placentare primaria umana (villi) e colture d'organo deciduali è descritto. Villi e deciduali colture d'organo sono strumenti preziosi per lo studio patogenesi all'interfaccia materno-fetale umano. È dimostrata l'infezione con il batterio intracellulare facoltativi Listeria monocytogenes.
Abstract
La placenta presenta un elevato grado di variabilità anatomica interspecie. Per capire meglio la biologia e fisiopatologia della placenta umana, è indispensabile per progettare esperimenti che utilizzano cellule e tessuti umani. Un vantaggio della cultura organo è manutenzione di tridimensionale (3D) organizzazione strutturale e matrice extracellulare. L'obiettivo del metodo qui descritto è successo creazione di ex vivo culture gestazionale di organi tessuti umani e la loro manutenzione sana cultura per 72-96 ore. Dettagli Il protocollo la trasformazione immediata di ricerca titolari di autorizzazione, placentare e campioni deciduali fresco dalla sala operatoria. Questi sono i campioni abbondanti che altrimenti sarebbero buttati via. Istruzioni dettagliate sulla raccolta sterile di questi campioni, con dettagli morfologici su come selezionare i tessuti adeguati per stabilire colture d'organo 3D, è fornito. Tessuti villosi e deciduali placentari sono microdissezionate in 2-3 mm 3 pezzie collocato separatamente su filtri transwell matrice rivestita e coltivate per diversi giorni. Villi e colture d'organo deciduali sono adatti per lo studio delle interazioni ospite-patogeno umano. Rispetto ad altri organismi modello, queste culture umane sono particolarmente vantaggiose per esaminare meccanismo d'infezione per patogeni che dimostrano modelli variabili di specificità dell'ospite. A titolo di esempio, dimostriamo infezione di colture d'organo placentari e deciduali con i clinicamente rilevanti, facoltativi intracellulari batterio patogeno Listeria monocytogenes.
Introduction
L'infezione e l'infiammazione a livello di interfaccia materno-fetale rappresentano una delle principali fonti di morbilità e mortalità di donne e bambini. Capire come gli agenti patogeni infettano questi tessuti è fondamentale per lo sviluppo di nuove strategie per prevenire e curare malattie come il parto pretermine e morte fetale. Tuttavia, gli alti interspecie variabilità dell'interfaccia materno-fetale complica indagine sperimentale. Inoltre, gli agenti patogeni microbici più mostrano specificità dell'ospite, in tal modo molti modelli animali non può ricapitolare completamente malattie infettive umane. Alcuni organismi (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio colera, e numerosi altri) sono strettamente patogeno per l'uomo, mentre altri, come la Listeria monocytogenes, mostrano un livello più intermedio di specificità dell'ospite 1. Specificità dell'ospite è stata documentata in molti aspetti della patogenesi, tra cui la colonizzazione 2, 3 diffusione, evasione immune 4 5. Pertanto, è della massima importanza per selezionare ottimali sistemi modello host.
Composto di cellule fetali e sangue materno, la placenta è un organo che si sviluppa rapidamente nel corso della gestazione 6. In termini più semplici, la placenta umana è costruito con strutture ad albero simile a "villi" fetali bagnata nel sangue materno. Gas e lo scambio di nutrienti avviene attraverso strati di cellule fetali specializzate chiamate trofoblasto che rivestono la superficie degli alberi dei villi. Il rivestimento della mucosa uterina materna, chiamato endometrio nelle femmine non gravide, trasforma strutturalmente e funzionalmente nella decidua per accogliere l'unità fetoplacentare. alberi villi sono ancorati in utero da trophoblasts extravilloso (EVT) che migrano da ancoraggio colonne di celle nella decidua. L'interfaccia materno fetale, pertanto, consiste decidua e placenta.
La tecnica di coltura d'organo descritti quiè stato utilizzato per esaminare dove e come clinicamente rilevanti patogeni umani, tra cui L. monocytogene s e Toxoplasma gondii, attraversano la barriera placentare 2,7. Questi ex vivo colture d'organo replicano in architettura del tessuto vivo, e sono sistemi modello probabilmente fisiologicamente altamente rilevanti per placentation umana. Ulteriori tecniche di coltura sono interi espianti di organi, fette di organi, tessuti e cellule o staminali organoidi incorporati in 3D a matrice. Per i dettagli su queste opzioni, si prega di fare riferimento a una recente revisione completa 8. Si prega di notare che questo protocollo è per la cultura separata di decidua e villi della placenta. Per studiare l'interazione tra le cellule placentari e cellule deciduali, una tecnica di co-coltura può essere preferito. Ci riferiamo il lettore interessato alla tecnica di co-coltura dei villi-decidua precedentemente descritto, utilizzato dai ricercatori che studiano rimodellamento vascolare deciduali trofoblasto-mediata 9-11.
