Summary
प्राथमिक मानव अपरा (विलस) और decidual अंग संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक सरल विधि वर्णित है। विलस और decidual अंग संस्कृतियों मानव मातृ-भ्रूण इंटरफेस में रोगजनन के अध्ययन के लिए अमूल्य उपकरण हैं। ऐच्छिक intracellular जीवाणु लिस्टेरिया monocytogenes के साथ संक्रमण प्रदर्शन किया है।
Abstract
नाल interspecies शारीरिक परिवर्तनशीलता की एक बड़ी डिग्री से पता चलता है। सबसे अच्छा जीव विज्ञान और मानव प्लेसेंटा के pathophysiology समझने के लिए, यह मानव कोशिकाओं और ऊतकों का उपयोग कर प्रयोगों डिजाइन करने के लिए आवश्यक है। अंग संस्कृति का एक लाभ यह तीन आयामी (3 डी) के रखरखाव के संरचनात्मक संगठन और बाह्य मैट्रिक्स है। यहाँ वर्णित विधि के लक्ष्य पूर्व vivo मानव गर्भावधि ऊतक अंग संस्कृतियों की सफल स्थापना और 72-96 घंटे के लिए उनके स्वस्थ संस्कृति रखरखाव है। प्रोटोकॉल विवरण ऑपरेटिंग सूट से ताजा शोध सहमति दे दी है, अपरा और decidual नमूनों की तत्काल प्रसंस्करण। ये प्रचुर मात्रा में नमूनों कि अन्यथा त्याग किया जाएगा रहे हैं। कैसे उचित ऊतकों का चयन करने के लिए 3 डी अंग संस्कृतियों की स्थापना के लिए पर शब्द के भागों विवरण सहित इन नमूनों के संग्रह बाँझ पर विस्तृत निर्देश प्रदान की जाती है। अपरा विलस और decidual ऊतकों 2-3 मिमी 3 टुकड़ों में microdissected रहे हैंऔर कई दिनों के लिए मैट्रिक्स लाइन transwell फिल्टर पर अलग से रखा जाता है और सुसंस्कृत। विलस और decidual अंग संस्कृतियों में अच्छी तरह से मानव मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं। अन्य मॉडल जीवों की तुलना में, इन मानव संस्कृतियों विशेष रूप से रोगज़नक़ों कि मेजबान विशिष्टता के चर पैटर्न का प्रदर्शन के लिए संक्रमण की व्यवस्था की जांच के लिए फायदेमंद हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम चिकित्सकीय प्रासंगिक, ऐच्छिक intracellular जीवाणु रोगज़नक़ लिस्टेरिया monocytogenes साथ अपरा और decidual अंग संस्कृतियों के संक्रमण प्रदर्शित करता है।
Introduction
मातृ-भ्रूण इंटरफेस में संक्रमण और सूजन रुग्णता और महिलाओं और बच्चों में मृत्यु दर का एक प्रमुख स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है। समझ कैसे रोगजनकों इन ऊतकों को संक्रमित उपन्यास रणनीतियों के विकास को रोकने और ऐसे अपरिपक्व प्रसव और भ्रूण मौत जैसे रोगों के इलाज के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, मातृ-भ्रूण इंटरफेस के उच्च interspecies परिवर्तनशीलता प्रयोगात्मक जांच पेचीदा हो। इसके अलावा, सबसे माइक्रोबियल रोगज़नक़ों मेजबान विशिष्टता, इस प्रकार कई पशु मॉडल पूरी तरह से मानव संक्रामक रोगों पुनरावृत्ति नहीं कर सकते हैं दिखा। कुछ जीवों (हेमोफिलस इन्फ्लुएंजा, साल्मोनेला टाइफी, विब्रियो हैजा, और कई अन्य), मानव में सख्ती से रोगजनक रहे हैं, जबकि इस तरह के, लिस्टेरिया monocytogenes के रूप में दूसरों, मेजबान विशिष्टता 1 का एक और अधिक मध्यवर्ती स्तर दिखा। होस्ट विशिष्टता रोगजनन के कई पहलुओं में दर्ज किया गया है, उपनिवेशन 2, 3 प्रसार, प्रतिरक्षा चोरी के 4 सहित 5 अप। इस प्रकार, यह इष्टतम मेजबान मॉडल प्रणाली का चयन करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है।
भ्रूण कोशिकाओं और मातृ खून से बना है, नाल एक अंग है कि तेजी से हमल 6 के पाठ्यक्रम पर विकसित करता है। सरल शब्दों में, मानव नाल मातृ खून में नहाया भ्रूण "विलस" पेड़ की तरह संरचनाओं का निर्माण किया है। गैस और पोषक तत्वों की विनिमय विशेष भ्रूण कोशिका परतों trophoblasts कि विलस पेड़ों की सतह लाइन कहा जाता भर में होता है। मातृ गर्भाशय श्लैष्मिक अस्तर, गैर गर्भवती महिला में अंतर्गर्भाशयकला करार दिया fetoplacental इकाई को समायोजित करने के पत्या में संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप बदल देती है। विलस पेड़ extravillous trophoblasts (EVT) कि पत्या में सेल कॉलम प्रस्तोता से विस्थापित द्वारा गर्भाशय में लंगर डाले हैं। मातृ-भ्रूण इंटरफेस है, इसलिए, पत्या और प्लेसेंटा के होते हैं।
