Summary
Une méthode simple pour établir placentaire primaire humain (villosités) et des cultures d'organes déciduales est décrit. cultures d'organes villosités et déciduales sont des outils précieux pour l'étude de la pathogenèse à l'interface materno-fœtale humaine. L' infection par la bactérie Listeria monocytogenes intracellulaire facultative est démontrée.
Abstract
Le placenta montre un grand degré de variabilité anatomique interspécifique. Pour mieux comprendre la biologie et la physiopathologie du placenta humain, il est impératif de concevoir des expériences utilisant des cellules et de tissus humains. Un avantage de culture organotypique est le maintien de trois dimensions (3D) de l'organisation structurelle et de la matrice extracellulaire. L'objectif de la méthode décrite ici est mise en place réussie des ex vivo des cultures d'organes de tissus humains gestationnel et leur entretien de culture sain pour 72-96 h. Le protocole détaille le traitement immédiat de la recherche objet du consentement, du placenta et des spécimens déciduales frais de la salle d'opération. Ceux-ci sont des spécimens abondants qui autrement seraient mis au rebut. Des instructions détaillées sur la collecte stérile de ces échantillons, y compris les détails morphologiques sur la façon de choisir les tissus appropriés pour établir des cultures d'organes 3D, est fourni. Tissus villeux et déciduales placentaires sont microdisséquées en 2-3 mm 3 pièceset placés séparément sur des filtres Transwell matrice doublée et mises en culture pendant plusieurs jours. Villous et cultures d'organes déciduales sont bien adaptés à l'étude des interactions hôte-pathogène humain. Par rapport à d'autres organismes modèles, ces cultures humaines sont particulièrement avantageux d'examiner le mécanisme d'infection pour les agents pathogènes qui démontrent des modèles variables de spécificité d'hôte. A titre d'exemple, nous démontrons l' infection des cultures d'organes placentaires et déciduales avec les, facultatifs intracellulaires pathogènes bactériens Listeria monocytogenes cliniquement pertinentes.
Introduction
L'infection et l'inflammation à l'interface materno-fœtale représente une source majeure de morbidité et de mortalité chez les femmes et les enfants. Comprendre comment les agents pathogènes infectent ces tissus est essentielle pour le développement de nouvelles stratégies pour prévenir et traiter des maladies telles que le travail prématuré et la mort du fœtus. Cependant, haute variabilité interspécifique de l'interface materno-fœtale complique étude expérimentale. En outre, la plupart des pathogènes microbiens montrent la spécificité d'hôte, ainsi de nombreux modèles animaux ne peut pas récapituler complètement les maladies infectieuses humaines. Certains organismes (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio cholera, et de nombreux autres) sont strictement pathogène chez l' homme, tandis que d' autres, tels que Listeria monocytogenes, montrent un niveau plus intermédiaire de la spécificité d'hôte 1. La spécificité de l' hôte a été documentée dans de nombreux aspects de la pathogenèse, y compris la colonisation 2, la diffusion 3, l' évasion immunitaire 4 5. Ainsi, il est d'une importance capitale pour sélectionner des systèmes modèles d'accueil optimales.
Composé de cellules fœtales et le sang maternel, le placenta est un organe qui se développe rapidement au cours de la gestation 6. En termes plus simples, le placenta humain est constitué de structures fœtales "villeux" arborescentes baignées dans le sang maternel. Gaz et l'échange des éléments nutritifs se produit à travers des couches de cellules foetales spécialisées appelées trophoblastes qui tapissent la surface des arbres villeux. La doublure maternelle utérine de la muqueuse, appelée endomètre chez la femme non enceinte, transforme structurellement et fonctionnellement dans le decidua pour accueillir l'unité foeto-placentaire. arbres villosités sont ancrés dans l'utérus par trophoblastes extravilleux (EVT) qui migrent de l'ancrage des colonnes de cellules dans le decidua. L'interface materno-fœtale, par conséquent, se compose de decidua et le placenta.