Protocol
Gli esperimenti sono stati condotti secondo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki. Questo studio è stato approvato dal Institutional Review Board presso l'Università della California, San Francisco (CHR # 11-05.530). Tutti i pazienti hanno fornito consenso informato scritto per la raccolta di campioni e successiva analisi. Tessuto è stato raccolto come campioni de-identificati.
NOTA: Il ricercatore deve ottenere l'approvazione dal loro soggetti umani comitato di revisione istituzionale. L'esclusione di esemplari sulla base di storia o placentari gestazionale anomalie varierà a seconda delle esigenze di ogni studio specifico.
NOTA: le condizioni di sicurezza appropriate (livello di biosicurezza 2) dovrebbero essere utilizzati per tutte le fasi di questo protocollo 12.
1. Preparazione, prima della raccolta Giorno
- filtri autoclave / pinze per la raccolta, e forbici / pinze per micro-dissezione.
- Preparare adeguato volume (500 ml per campione) di tampone di lavaggio (rifer alla Tabella 1 per ricetta).
- Preparare adeguato volume (100 ml per campione) di 0,22 micron collezione media sterile filtrata (fare riferimento alla Tabella 1 per ricetta).
- Aliquota matrice extracellulare (ECM, fare riferimento alla Tabella dei reagenti per i dettagli) per l'archiviazione a lungo termine.
- Conservare ECM in forma solida a -20 ° C. Per ottenere le migliori prestazioni, evitare di ripetere disgelo congelare. bottiglia Scongelare a una soluzione viscosa a 4 ° C, e preparare 300 microlitri aliquote nella stanza fredda con punte per pipette refrigerati. aliquote conservare a -20 ° C.
2. Raccolta di tessuto fresco
ATTENZIONE: Quando si lavora con il tessuto umano fresco, i ricercatori devono seguire le precauzioni universali (OSHA) per prevenire la trasmissione di patogeni generati dal sangue, e devono aver ricevuto un'adeguata formazione istituzionale. dispositivi di protezione individuale corretta, compresi i guanti, occhiali protettivi e camici da laboratorio sono necessari.
- Trasportoautoclave-filtri (uno per campione), in autoclave-pinze, tampone di lavaggio (damigiana), collezione media (25 ml per campione in un tubo conico da 50 ml), bottiglia dello spruzzo, il 10% di candeggina, il 70% di etanolo, vasca di raccolta dei tessuti, sharpie e secchiello per il ghiaccio / radiatore in ospedale / clinica.
NOTA: I campioni vengono ricevuti in uno spazio di ricerca-designato situato in una stanza vicino alla sala operatoria. Una cappa coltura tissutale sterile non è necessario, ma la raccolta deve avvenire rapidamente e il ricercatore dovrebbe opportunamente sanificare superfici, come descritto di seguito. - Luogo damigiana di tampone di lavaggio adiacente al lavandino, e spruzzare rubinetto con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo. vaschetta di raccolta del tessuto Posizionare il vetro dalla sorgente di luce (pad leggero o light box), e disinfettare con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo. Lasciare asciugare all'aria.
- Avere i campioni carry clinico dalla sala operatoria alla sala preparazione dei campioni. Al lavandino, versare il campione in cima sterile colino a mano, lavare il tessuto più volte erah tampone, e trasferire interi campione in tampone per vassoio di vetro sterilizzata in cima fonte di luce.
NOTA: La valutazione del tessuto da parte del medico è di massima priorità, quindi le seguenti operazioni vengono eseguite solo dopo che il medico abbia verbalmente indicato che lui / lei ha terminato la valutazione. - Utilizzare pinza sterile per selezionare villi della placenta e decidua (figure 2A e 3A) per la raccolta e il trasferimento di separare 50 ml provette coniche. Etichettare i tubi con l'età gestazionale.