अंग संस्कृति तकनीक यहाँ वर्णितएल सहित कहाँ और कैसे चिकित्सकीय प्रासंगिक मानव रोगज़नक़ों, जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है monocytogene और Toxoplasma gondii, अपरा बाधा 2,7 पार। ये पूर्व vivo अंग संस्कृतियों विवो ऊतक वास्तुकला में दोहराने, और मानव गर्भनाल के लिए यकीनन physiologically अत्यधिक प्रासंगिक मॉडल प्रणालियों रहे हैं। अतिरिक्त संस्कृति तकनीक पूरे अंग explants, अंग स्लाइस, और ऊतक या स्टेम सेल organoids 3 डी मैट्रिक्स में एम्बेडेड शामिल हैं। इन विकल्पों पर जानकारी के लिए, एक व्यापक हाल की समीक्षा 8 को देखें। कृपया ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल पत्या और अपरा विल्ली के अलग-अलग संस्कृति के लिए है। अपरा कोशिकाओं और decidual कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन के लिए, एक सह संस्कृति तकनीक को प्राथमिकता दी जा सकती है। हम पहले से वर्णित विलस-decidual सह संस्कृति तकनीक, trophoblast की मध्यस्थता decidual संवहनी remodeling 9-11 के अध्ययन के शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल के लिए दिलचस्पी पाठक देखें।
Protocol
प्रयोगों सिद्धांतों हेलसिंकी की घोषणा में व्यक्त के अनुसार आयोजित की गई। इस अध्ययन कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड, सैन फ्रांसिस्को (CHR # 11-05530) द्वारा अनुमोदित किया गया था। दी गई सभी रोगियों के नमूने और बाद के विश्लेषण के संग्रह के लिए सूचित सहमति लिखा है। ऊतक डी-पहचान नमूनों के रूप में एकत्र किया गया था।
ध्यान दें: शोधकर्ता उनके संस्थागत मानव विषयों की समीक्षा बोर्ड से अनुमोदन प्राप्त करना होगा। गर्भावधि इतिहास या अपरा विसंगतियों पर आधारित नमूनों का बहिष्कार किसी भी विशिष्ट अध्ययन की जरूरतों के अनुसार अलग अलग होंगे।
नोट: उचित सुरक्षा की स्थिति (जैव सुरक्षा स्तर 2) इस प्रोटोकॉल के 12 में सभी चरणों के लिए उपयोग किया जाना चाहिए।
1. तैयारी, संग्रह दिन से पहले
- आटोक्लेव strainers / संग्रह के लिए संदंश, और सूक्ष्म विच्छेदन के लिए कैंची / संदंश।
- धो बफर की पर्याप्त मात्रा (नमूना प्रति 500 मिलीलीटर) (फिर से तैयारनुस्खा के लिए 1 टेबल को FER)।
- पर्याप्त मात्रा 0.22 सुक्ष्ममापी बाँझ फ़िल्टर संग्रह मीडिया की (नमूना प्रति 100 मिलीलीटर) तैयार (नुस्खा के लिए 1 टेबल देखें)।
- अशेष बाह्य मैट्रिक्स लंबी अवधि के भंडारण के लिए (ईसीएम, जानकारी के लिए अभिकर्मकों की तालिका देखें)।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर ठोस रूप में स्टोर ईसीएम। सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए, दोहराने फ्रीज पिघलना से बचें। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चिपचिपा समाधान करने के लिए पिघलना बोतल, और ठंडा पिपेट सुझावों के साथ ठंडे कमरे में 300 μl aliquots तैयार करते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर aliquots।
2. ताजा ऊतक का संग्रह
चेतावनी: जब ताजा मानव ऊतक के साथ काम कर रहा है, शोधकर्ताओं Bloodborne रोगज़नक़ों के संचरण को रोकने के लिए यूनिवर्सल सावधानियां (OSHA) का पालन करना चाहिए, और उचित संस्थागत प्रशिक्षण प्राप्त होने चाहिए। दस्ताने, आंखों की सुरक्षा, और प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, आवश्यक हैं।
- ट्रांसपोर्टautoclaved-strainers (नमूना प्रति एक), autoclaved-संदंश, धो बफर (काबोइ), संग्रह मीडिया (एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में नमूने के अनुसार 25 मिलीलीटर), स्प्रे बोतल, 10% ब्लीच, 70% इथेनॉल, ऊतक संग्रह ट्रे, Sharpie , और बर्फ बाल्टी / अस्पताल / क्लिनिक के लिए कूलर।
नोट: नमूने एक कमरे ऑपरेटिंग सूट करने के लिए पास में स्थित एक शोध के नामित अंतरिक्ष में प्राप्त कर रहे हैं। एक बाँझ टिशू कल्चर हुड की आवश्यकता नहीं है, लेकिन संग्रह तेजी से हो जाना चाहिए और शोधकर्ता उचित सतहों स्वच्छ बनाना चाहिए के रूप में नीचे वर्णित है। - धो के प्लेस काबोइ सिंक करने के लिए आसन्न बफर, और 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे पानी की कल। जगह कांच प्रकाश स्रोत (प्रकाश पैड या प्रकाश बॉक्स) पर ऊतक संग्रह ट्रे, और 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ साफ करता। शुष्क हवा की अनुमति दें।
- नमूना तैयार करने के कमरे में ऑपरेटिंग सूट से चिकित्सक नमूनों ले। सिंक में, ऊपर बाँझ हाथ से आयोजित झरनी नमूना डालना, ऊतक में कई बार कुल्ला कर दिया गया हैज बफर, और पूरे नमूना बफर में साफ गिलास ट्रे को प्रकाश स्रोत के ऊपर हस्तांतरण।
नोट: चिकित्सक द्वारा ऊतक का आकलन, सर्वोच्च प्राथमिकता का है, इस प्रकार निम्नलिखित कदम के बाद ही चिकित्सक मौखिक रूप से संकेत दिया है कि वह / वह मूल्यांकन समाप्त हो गया है प्रदर्शन कर रहे हैं। - संग्रह के लिए अपरा विल्ली और पत्या (आंकड़े 2A और 3 ए) का चयन करें, और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों अलग करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें। गर्भावधि उम्र के साथ ट्यूब लेबल।