La technique de culture d'organe décrit ci-a été utilisé pour examiner où et comment cliniquement pathogènes humains pertinents, y compris L. et s monocytogenes Toxoplasma gondii, traversent la barrière placentaire 2,7. Ces cultures ex vivo d'organes répliquent dans l' architecture des tissus in vivo, et sont des systèmes modèles sans doute physiologiquement très pertinents pour la placentation humaine. Les techniques de culture supplémentaires comprennent des explants entiers d'orgue, des tranches d'organes et de tissus ou de cellules souches organites intégrés en 3D-matrice. Pour plus de détails sur ces options, s'il vous plaît se référer à un récent examen exhaustif 8. S'il vous plaît noter que ce protocole est pour la culture distincte des decidua et villosités placentaires. Pour étudier l'interaction entre les cellules du placenta et les cellules déciduales, une technique de co-culture peut être préférée. Nous renvoyons le lecteur intéressé à la technique de co-culture villous-déciduale décrit précédemment, utilisé par les chercheurs qui étudient trophoblaste médiée decidual remodelage vasculaire 9-11.
Protocol
Des expériences ont été menées conformément aux principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki. Cette étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel à l'Université de Californie, San Francisco (CHR # 11-05530). Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit pour la collecte des échantillons et une analyse ultérieure. Le tissu a été recueilli sous forme d'échantillons dépersonnalisées.
NOTE: Le chercheur doit obtenir l'approbation de leur sujets humains commission d'examen institutionnel. L'exclusion des spécimens sur la base de l'histoire ou placentaires anomalies de gestation varie en fonction des besoins de toute étude spécifique.
NOTE: Les conditions de sécurité appropriées (niveau de biosécurité 2) devraient être utilisés pour toutes les étapes de ce protocole 12.
1. Préparation, Avant le jour Collection
- crépines autoclaves / pince pour la collecte et ciseaux / pince pour micro-dissection.
- Préparer un volume adéquat (500 ml par échantillon) de tampon de lavage (refert au tableau 1 pour la recette).
- Préparer un volume adéquat (100 ml par échantillon) de 0,22 uM médias Collection stérilisée par filtration (voir le tableau 1 pour la recette).
- Aliquoter matrice extracellulaire (ECM, reportez - vous à la table des réactifs pour les détails) pour le stockage à long terme.
- ECM de magasin sous forme solide à -20 ° C. Pour des performances optimales, éviter la répétition de gel dégel. bouteille Thaw à une solution visqueuse à 4 ° C, et de préparer 300 aliquotes dans la chambre froide avec des embouts de pipette réfrigérés. aliquotes de conserver à -20 ° C.
2. Collecte des tissus frais
ATTENTION: Lorsque vous travaillez avec le tissu humain frais, les chercheurs doivent suivre les précautions universelles (OSHA) pour prévenir la transmission par le sang, et doivent avoir reçu une formation institutionnelle adéquate. équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, des lunettes de protection et des blouses de laboratoire sont nécessaires.
- Transport-crépines autoclavées (un par échantillon), forceps-autoclavés, tampons de lavage (bombonne), les médias de la collection (25 ml par échantillon dans un tube conique de 50 ml), bouteille de pulvérisation, 10% l'eau de Javel, 70% d'éthanol, bac de collecte de tissu, sharpie et seau à glace / refroidisseur à l'hôpital / clinique.
NOTE: Les échantillons sont reçus dans un espace de recherche désigné situé dans une chambre près de la salle d'opération. Une hotte de culture tissulaire stérile est pas nécessaire, mais la collecte devrait se produire rapidement et le chercheur doit désinfecter correctement les surfaces, comme décrit ci-dessous. - Lieu bombonne de tampon de lavage adjacente à l'évier, et pulvériser robinet avec 10% de l'eau de Javel et de 70% d'éthanol. Poser le verre bac de collecte de tissu sur la source de lumière (bloc optique ou de la boîte de lumière), et désinfectez avec 10% de l'eau de Javel et de 70% d'éthanol. Laisser sécher à l'air.