NOTA: preferita età gestazionale sono a meno di 9 settimane e meno di 16 settimane rispettivamente per placenta e decidua,. Al istituzione, solo una frazione di ciascun campione è procurato a fini di ricerca, come tessuto adeguata deve rimanere per la diagnosi clinica patologica. - Conservare e di trasporto dei campioni sul ghiaccio al laboratorio di ricerca.
- Per raccogliere più di un esemplare, disinfettare il vassoio di vetro come descritto sopra con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo tra il collection di ogni campione.
3. Preparazione di piatti Organ Culture
NOTA: Le seguenti operazioni devono essere eseguite con tecnica sterile in una cappa di coltura di tessuti. E 'ideale per il microscopio da dissezione per essere collocata in un campo sterile. Tuttavia, questo non è assolutamente necessario finchè micro-dissezione viene eseguita rapidamente, e strumenti sono immersi frequentemente in etanolo al 70%.
- fiala Thaw ECM (s) su ghiaccio. Diluire il ECM 1: 1 con la collezione media di ghiaccio-freddo, mescolare pipettando. Pipetta lentamente per evitare l'introduzione di bolle. Ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale 6 pozzetti richiede 100 ml di questa sospensione e può ospitare 3-4 colture d'organo.
- Inserti posto transwell (dimensione dei pori 0,4 micron) in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale 6-bene.
- Coat ogni Transwell inserto con un sottile strato (100 microlitri) della ECM / sospensioni media.
- Posizionare la piastra su ghiaccio ed immediatamente procedere alla establishment di colture d'organo. In alternativa, preparare il piatto prima della raccolta dei tessuti, nel qual caso avvolgerla in para-pellicola e conservare a 4 ° C per un uso successivo. Di inattività di oltre 6 ore non è raccomandato come la ECM si secca.
4. Istituzione di colture d'organo
NOTA: Questo passaggio viene descritto come posizionare colture d'organo deciduali e colture d'organo villi in transwells separati. I tessuti non sono in contatto. Ricercatori interessati ad una tecnica di co-coltura dove decidua e villi sono in contatto diretto con l'altro, possono riferirsi alla preventiva letteratura 9,10.
- Lavare i campioni due volte in collezione media, e centrifugare a 1000 xg tra ogni risciacquo. Trasferire il tessuto di una piastra di Petri sterile e posto sul palco di un microscopio da dissezione. Mantenere 6 pozzetti su ghiaccio adiacente al microscopio.
- tessuto Micro-sezionare con Springer dissezione forbici e pinze sterili, per stabilire la cultura d'organo dei villi 2-3 mms (Figura 2A).
NOTA: villi colture d'organo sono piccoli, ben vascolarizzato "alberi" con 2 o 3 filiali, e con importanti colonne di celle trofoblasto extravilloso (EVT) 11. E 'importante utilizzare solo il tessuto dei villi da <9 settimana esemplari primo trimestre, come l'invasione di trofoblasto extravilloso in ECM è più pronunciata in questi giovani età 13. - Selezionare villi ben vascolarizzato con importanti colonne di celle EVT. Colonne di celle EVT sono visualizzati come bulbosa, "fuzzy", finisce "soffici" (si riferiscono a punte di freccia in Figura 2A).
- Utilizzare pinze sterili per trasferire i 3 o 4 alberi villi in ogni transwell. Regolare rami in modo albero è posizionato in cima piatta ECM e rami clumped separati.
- Micro-sezionare il tessuto decidua con Springer dissezione forbici e pinze sterili, per stabilire 3 mm 3 colture d'organo deciduali (Figura 3a).
NOTA: I campioni contengono due distipi di tessuti stinti deciduali, parietalis decidua e decidua capsularis (sinistra e destra frammenti di tessuto, rispettivamente, Figura 3a). - Tagliare con le forbici per creare 3 mm 3 pezzi di decidua parietalis. Decidua capsularis non viene utilizzato per queste culture. Utilizzare pinze a prendere in giro via qualsiasi sangue materno coagulato.
- Utilizzare pinze sterili per trasferire 3-4 pezzi di decidua in ogni transwell.
- Aggiungere 1 ml di raccolta media per fondo al pozzo. Incubare la piastra per una notte a 37 ° C in 5% di CO 2
- Per gli esperimenti in cui è importante per imitare normale tensione di ossigeno placentare primo trimestre, mantenere colture d'organo villi a ipossia relativa (3% O 2).