नोट: पसंदीदा गर्भावधि उम्र के कम से कम 9 सप्ताह और नाल और पत्या, क्रमशः के लिए कम से कम 16 सप्ताह कर रहे हैं। संस्था में केवल एक नमूना के एक अंश के अनुसंधान प्रयोजनों के लिए प्राप्त है, के रूप में पर्याप्त ऊतक नैदानिक वैकृत निदान के लिए रहना चाहिए। - अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए बर्फ पर दुकान और परिवहन नमूना।
- एक से अधिक नमूना इकट्ठा करने के लिए, के रूप में Colle के बीच 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ ऊपर वर्णित गिलास ट्रे स्वच्छ बनानाप्रत्येक नमूना के ction।
3. अंग संस्कृति प्लेट्स की तैयारी
नोट: निम्न चरणों का एक टिशू कल्चर हुड में बाँझ तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। यह आदर्श है के लिए विदारक माइक्रोस्कोप एक बाँझ क्षेत्र में स्थित होना। हालांकि, इस रूप में सूक्ष्म विच्छेदन शीघ्रता से किया जाता है, और उपकरणों 70% इथेनॉल में अक्सर डूबा कर रहे हैं जब तक बिल्कुल जरूरी नहीं है।
- पिघलना ईसीएम शीशी (ओं) बर्फ पर। ईसीएम पतला 1: 1 ठंडा संग्रह मीडिया के साथ, pipetting द्वारा मिश्रण। पिपेट धीरे धीरे बुलबुले शुरू करने से बचें। 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की हर अच्छी तरह से इस निलंबन के 100 μl की आवश्यकता है और 3-4 अंग संस्कृतियों को समायोजित करेगा।
- प्लेस transwell सम्मिलित करता है (ताकना आकार 0.4 माइक्रोन) के 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में।
- कोट प्रत्येक ईसीएम / मीडिया निलंबन की एक पतली परत (100 μl) के साथ सम्मिलित Transwell।
- बर्फ पर थाली प्लेस और तुरंत establishmen के लिए आगे बढ़नाअंग संस्कृतियों का टी। वैकल्पिक रूप से, प्लेट ऊतक संग्रह करने से पहले, जो मामले में बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पैरा-फिल्म और दुकान में लपेट तैयार करते हैं। 6 घंटा से अधिक समय तक भंडारण की सिफारिश नहीं है के रूप में ईसीएम बाहर सूख जाएगा।
4. अंग संस्कृति की स्थापना
नोट: यह कदम बताता है कि कैसे अलग transwells में decidual अंग संस्कृतियों और विलस अंग संस्कृतियों जगह है। ऊतकों संपर्क में नहीं हैं। एक सह संस्कृति तकनीक में रुचि शोधकर्ताओं जहां पत्या और विल्ली एक दूसरे के साथ सीधे संपर्क में हैं, पहले साहित्य 9,10 उल्लेख कर सकते हैं।
- प्रत्येक कुल्ला के बीच 1,000 XG पर संग्रह मीडिया, और अपकेंद्रित्र में दो बार नमूनों कुल्ला। एक विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर एक बाँझ पेट्री डिश और जगह के लिए ऊतक स्थानांतरण। बर्फ माइक्रोस्कोप से सटे पर 6 अच्छी तरह से थाली रखें।
- बाँझ स्प्रिंगर विदारक कैंची और संदंश के साथ माइक्रो-काटना ऊतक 2-3 मिमी विलस अंग संस्कृति की स्थापना के लिएएस (2A चित्रा)।
नोट: विलस अंग संस्कृतियों छोटे, अच्छी तरह से vascularized 2 या 3 शाखाओं के साथ "पेड़" कर रहे हैं, और प्रमुख extravillous trophoblast (EVT) सेल कॉलम 11 के साथ। यह ईसीएम में extravillous trophoblasts के आक्रमण के रूप में, <9 सप्ताह पहली तिमाही के नमूनों से केवल विलस ऊतक का उपयोग करने के लिए इन युवा उम्र 13 पर सबसे स्पष्ट है महत्वपूर्ण है। - प्रमुख EVT सेल कॉलम के साथ अच्छी तरह से vascularized विल्ली का चयन करें। EVT सेल कॉलम बल्बनुमा के रूप में कल्पना कर रहे हैं, "फजी", "शराबी" समाप्त होता है (चित्रा 2A में तीर को देखें)।
- प्रत्येक transwell में 3 या 4 विलस पेड़ हस्तांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें। इसलिए पेड़ ईसीएम और अलग clumped शाखाओं के ऊपर फ्लैट तैनात है शाखाओं को समायोजित करें।
- बाँझ स्प्रिंगर विदारक कैंची और संदंश के साथ decidual ऊतक माइक्रो-टुकड़े करना, 3 मिमी 3 decidual अंग संस्कृतियों (चित्रा 3 ए) स्थापित करने के लिए।
नोट: नमूने दो जिले शामिलdecidual ऊतकों, पत्या parietalis और पत्या capsularis की tinct प्रकार (बाएं और दाएं ऊतक टुकड़े, क्रमशः, चित्रा 3)। - कैंची के साथ ट्रिम पत्या parietalis 3 मिमी 3 टुकड़े बनाने के लिए। पत्या capsularis इन संस्कृतियों के लिए उपयोग नहीं किया है। संदंश का प्रयोग किसी भी पका मातृ रक्त दूर तंग करने के लिए।
- प्रत्येक transwell में पत्या के 3-4 टुकड़े हस्तांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें।
- संग्रह मीडिया के 1ml अच्छी तरह से नीचे करने के लिए जोड़ें। 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली सेते
- प्रयोगों के लिए यह सामान्य पहली तिमाही अपरा ऑक्सीजन तनाव नकल करने के लिए, रिश्तेदार हाइपोक्सिया (3% ओ 2) में विलस अंग संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जहां।
नोट: प्रयोगशाला विकल्प छोटे हाइपोक्सिया इनक्यूबेटर कक्षों कि अंदर मौजूदा इन्क्यूबेटरों फिट है, या एक सप्ताह में तीन गैस इनक्यूबेटर कि ऑक्सीजन एकाग्रता कम करने के लिए परिचय बाहरी एन 2 गैस शामिल हैं। - विलस या decidual मध्यम (टैब के 1 मिलीलीटर जोड़ेंLe 1) संस्कृति के 12-16 घंटे के बाद transwell के शीर्ष करने के लिए।
नोट: संस्कृति में पहली रात के दौरान मीडिया के अभाव extravillous trophoblast सेल स्तंभों पर आक्रमण करने के लिए (विलस संस्कृति) की अनुमति देता है, और ऊतकों के लिए (दोनों विलस और decidual) सुरक्षित रूप से ईसीएम में एम्बेडेड बनने के लिए। हमारे अनुभव में, decidual अंग संस्कृतियों 96 घंटे के लिए 72 घंटा और विलस अंग संस्कृतियों के लिए व्यवहार्य रहते हैं। हम प्रयोगात्मक समापन कि इस समय सीमा के भीतर गिर सलाह देते हैं। विलस और decidual माध्यम की रचना के लिए 1 टेबल देखें। जबकि decidual मध्यम गर्भावस्था हार्मोन (प्रोजेस्टेरोन, 17β-estradiol) है कि decidualized राज्य (तालिका 1) को बनाए रखने के साथ पूरक है विलस मध्यम, FBS के एक उच्च प्रतिशत है।
5. एल की तैयारी संस्कृतियों monocytogenes
ध्यान दें: एल की लंबी अवधि के भंडारण के बारे में विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए monocytogenes, और संस्कृति के विकास और थीमस्तिष्क दिल अर्क (भी) शोरबा और अगर में जीव, वांग एट अल देखें। 14
- एक भी एल चुनें परेशान BHI अगर थाली से कॉलोनी monocytogenes और BHI शोरबा के 3 मिलीलीटर टीका लगाना।
- एल सेते रातोंरात (16 घंटा) संस्कृति monocytogenes, एक झुका हुआ स्थिति में, 30 डिग्री सेल्सियस पर।
नोट:। ये संस्कृति की स्थिति बैक्टीरिया विकास स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए अनुमति देने के एल monocytogenes 30 डिग्री सेल्सियस, जो मेजबान सेल आक्रमण 15 बढ़ जाती है पर flagellated है।
6. एल के साथ अंग संस्कृतियों के संक्रमण monocytogenes
- गर्म पीबीएस और विलस या decidual मध्यम (तालिका 1) 37 डिग्री सेल्सियस तक।
- बाँझ चिमटी का प्रयोग किसी भी अंग संस्कृति टुकड़े कि ईसीएम में आक्रमण नहीं किया था, और इसलिए अच्छी तरह से में तैर रहे हैं हटा दें।
- ध्यान से transwell के नीचे से मीडिया aspirate। ऊपरी और निचले transwells धीरे युद्ध के 1 मिलीलीटर pipetting द्वारा दो बार कुल्लाअच्छी तरह से, और ध्यान के बीच में श्वास में पीबीएस हूँ। धीरे ऊपरी और निचले transwell के लिए एंटीबायोटिक मुक्त विलस या decidual मीडिया के 1 एमएल पिपेट। अंग संस्कृति को परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- ऊतक में कम से कम एक घंटे के लिए एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया में सेते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं को हटा दिया गया है।
ध्यान दें: स्थिर चरण पर एल के घनत्व monocytogenes संस्कृति लगभग 1 एक्स 10 9 कॉलोनी बनाने मिलीलीटर प्रति यूनिट (CFU) है। अंग संस्कृतियों को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल जीवाणुओं की संख्या अनुभव से प्रयोगात्मक जरूरतों को पूरा करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। - जंगली प्रकार एल के लिए monocytogenes दिनचर्या संक्रमण प्रयोगों (प्रति अच्छी तरह से मीडिया के 1 मिलीलीटर में 4 एक्स 10 7 एल monocytogenes) रातोंरात का एक 1:50 कमजोर पड़ने के साथ मजबूत आक्रमण दिखा। एंटीबायोटिक मुक्त विलस या decidual माध्यम में बैक्टीरिया की उपयुक्त संख्या Resuspend।
- transwells के ऊपर से महाप्राण मीडिया। धीरे inoculum के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 37 प्लेटें सेतेडिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में जीवाणु आक्रमण के लिए अनुमति देने के लिए।
- ऊपरी और निचले transwells से मीडिया aspirating द्वारा बाह्य बैक्टीरिया को दूर। गर्म पीबीएस के साथ दो बार कुओं कुल्ला। 50 ग्राम मिलीलीटर -1 Gentamicin के साथ पूरक विलस या decidual मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
नोट: एल monocytogenes एक ऐच्छिक intracellular जीवाणु कि बाह्य माध्यम में बड़े होते हैं, कोशिकाओं के अंदर विकसित कर सकते हैं, और बाह्य अंतरिक्ष तक पहुँचने के बिना सेल करने वाली सेल से फैल रहा है। जेंटामाइसिन बाह्य एल पर एक जीवाणुनाशक प्रभाव पड़ता है monocytogenes, और इस तरह intracellular एल की माप की अनुमति देता है विकास monocytogenes और अंग संस्कृति 16 के माध्यम से फैल गया।
नोट: प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एल विलस और पत्या अंग संस्कृतियों के संक्रमण monocytogenes 5 घंटा ऊष्मायन समय के साथ होता है। जेंटामाइसिन के अलावा पहले ऊष्मायन के समय प्रयोगात्मक जरूरतों और एबी के आधार पर संशोधित किया जा सकताजीव के बड़प्पन के ऊतकों पर आक्रमण करने के लिए। बेहतर संक्रमण के लिए शारीरिक साइटों सबसे कमजोर समझने के लिए, कम ऊष्मायन बार 2 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - प्रयोग की अवधि के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को बनाए रखें। अच्छी तरह से दैनिक प्रत्येक में पूरे मीडिया बदलें।