NOTA: Le opzioni di laboratorio comprendono piccole camere ipossia incubatore che si inseriscono all'interno di incubatori esistenti, o un incubatore tri-gas che introduce esterno gas N 2 per abbassare la concentrazione di ossigeno. - Aggiungere 1 ml di villi o medio deciduale (TabLe 1) alla parte superiore del transwell dopo 12-16 ore di cultura.
NOTA: L'assenza di supporto durante la prima notte nella cultura permette alle colonne di celle trofoblasto extravilloso di invadere (cultura dei villi), e per il tessuto (sia dei villi e decidua) per diventare incorporato saldamente in ECM. Nella nostra esperienza, deciduali colture d'organo rimangono vitali per 72 ore e di organi dei villi culture per 96 ore. Si consiglia di endpoint sperimentali che rientrano in questo lasso di tempo. Vedere la Tabella 1 per la composizione di villi e deciduale media. Media dei villi ha un'alta percentuale di FBS, mentre media deciduale è completato con ormoni della gravidanza (progesterone, 17b-estradiolo) che mantengono lo stato decidualized (Tabella 1).
5. Preparazione di L. monocytogenes Culture
NOTA: Per il protocollo dettagliate sulla conservazione a lungo termine di L. monocytogenes, e la cultura e la crescita di This organismo in infusione cuore del cervello (BHI) brodo e agar, si prega di fare riferimento a Wang et al. 14
- Scegliere un singolo L. monocytogenes colonia dalla piastra di agar BHI striato e inoculare 3 ml di brodo BHI.
- Incubare la L. monocytogenes cultura durante la notte (16 ore), in una posizione inclinata, a 30 ° C.
NOTA:. Queste condizioni di coltura consentono la crescita di batteri di raggiungere fase stazionaria L. monocytogenes viene flagellato a 30 ° C, che aumenta l'invasione della cellula ospite 15.
6. L'infezione delle Culture organo con L. monocytogenes
- Caldo PBS e dei villi o medio deciduale (Tabella 1) a 37 ° C.
- Utilizzare le pinzette sterili per rimuovere eventuali pezzi di cultura organo che non ha invaso nella ECM, e sono quindi galleggiano nel pozzo.
- Con attenzione aspirare i media dal fondo del transwell. Risciacquare transwells superiori e inferiori due volte pipettando delicatamente 1 ml di guerram PBS in bene, e con attenzione aspirando in mezzo. Delicatamente pipetta da 1 ml di villi o deciduale mezzi privi di antibiotici per transwell superiore e inferiore. Fare attenzione a non disturbare la cultura d'organo.
- Sia il tessuto incubare in terreno senza antibiotico per almeno un ora per garantire che gli antibiotici sono stati rimossi.
NOTA: In fase stazionaria la densità della L. cultura monocytogenes è di circa 1 x 10 9 unità formanti colonie (CFU) per ml. Il numero di batteri utilizzati per infettare colture d'organo dovrebbe essere empiricamente determinato a soddisfare le esigenze sperimentali. - Per il tipo selvaggio L. monocytogenes esperimenti di infezione di routine mostrano invasione robusto con una diluizione 1:50 del pernottamento (4 x 10 7 L. monocytogenes in 1 ml di mezzi per pozzetto). Risospendere il numero appropriato di batteri in media dei villi o deciduale senza antibiotico.
- supporti Aspirare dalla parte superiore del transwells. Delicatamente aggiungere 1 ml di inoculo. Incubare le piastre a 37° C in 5% CO 2 per consentire invasione batterica.
- Rimuovere i batteri extracellulari aspirando supporti da transwells superiori e inferiori. Risciacquare pozzi due volte con caldo PBS. Aggiungere 1 ml di villi o supporti deciduali integrato con 50 mg ml -1 Gentamicina. Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO 2.
NOTA: L. monocytogenes è un batterio intracellulare facoltativo che può crescere in mezzo extracellulare, crescere all'interno delle cellule e diffondersi da cellula-cellula senza accedere allo spazio extracellulare. Gentamicina ha un effetto battericida su extracellulare L. monocytogenes, e permette quindi la misura di intracellulare L. monocytogenes crescita e la diffusione attraverso la cultura organo 16.