नोट: हमारी अनुभव, एल में monocytogenes -infected decidual अंग संस्कृतियों 72 घंटे के लिए 48 घंटा और विलस अंग संस्कृतियों के लिए व्यवहार्य रहते हैं।
7. अंग की फसल के लिए संस्कृतियों हिस्तोपैथोलोजी
- 30 मिलीलीटर पीबीएस में एक 16% शेयर इंजेक्शन की शीशी के 10 मिलीलीटर गिराए द्वारा 4% paraformaldehyde की एक ताजा समाधान तैयार है। स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% paraformaldehyde, प्रकाश से संरक्षित हैं, और एक सप्ताह के भीतर का उपयोग करें। कमरे के तापमान का उपयोग करने से पहले करने के लिए ले आओ।
- ऊपरी और निचले transwell से महाप्राण मीडिया। धीरे कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ दो बार कुओं कुल्ला। धीरे से ऊपर करने के लिए पूरी तरह से transwell अंग संस्कृति को कवर करने के 1ml 4% paraformaldehyde जोड़ें।
- सेते20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% paraformaldehyde में। अब ऊष्मायन समय से बचने के रूप में इस ऊतक के ओवर-निर्धारण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
- महाप्राण paraformaldehyde और कुल्ला कुओं पीबीएस के साथ दो बार कमरे के तापमान पर। एक cryostat पर अक्टूबर मध्यम, फ्रीज, और इस खंड में तय अंग संस्कृतियों एम्बेड ( "तय स्थिर")। सामान्य तौर पर, तय जमे हुए ऊतक से पहले निर्धारण के बिना जमे हुए ऊतक से अनुभाग के लिए आसान है।
नोट: OCT एम्बेडिंग और जमे हुए सेक्शनिंग पर पूरा प्रोटोकॉल के लिए, प्रकाशित प्रोटोकॉल 17,18 से प्रासंगिक धाराओं का उपयोग करें। प्रयोगात्मक जरूरतों और उपलब्ध प्रयोगशाला के उपकरण और भंडारण पर निर्भर करता है, ऊतक के बजाय आयल एम्बेडेड और एक microtome 19 पर sectioned हो सकता है। - इसके अलावा दिनचर्या Hematoxylin और Eosin धुंधला हो जाना, immunofluorescence, या immunohistochemistry 18,20,21 के लिए ऊतक स्लाइड तैयार करते हैं।
Representative Results
चित्रा 1 (Zeldovich और Bakardjiev 22 से संशोधित) प्रासंगिक अपरा और गर्भाशय शरीर रचना चित्र। चित्रा 2 प्रतिनिधि सकल और अपरा विल्ली के histologic छवियों से पता चलता है, जबकि चित्रा 3 decidual ऊतक को दर्शाता है।
इस प्रोटोकॉल पहले अस्पताल या क्लीनिक में ताजा अपरा और decidual ऊतक के संग्रह का वर्णन है। एकत्र नमूना भ्रूण अपरा (विल्ली) और मातृ गर्भाशय घटकों (पत्या) का एक मिश्रण है। व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीफंगल युक्त बफर के साथ rinsing के बाद, पूरे नमूना एक प्रकाश बॉक्स का उपयोग आंखों से निरीक्षण किया है। विल्ली और पत्या प्रयोगशाला के लिए अलग ट्यूबों में रखा गया है और बर्फ पर ले जाया जाता है। प्रयोगशाला में, एक विदारक माइक्रोस्कोप स्वस्थ ऊतक के ठीक शब्द के भागों सुविधाओं की सराहना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तस्वीरों के प्रतिनिधिविलस (2A चित्रा) और decidual ऊतकों (चित्रा 3 ए) कि दो बाहरी gooseneck प्रकाश स्रोतों के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ हासिल किया गया संदर्भ के लिए दिखाए जाते हैं।
विलस अंग संस्कृतियों पहली तिमाही के नमूनों से उत्पन्न कर रहे हैं। संस्कृतियों 2-6 शाखाओं के साथ छोटे टर्मिनल विलस पेड़ से मिलकर बनता है। यह विलस शाखाओं कि extravillous trophoblast कॉलम में समाप्त करने और अच्छी तरह से कर रहे हैं vascularized टुकड़े करना महत्वपूर्ण है। इन सुविधाओं के रूप में "शराबी" या "फजी" शाखा समाप्त होता है (तीर), और बेहोश गुलाबी करने वाली लाल रंग रेखीय देखा जाता है कि चित्रा 2A में बाईं तरफ के पेड़ की शाखाओं के माध्यम से पाठ्यक्रमों। इसके विपरीत, वाहिका और extravillous trophoblasts आसानी से इस छवि का अधिकार है, जो संस्कृति के लिए सबऑप्टिमल होगा पर पेड़ के लिए कल्पना नहीं कर रहे हैं। संस्कृति के पहले दिन से अधिक, extravillous trophoblasts ईसीएम, टी में विस्थापितहुसैन transwell पर मैट्रिक्स में विलस पेड़ प्रस्तोता।
Decidual अंग संस्कृतियों पहली और जल्दी दूसरी तिमाही के नमूनों से उत्पन्न कर रहे हैं। पूरे गर्भाशय अस्तर आरोपण के बाद बहुत जल्द ही पत्या में तब्दील हो जाता है। अधिक विशेष रूप से, पत्या basalis को परिभाषित करता है गर्भाशय म्यूकोसा सीधे नाल / आरोपण साइट अंतर्निहित, पत्या capsularis को परिभाषित करता है म्यूकोसा भ्रूण overlying, और पत्या parietalis गर्भाशय अस्तर के शेष को दर्शाता है। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य से पता चलता है कि जल्दी गर्भावधि नमूना (, बाएँ और दाएँ ऊतक टुकड़े क्रमश: चित्रा 3 ए में) काफी हद तक पत्या parietalis और पत्या capsularis के होते हैं। पत्या capsularis आसानी से अपनी पतली, झिल्लीदार प्रकृति से भिन्न है। अंग संस्कृतियों के लिए, पत्या parietalis 3 मिमी 3 करने के लिए छंटनी की है माइक्रो-विच्छेदन कैंची और adhe के साथ टुकड़ेकिराया पका हुआ खून संदंश के साथ हटा दिया जाता है।
रात भर ऊष्मायन के बाद, ऊतकों एल से संक्रमित हैं monocytogenes। संक्रमण ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल Gentamicin संरक्षण intracellular विकास और ऐच्छिक intracellular बैक्टीरिया 16 के प्रसार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल परख पर आधारित है। एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम में अंग संस्कृतियों एल के साथ incubated हैं 5 घंटे के लिए monocytogenes। संस्कृति बाँझ पीबीएस के साथ धो रहे हैं मध्यम से बैक्टीरिया को दूर करने के लिए। इसके बाद, जेंटामाइसिन बाह्य जीवों को खत्म करने के लिए कहा है। हमारी प्रयोगशाला से पहले साहित्य immunofluorescence और confocal माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया संक्रमण 2 के बाद विभिन्न timepoints पर बैक्टीरियल ऊतक स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए। अंग संस्कृतियों पीबीएस में rinsed हैं, 4% paraformaldehyde में तय है, और या तो जमे हुए एम्बेडेड अक्टूबर माध्यम में और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, या आयल एम्बेडेड और कमरे के तापमान पर रखा। ऊतक वर्गों स्टेशन हो सकता हैimmunofluorescence (यदि) या प्रतिरक्षाऊतकरसायन (आईएचसी) बैक्टीरिया का विश्लेषण और यूकेरियोटिक सेल स्थानीयकरण के लिए ined। चित्रा 2 बी एक प्रतिनिधि है संक्रमण के बाद 72 घंटा में एक 8.3 सप्ताह विलस अंग संस्कृति से तैयार एक जमे हुए खंड की छवि। नोट विलस शाखाओं के सिरों पर EVTs में भारी बैक्टीरियल बोझ (हरी प्रतिदीप्ति), और पेड़-अस्तर syncytiotrophoblast (लाल प्रतिदीप्ति) परत के भीतर बैक्टीरिया के रिश्तेदार की कमी। पिछले काम में, हम इसी तरह इस्तेमाल किया धुंधला एल स्थानीयकरण करने के लिए अगर संक्रमण के बाद अलग timepoints पर विलस अंग संस्कृतियों में monocytogenes। 72 घंटा, उप syncytial cytotrophoblasts और अंतर्निहित विलस स्ट्रोमा में EVT से संक्रमण फैला। विशेष रूप से, synyctiotrophoblast परत संक्रमण 2 के लिए प्रतिरोधी था।
एच एंड ई दाग आयल एम्बेडेड decidual ऊतक वर्गों के प्रतिनिधि प्रकाश सूक्ष्म छवियों 14.3 सप्ताह specime से तैयारएनएस आंकड़े 3B और 3 सी में दिखाया जाता है। इस ईसीएम लेपित transwell झिल्ली बगल में अंग संस्कृति (चित्रा 3 बी) को दिखाने के लिए एम्बेडेड था। छवि को दर्शाता है उपकला लाइन ग्रंथियों (तारांकन) और endothelial लाइन वाहिका (हीरा) decidual stromal सेल डिब्बे के भीतर विभिन्नतापूर्वक तैनात हैं। इसके अतिरिक्त, वहाँ मातृ प्रतिरक्षा एक चर घनत्व में decidual स्ट्रोमा भर में बिखरे हुए कोशिकाओं रहे हैं। आईएचसी और धुंधला बैक्टीरियल microanatomical स्थानीयकरण, विशिष्ट निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सापेक्ष निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, CD14 + मैक्रोफेज (हरी प्रतिदीप्ति) वाहिका के अस्तर के लिए स्थानीय बनाना और स्ट्रोमा (चित्रा 3 डी) के भीतर बिखरे हुए हैं, जबकि एल के बड़े समुच्चय monocytogenes (लाल प्रतिदीप्ति) के संक्रमण के बाद 48 घंटा (चित्रा 3 डी) पर decidual स्ट्रोमा में मुख्य रूप से मनाया जाता है।
| धो बफर | संग्रह मध्यम | विलस मध्यम | decidual मध्यम |
| पीबीएस | DMEM / GlutaMAX साथ F-12 | DMEM / GlutaMAX साथ F-12 | DMEM / GlutaMAX साथ F-12 |
| पेनिसिलिन 100 आइयू / मिलीलीटर | भ्रूण गोजातीय सीरम 2.5% | भ्रूण गोजातीय सीरम 20% | भ्रूण गोजातीय सीरम 2.5% |
| स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल | पेनिसिलिन 100 आइयू / मिलीलीटर | पेनिसिलिन 100 आइयू / मिलीलीटर | 17β-estradiol 300 स्नातकोत्तर / एमएल |
| जेंटामाइसिन 50 माइक्रोग्राम / एमएल | स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल | स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 माइक्रोग्राम / एमएल | प्रोजेस्टेरोन 20 एनजी / एमएल |
| Amphotericin बी 1.25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर | जेंटामाइसिन 50 माइक्रोग्राम / एमएल | ||
| < / Td> | Amphotericin बी 1.25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर |
तालिका 1:। मीडिया व्यंजनों अवयव और धो बफर, संग्रह मध्यम, विलस मध्यम, और decidual माध्यम की तैयारी के लिए सांद्रता।
चित्रा 1. अपरा संरचना। (ए) Feto-अपरा इकाई की मातृ गर्भाशय में संरचना, (बी) में बॉक्स के इज़ाफ़ा (ए) पर प्रकाश डाला गया है कि भ्रूण trophoblast (टी) अटे अपरा विल्ली मातृ खून में नहाया और से पत्या में लंगर डाले हैं extravillous trophoblasts (EVT)। विल्ली के भीतर निहित भ्रूण वाहिकाओं (FV), fibroblasts, और भ्रूण मैक्रोफेज हैं। Zeldovich और Bakardjiev 22 से संशोधित। "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: विलस अंग संस्कृतियों - प्रतिनिधि सकल और सूक्ष्म छवियों (ए) दो 6 सप्ताह की गर्भावधि उम्र के साथ टर्मिनल विलस पेड़, एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा के रूप में।। नोट "शराबी" समाप्त होता है (तीर) और प्रमुख भ्रूण वाहिका छोड़ दिया है कि अंग संस्कृति के लिए इस टुकड़े के उपयुक्त बनाने पर पेड़ की शाखाओं के माध्यम से दौड़। (बी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस लिस्टेरिया monocytogenes के साथ अंग संस्कृति (गर्भ की आयु 8.3 सप्ताह) 72 घंटा के बाद संक्रमण की माइक्रोस्कोपी, भारी बोझ बैक्टीरियल [ग्रीन] extravillous trophoblasts में प्रकाश डाला। DAPI βHCG + लाल रंग में syncytiotrophoblasts नीले रंग में दिखाया गया है, और। स्केल सलाखों = 1 मिमी (ए), 250 माइक्रोन (बी)।7 / 54237fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। Decidual अंग संस्कृति - प्रतिनिधि सकल और सूक्ष्म छवियों (ए) पत्या parietalis [बाएं] और पत्या capsularis [अधिकार] गर्भ की आयु 6 सप्ताह में, एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा के रूप में। 14.3 सप्ताह गर्भावधि उम्र पत्या parietalis अंग संस्कृति का (बी) और एच ई-दाग अनुभाग ग्रंथियों और वाहिका decidual स्ट्रोमा भर विभिन्नतापूर्वक का आयोजन चलता। (डायमंड, ◆) और (तारांकन, *) प्रतिनिधि पोत और ग्रंथि पर प्रकाश डाला, क्रमशः। निचले छोर पर भूरा लाइन किनारे पर, transwell झिल्ली है। (सी) एच एंड ई दाग 14.3 सप्ताह गर्भावधि उम्र पत्या की धारा में उच्च बढ़ाई डी अंग संस्कृति parietalisमांसपेशियों में घिरी सर्पिल decidual स्ट्रोमा में एम्बेडेड धमनियों emonstrates। मातृ प्रतिरक्षा कोशिकाओं अंधेरे दौर नाभिक के साथ छोटे हैं, और अनियमित स्ट्रोमा भर में वितरित कर रहे हैं। (डी) एल साथ अंग संस्कृति 48 घंटा के बाद संक्रमण की immunofluorescence माइक्रोस्कोपी monocytogenes, बैक्टीरिया के बड़े क्षेत्रों [लाल] decidual स्ट्रोमा में, और मातृ CD14 + मैक्रोफेज [ग्रीन] एक कपटपूर्ण संवहनी अंतरिक्ष अस्तर और स्ट्रोमा में बिखरे हुए प्रकाश डाला। स्केल सलाखों = 1 मिमी (ए), 250 माइक्रोन (बी), 50 माइक्रोन (सी और डी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
जन्मजात, ट्रांसजेनिक और पीटकर माउस उपभेदों प्रायोगिक प्रणाली में सेवा मजबूती के तंत्र का परीक्षण कर सकते हैं। हालांकि, कोर आनुवंशिक सामग्री के सामान्य संरक्षण के बावजूद, चूहों और इंसानों के कार्यात्मक जीनोम नियामक तत्व 23 में महत्वपूर्ण मतभेद प्रदर्शित करता है। यह आश्चर्य की बात नहीं है, इसलिए, पशु मॉडल में है कि होनहार preclinical अध्ययन कभी-कभी मानव रोगियों में recapitulated नहीं कर रहे है। नाल बहुत उच्च interspecies विविधता से पता चलता है, इस प्रकार मानव रोग के अध्ययन के लिए 24 पशु मॉडल कम है तो आदर्श प्रतिपादन। दोनों मानव और माउस इम्यूनोलॉजी 25 में उल्लेखनीय मतभेद, और अपरा शरीर रचना में सुनाया अलग-अलग विकास को स्वीकार करते हुए यह प्रायोगिक जांच के लिए मानव गर्भावधि ऊतकों के पूर्व vivo अंग संस्कृतियों के इस्तेमाल पर विचार करने के लिए समझदारी है।
वर्णन, फोटो छवियों, और अनुदेशात्मक वीडियो इस प्रोटोकॉल में शोधकर्ताओं ने हिदायतकैसे ईसीएम लेपित transwell टिशू कल्चर सम्मिलित करता है पर विलस और decidual अंग संस्कृतियों की स्थापना। इस तकनीक का लाभ सूक्ष्म विच्छेदन के रिश्तेदार सादगी और यांत्रिक समर्थन transwell प्रणाली है, खासकर जब ऐसी 3 डी-एम्बेडेड matrices या अंग टुकड़ा संस्कृतियों के रूप में वैकल्पिक तरीकों की तुलना में शामिल हैं। झिल्ली के समर्थन पर अंग संस्कृति का निलंबन सभी ऊतक सतहों पर पोषक तत्व आदान प्रदान के लिए अनुमति देता है और व्यवहार्यता अल्पकालिक संस्कृति (विलस संस्कृतियों के लिए 96 मानव संसाधन, decidual संस्कृतियों के लिए 72 घंटा) .यह तकनीक ऊतक में मानव अपरा जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अनुमति देता है के लिए बनाए रखा है स्तर, इसमें शक नहीं अधिक जैविक रूप से monolayer सेल संस्कृति मॉडल की तुलना में प्रासंगिक है।