NOTA: riproducibile L. infezione monocytogenes di colture d'organo villosi e decidua avviene con tempi di incubazione 5 hr. Il tempo di incubazione prima aggiunta di gentamicina può essere modificato in base alle esigenze sperimentali e abilità dell'organismo di invadere il tessuto. Per capire meglio i siti anatomici più vulnerabili alle infezioni, tempi di incubazione più brevi possono essere usati 2. - Mantenere piastre a 37 ° C in 5% CO 2 per la durata dell'esperimento. Cambiare tutto media in ogni pozzetto quotidiana.
NOTA: Nella nostra esperienza, L. monocytogenes -infected colture d'organo deciduali rimangono vitali per 48 ore e di organi dei villi culture per 72 ore.
7. Raccolta di Organ Culture per istopatologia
- Preparare una soluzione fresca di 4% paraformaldeide diluendo 10 ml di 16% stock fiala in 30 ml di PBS. Store 4% paraformaldeide a 4 ° C, al riparo dalla luce, e consumare entro una settimana. Portare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- supporti Aspirare da transwell superiore e inferiore. Lavare delicatamente i pozzetti due volte con PBS a temperatura ambiente. aggiungere delicatamente 1ml 4% paraformaldeide in alto transwell per coprire completamente la cultura d'organo.
- covarein paraformaldeide 4% a temperatura ambiente per 20 min. Evitare tempi di incubazione più lunghi in quanto ciò potrebbe portare a un eccesso di fissaggio del tessuto.
- Aspirare paraformaldeide e pozzi di risciacquo per due volte con PBS a temperatura ambiente. Incorpora le colture d'organo fisso a medio ottobre, congelare, e la sezione su un criostato ( "fisso congelata"). In generale, il tessuto congelato fisso è più facile da parte di tessuti congelati senza fissazione preventiva.
NOTA: Per il protocollo completa su ottobre embedding e sezionamento congelati, si prega di accedere sezioni pertinenti da protocolli pubblicati 17,18. A seconda delle esigenze sperimentali e di laboratorio a disposizione e lo stoccaggio, il tessuto può invece essere inclusi in paraffina e sezionato su un microtomo 19. - Ulteriori Preparare vetrini di tessuto per la routine Ematossilina e Eosina colorazione, immunofluorescenza o immunoistochimica 18,20,21.
Representative Results
Figura 1 (modificato da Zel'dovic & Bakardjiev 22) Schemi la placentare rilevante e l'anatomia uterina. La Figura 2 mostra lordo rappresentante e immagini istologiche dei villi della placenta, mentre la figura 3 mostra il tessuto deciduali.
Questo protocollo prima descrive la collezione di placentare fresco e del tessuto deciduali presso l'ospedale o clinica. Il campione raccolto è una miscela di placentare fetale (villi) e componenti uterine materne (decidua). Dopo il risciacquo con tampone contenente antibiotici ad ampio spettro e antimicotici, l'intero campione è controllato da occhio utilizzando una scatola luminosa. Villi e decidua sono posti in tubi separati e trasportati in ghiaccio al laboratorio. In laboratorio, un microscopio da dissezione viene utilizzato per apprezzare le caratteristiche morfologiche sottili di tessuto sano. fotografie rappresentativi divilli (Figura 2A) e tessuti decidua (Figura 3A) che sono stati acquisiti con un microscopio da dissezione con due sorgenti luminose a collo d'oca esterne sono rappresentate per riferimento.
colture d'organo dei villi sono generati da campioni primo trimestre. Le culture sono costituiti da piccoli alberi villi terminali con 2-6 rami. E 'importante analizzare i rami dei villi che terminano in colonne trofoblasto extravilloso e sono ben vascolarizzate-. Queste caratteristiche sono visti come fini filiali (frecce) "soffice" o "fuzzy", e la tonalità lineare di colore rosa-a-rosso tenue che i corsi attraverso i rami dell'albero a sinistra nella figura 2A. Al contrario, vascolarizzazione e trophoblasts extravilloso non sono facilmente visualizzati per l'albero a destra di questa immagine, che sarebbe ottimale per la cultura. Nel corso del primo giorno della cultura, i trophoblasts extravilloso migrano nella ECM, thus ancorare gli alberi villi nella matrice sul transwell.
colture d'organo decidual sono generati dal primo e primi esemplari secondo trimestre. L'intero rivestimento uterino si trasforma in decidua molto poco dopo l'impianto. Più specificamente, decidua basale definisce la mucosa uterina sottostante direttamente il sito placenta / impianto, decidua capsularis definisce mucosa sovrastante il feto e decidua parietalis riferisce al resto del rivestimento uterino. Visualizzazione sotto un microscopio da dissezione mostra che il primo esemplare gestazionale è costituito in gran parte da parietalis decidua e decidua capsularis (sinistra e frammenti di tessuto di destra, rispettivamente, nella Figura 3A). La capsularis decidua è facilmente distingue per la sua natura sottile, membranosa. Per colture d'organo, decidua parietalis viene tagliato a 3 mm 3 frammenti con le forbici micro-dissezione e Adheaffitto sangue coagulato viene rimosso con una pinza.