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम अंग संस्कृति के लिए उपयुक्त विलस और decidual टुकड़े की सूक्ष्म विच्छेदन है। ऊतक का इष्टतम टुकड़े फ़ोटोग्राफ़ी प्रदर्शन कर रहे हैं (2A चित्रा और चित्रा 3 ए) जिनके लिए शोधकर्ताओं सहायता करने के लिएगर्भावधि नमूनों के दृश्य के लिए नया है। यह विलस पेड़ जिनकी शाखाएं EVT कॉलम में समाप्त चयन करने के रूप में इन कोशिकाओं ईसीएम में विस्थापित और झिल्ली को विल्ली लंगर में मदद मिलेगी विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अंग संस्कृतियों के दोनों प्रकार के लिए एक सावधान और धीरा ढंग से pipetting द्वारा मीडिया परिवर्तन के दौरान ऊतकों को गड़बड़ी को कम करने के लिए उपयोगी है।
इस तकनीक को केवल न्यूनतम कठिनाइयों प्रस्तुत करता है। इस अवसर पर नमूनों संदूषण दिखा। संदूषण आमतौर पर बैक्टीरियल (कभी कभी पाली-माइक्रोबियल) है, और केवल संस्कृति में 1-2 दिनों के बाद स्पष्ट हो जाता है। एक बार जब संदूषण मनाया जाता है, ब्लीच लागू किया जाना चाहिए, संस्कृति खारिज कर दिया, और टिशू कल्चर इनक्यूबेटर एक दीर्घकालिक समस्या को रोकने के लिए निष्फल। गर्भाशय में संक्रमण, सर्जरी के दौरान, नमूना फसल / प्रसंस्करण के दौरान, या अंग संस्कृति रखरखाव के दौरान: कई संभव तरीके संदूषण पैदा हो सकता है कर रहे हैं। फसल और प्रसंस्करण कदम की संभावना सबसे अधिक समय कर रहे हैंऔर प्रदूषण के लिए जगह पेश किया है। इस प्रकार, यह राशि समय का नमूना संग्रह और सूक्ष्म विच्छेदन के दौरान चालाकी है कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस परिवेश, गैर बाँझ पर्यावरण के लिए नमूना जोखिम कम हो जाएगा। प्रयोगशाला स्थापना पर निर्भर करता है, विदारक माइक्रोस्कोप बाँझ टिशू कल्चर हुड के अंदर बनाते हैं।
Histopathologic चिकित्सकीय प्रासंगिक रोगज़नक़ एल के साथ संक्रमण के बाद अंग संस्कृतियों का विश्लेषण monocytogenes, प्रोटोकॉल में से एक संभव आवेदन के रूप में यहाँ दिखाया गया है। दोनों बैक्टीरिया और मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संक्रमण की पैदावार रोगजनकों के लिए मानव मेजबान प्रतिक्रिया में नए अंतर्दृष्टि के बाद के immunofluorescence स्थानीयकरण। Decidual अंग संस्कृतियों एक पूरक पूर्व vivo प्रयोग तकनीक murine decidual बृहतभक्षककोशिका बचाव कार्यों 26,27 में दोष दिखा पेचीदा रिपोर्ट सहित इन विवो माउस के संक्रमण से उत्पन्न डेटा की जांच करने के रूप में सेवा कर सकता है। इसके अतिरिक्त, मानव ऑर्गएक संस्कृतियों ऐसे प्रतियोगी एल के कई isogenic उपभेदों से बना inoculum के रूप में, मिश्रित संक्रमण रणनीतियों में इस्तेमाल किया जा सकता है monocytogenes। अंग संस्कृतियों के प्रतियोगी संक्रमण मानव मेजबान के भीतर विषैलापन कारकों की प्रासंगिकता परीक्षण करने के लिए एक संवेदनशील तरीका है। इस विधि से एक बाधा ऊतक व्यवहार्यता, जो अल्पकालिक संस्कृति (विलस संस्कृतियों के लिए 96 मानव संसाधन, decidual संस्कृतियों के लिए 72 घंटा) तक सीमित है। इस तरह के एल के रूप में तेजी से बढ़ रहा रोगाणुओं के संक्रमण के लिए आदर्श है monocytogenes, लेकिन अब संस्कृतियों रोगज़नक़ों कि स्थापित करने और ऊतकों के माध्यम से प्रसार करने के लिए और अधिक समय लेने के लिए आवश्यक हो सकता है।
गर्भावस्था जटिलताओं के वैश्विक बोझ को कम करने के लिए, अनुसंधान मानव मातृ-भ्रूण इंटरफेस के pathophysiology को समझने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। जीवाणु, कवक, और वायरल रोगज़नक़ों कि मां से पार गर्भावस्था और भ्रूण संक्रमण की जटिलताओं विनाशकारी कारण भ्रूण को। प्रयोगशाला ani के विवो संक्रमण में नियंत्रितMals आम तौर पर संबोधित कैसे रोगजनकों उपनिवेश और अंगों 28 के बीच पारगमन के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है। क्योंकि अपरा शरीर रचना विज्ञान स्तनधारी प्रजातियों भर में स्पष्ट रूप से बदलता है, यह अनुसंधान रणनीतियों में मानव ऊतकों को शामिल करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। मानव विलस और decidual अंग संस्कृतियों अत्यधिक प्रासंगिक मॉडल प्रणाली मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की जांच कर रहे हैं। इस महत्वपूर्ण अभी तक खराब समझ अंग का अध्ययन करने के लिए, शोधकर्ताओं अन्यथा खारिज मानव अपरा और decidual नमूनों की बहुतायत का लाभ ले सकते हैं, इस तरह यहाँ वर्णित के रूप में अंग संस्कृति रणनीतियों का उपयोग।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
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