Dopo l'incubazione durante la notte, i tessuti sono infettati con L. monocytogenes. Il protocollo infezione sopra descritto è basato sulla saggio di protezione gentamicina utilizzata per studiare la crescita intracellulare e la diffusione dei batteri intracellulari facoltativi 16. Colture d'organo in mezzo privo di antibiotici vengono incubate con L. monocytogenes per 5 ore. Le culture sono lavate con PBS sterile per rimuovere i batteri dal mezzo. Successivamente, gentamicina viene aggiunto per eliminare organismi extracellulari. Letteratura Prima dal nostro laboratorio utilizzato immunofluorescenza e microscopia confocale per determinare la localizzazione del tessuto batterica a vari intervalli di tempo dopo l'infezione 2. colture d'organo sono sciacquati in PBS, fissati in paraformaldeide al 4%, e sia congelato-embedded in media di Office e conservati a -80 ° C, o inclusi in paraffina e conservati a temperatura ambiente. Le sezioni di tessuto possono essere STAINED per immunofluorescenza (IF) o l'analisi immunoistochimica (IHC) di batteri e la localizzazione delle cellule eucariotiche. figura 2B è un rappresentante se l'immagine di una sezione congelata preparato da una cultura organo villi 8,3 settimane a 72 ore dopo l'infezione. Nota l'onere pesante batterica (fluorescenza verde) nel EVTS alle estremità dei rami villi, e la relativa mancanza di batteri all'interno (fluorescenza rossa) strato albero fodera syncytiotrophoblast. In lavori precedenti, abbiamo usato simili se la colorazione a localizzare L. monocytogenes in colture d'organo villi a diversi intervalli di tempo dopo l'infezione. Oltre il 72 hr, la diffusione dell'infezione da EVT in citotrofoblasti sub-sinciziale e sottostante stroma dei villi. In particolare, lo strato synyctiotrophoblast era resistente alle infezioni 2.
Rappresentante immagini microscopiche di luce su sezioni di tessuto deciduali incluse in paraffina H & E-colorate preparate da 14,3 settimane specimens sono illustrati nelle figure 3B e 3C. Questa membrana transwell ECM rivestite è stato incorporato per mostrare la cultura d'organo in situ (Figura 3B). L'immagine mostra ghiandole epiteliali-allineati (asterisco) e vascolare endoteliale-allineati (diamante) posizionati in modo eterogeneo all'interno del compartimento di cellule stromali deciduali. Inoltre, ci sono cellule del sistema immunitario materno sparsi in tutto lo stroma deciduali ad una densità variabile. IHC e IF colorazione può essere utilizzato per determinare la localizzazione microanatomical batterica, rispetto alle cellule immunitarie specifiche residenti. Come esempio, macrofagi CD14 + (fluorescenza verde) localizzano al rivestimento dei vasi e sono sparsi nello stroma (Figura 3D), mentre grandi aggregati di L. monocytogenes (fluorescenza rossa) si osservano prevalentemente nello stroma deciduali a 48 ore dopo l'infezione (Figura 3D).
| tampone di lavaggio | medio Collection | media dei villi | medio decidual |
| PBS | DMEM / F-12 con Glutamax | DMEM / F-12 con Glutamax | DMEM / F-12 con Glutamax |
| Penicillina 100 UI / ml | Siero fetale bovino 2,5% | Siero fetale bovino al 20% | Siero fetale bovino 2,5% |
| Streptomicina 100 mg / ml | Penicillina 100 UI / ml | Penicillina 100 UI / ml | 17β-estradiolo 300 pg / ml |
| Gentamicina 50 ug / ml | Streptomicina 100 mg / ml | Streptomicina 100 mg / ml | Progesterone 20 ng / ml |
| L'amfotericina B 1.25 mg / ml | Gentamicina 50 ug / ml | ||
| < / Td> | L'amfotericina B 1.25 mg / ml |
Tabella 1:. Ricette Media Components e concentrazioni per la preparazione di tampone di lavaggio, di medie Collection, medio dei villi, e medio deciduale.
Figura 1. placentare struttura. (A) Struttura di unità feto-placentare in utero materno, (B) Allargamento della scatola in (A) evidenzia che trofoblasto fetale (T) rivestito villi placentari sono bagnate nel sangue materno e ancorati nella decidua da trophoblasts extravilloso (EVT). Contenuti in villi sono vasi fetali (FV), fibroblasti e macrofagi fetali. Modificato da Zel'dovic e Bakardjiev 22. "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: villi organo culture - lordo Rappresentante e immagini microscopiche (A) Due alberi villi terminali con un'età gestazionale di 6 settimane, come visto sotto un microscopio da dissezione.. Notare i "morbidi" estremità (frecce) e di primo piano vascolarizzazione fetale che scorrono attraverso i rami degli alberi sulla sinistra che rendono questo pezzo adatto per la cultura d'organo. (B) La microscopia ad immunofluorescenza della cultura d'organo (età gestazionale 8.3 settimane) dopo l'infezione 72 ore con Listeria monocytogenes, mettendo in evidenza la carica batterica pesante [green] in trophoblasts extravilloso. DAPI è mostrata in blu, e βHCG + sinciziotrofoblasti in rosso. Barre di scala = 1 mm (A), 250 micron (B).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Coltura d'organo deciduale - lordo rappresentante e immagini microscopiche (A) decidua parietalis [left] e capsularis decidua [destra] in età gestazionale 6 settimane, come visto sotto un microscopio da dissezione. Sezione (B) H & E-macchiato della cultura d'organo 14,3 settimane di età gestazionale decidua parietalis mostra ghiandole e vasi organizzati eterogeneo tutta stroma deciduali. L'(diamante, ◆) e (asterisco, *) evidenziano nave rappresentante e della ghiandola, rispettivamente. linea marrone al bordo inferiore è transwell membrana, sul bordo. (C) H & E-macchiato tratto di 14,3 settimane di età gestazionale decidua parietalis cultura d'organo a più alto ingrandimento demonstrates arteriole spirale muscolare con pareti incorporati in stroma decidua. cellule immunitarie materne sono piccole, con nuclei rotondi scuri, e sono distribuiti in modo irregolare in tutto il stroma. (D) La microscopia ad immunofluorescenza della cultura organo 48 ore dopo l'infezione da L. monocytogenes, evidenziando ampie zone di batteri [rosso] in stroma decidua, e CD14 + materna macrofagi [green] rivestimento uno spazio vascolare tortuoso e dispersi nello stroma. Scala bar = 1 mm (A), 250 micron (B), 50 micron (C e D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Inbred, transgenici e topi knockout ceppi possono servire in sistemi sperimentali per testare robusto meccanismi. Tuttavia, nonostante la conservazione generale del materiale genetico di base, i genomi funzionali di topi ed esseri umani mostrano differenze significative in elementi regolatori 23. Non è sorprendente, quindi, che i promettenti studi preclinici in modelli animali sono a volte non ricapitolato in pazienti umani. La placenta mostra molto alta interspecie diversità, rendendo modelli animali meno ideale per lo studio delle malattie umane 24. Riconoscendo entrambe le notevoli differenze nel campo dell'immunologia umana e topo 25, e l'evoluzione divergente pronunciato in anatomia placentare, è prudente considerare l'uso di ex vivo colture d'organo di tessuti umani per gestazionale indagine sperimentale.
Le descrizioni, immagini fotografiche e video di istruzioni in questo protocollo istruire i ricercatori sucome stabilire dei villi e colture d'organo deciduali su inserti di coltura di tessuti transwell ECM rivestite. I vantaggi di questa tecnica sono la relativa semplicità del micro-dissezione e sistema di supporto transwell meccanico, in particolare rispetto ai metodi alternativi come matrici 3D incorporati o culture fetta organo. Sospensione della cultura organo sul supporto della membrana consente lo scambio di sostanze nutritive a tutte le superfici di tessuto e la sostenibilità viene mantenuta per la cultura a breve termine (96 ore per le culture dei villi, 72 ore per le culture deciduali) .Questa tecnica permette di studiare la biologia della placenta umana al tessuto livello, innegabilmente biologicamente più rilevanti rispetto ai modelli di colture cellulari monostrato.
La fase più critica in questo protocollo è il micro-dissezione di adeguati pezzi villosi e deciduali per la cultura d'organo. Pezzi ottimali di tessuto sono dimostrati fotograficamente (Figura 2A e 3A Figura) per aiutare i ricercatori per i qualivisualizzazione dei campioni gestazionale è nuovo. È particolarmente importante selezionare alberi villi cui rami terminare in colonne EVT, come queste cellule migrano nelle ECM e contribuire ad ancorare la villi alla membrana. Per entrambi i tipi di colture d'organo è utile per ridurre al minimo i disturbi al tessuto durante i cambi di mezzi di dispensazione in modo attento e senza fretta.
Questa tecnica presenta difficoltà solo minime. In alcune occasioni, i campioni mostrano la contaminazione. La contaminazione è di solito batterica (occasionalmente poli-microbica), e diventa evidente solo dopo 1-2 giorni di coltura. Una volta che la contaminazione si osserva, candeggina dovrebbe essere applicata, la cultura scartata, e il tessuto culturale incubatore sterilizzato per evitare un problema a lungo termine. Ci sono diversi modi possibili di contaminazione potrebbe derivare: a infezioni utero, durante l'intervento chirurgico, durante il provino raccolta / elaborazione, o durante la manutenzione dell'organo cultura. Le fasi di raccolta e di lavorazione sono il momento più probabilee il luogo per la contaminazione da introdurre. Pertanto, è importante per ridurre la quantità di tempo che il campione viene manipolato durante la raccolta e micro-dissezione. Questo ridurrà l'esposizione del campione verso l'ambiente, ambiente non sterile. A seconda della configurazione di laboratorio, il microscopio da dissezione può essere posizionato all'interno della cappa coltura tissutale sterili.
L'analisi istopatologica di colture d'organo dopo l'infezione con l'agente patogeno clinicamente rilevante L. monocytogenes, è indicata qui come una possibile applicazione del protocollo. Immunofluorescenza la localizzazione di entrambi i batteri e cellule immunitarie dell'ospite dopo che i rendimenti infezione nuove intuizioni nella risposta dell'ospite umano ai patogeni. Decidual colture d'organo potrebbe servire come complementare ex vivo tecnica esperimento per esaminare i dati generati dalle infezioni di topo in vivo, comprese le relazioni interessanti che mostrano difetti di funzioni macrofagi difesa deciduali murini 26,27. Inoltre, org umanaun culture possono essere utilizzati nelle strategie mista infezione, come ad esempio un inoculo competitiva composta da diversi ceppi isogeni di L. monocytogenes. infezione competitivo delle colture d'organo è un modo sensibile per testare la rilevanza dei fattori di virulenza all'interno dell'ospite umano. Un vincolo di questo metodo è la vitalità del tessuto, che è limitata alla cultura a breve termine (96 ore per le culture dei villi, 72 ore per le culture deciduali). Questo è l'ideale per l'infezione da microbi a crescita rapida come L. monocytogenes, ma le culture più lunghi possono essere necessari per gli agenti patogeni che richiedono più tempo per stabilire e diffondere attraverso il tessuto.
Per ridurre il peso globale delle complicazioni della gravidanza, la ricerca deve concentrarsi sulla comprensione della fisiopatologia dell'interfaccia materno-fetale umano. Batteriche, fungine, e patogeni virali che attraversano dalla madre al feto causa devastanti complicazioni della gravidanza e l'infezione fetale. Controllata in infezioni vivo di laboratorio aniMalles è in genere considerato il gold standard per l'indirizzamento come agenti patogeni colonizzano e di transito tra gli organi 28. Perché anatomia placentare varia notevolmente tra le specie di mammiferi, è della massima importanza per integrare il tessuto umano nelle strategie di ricerca. Umani villosi e deciduali colture d'organo sono molto importanti sistemi modello per indagare le interazioni ospite-patogeno. Per studiare questo organo vitale ancora poco conosciuta, i ricercatori possono sfruttare l'abbondanza di placenta umana altrimenti scartati e campioni deciduali, utilizzando strategie di cultura organo come descritto qui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A.
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I.
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