- Avoir les spécimens portent des cliniciens de la salle d'opération à la salle de préparation des échantillons. A l'évier, versez l'échantillon au sommet de la crépine à main stérile, rincer le tissu à plusieurs reprises dans Wash tampon, et le transfert échantillon entier dans un tampon au plateau de verre aseptisée au sommet de la source de lumière.
NOTE: L'évaluation des tissus par le clinicien est de la plus haute priorité, donc les étapes suivantes ne sont exécutées après que le clinicien a indiqué verbalement qu'il / elle a terminé l'évaluation. - Utilisez des pinces stériles pour sélectionner villosités placentaires et decidua (Figures 2A et 3A) pour la collecte et le transfert de séparer 50 ml tubes coniques. Etiqueter les tubes avec l'âge gestationnel.
NOTE: Préféré âge gestationnel est inférieur à 9 semaines et moins de 16 semaines pour le placenta et decidua, respectivement. A l'institution, seule une fraction de chaque échantillon est procuré à des fins de recherche, que le tissu adéquat doit rester pour le diagnostic pathologique clinique. - Stockez et de transport des échantillons sur la glace au laboratoire de recherche.
- Pour recueillir plus d'un spécimen, assainir le plateau en verre comme décrit ci-dessus avec 10% de l'eau de Javel et de 70% d'éthanol entre la collection de chaque spécimen.
3. Préparation de la culture d'organes Plaques
REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées en utilisant une technique stérile dans une hotte de culture de tissus. Il est idéal pour le microscope à dissection pour être situé dans un champ stérile. Cependant, ce ne soit pas absolument nécessaire tant que micro-dissection est effectuée rapidement, et les instruments sont plongés fréquemment dans 70% d'éthanol.
- flacon Thaw ECM (s) sur la glace. Diluer l'ECM 1: 1 avec les médias Collection glacées, mélanger par pipetage. Pipette lentement pour éviter d'introduire des bulles. Chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 6 puits requiert 100 ul de cette suspension et pourra accueillir des cultures d'organes 3-4.
- inserts Lieu Transwell (taille des pores 0,4 uM) dans chaque puits de 6 puits plaque de culture de tissus.
- Enrober chaque Transwell insert avec une couche mince (100 pi) de l'ECM / suspension des médias.
- Placer la plaque sur la glace et procéder immédiatement à establishment des cultures d'organes. Vous pouvez également préparer la plaque avant la collecte des tissus, dans ce cas, l'envelopper en para-film et de conserver à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. Stockage de plus de 6 heures est pas recommandée car l'ECM va sécher.
4. Mise en place des cultures d'organes
REMARQUE: Cette étape décrit comment placer des cultures d'organes déciduales et des cultures d'organes villeux dans transwell séparés. Les tissus ne sont pas en contact. Les chercheurs intéressés par une technique de co-culture où decidua et villosités sont en contact direct les uns avec les autres, peuvent se référer à la littérature avant 9,10.
- Rincer les échantillons à deux reprises dans les médias de la collection, et centrifuger à 1000 xg entre chaque rinçage. Transfert tissu à une boîte de Pétri stérile et place sur la scène d'un microscope à dissection. Gardez plaque de 6 puits sur la glace adjacente au microscope.
- tissu Micro-disséquer avec springer disséquer des ciseaux et des pinces stériles, pour établir la culture d'organes villous 2-3 mms (figure 2A).
NOTE: Les cultures d'organes villosités sont de petits «arbres», bien vascularisées avec 2 ou 3 branches, et avec trophoblaste extravillositaire (EVT) colonnes de cellules de premier plan 11. Il est important d'utiliser seulement tissu villeux de <9 semaine spécimens du premier trimestre, comme l' invasion des trophoblastes extravilleux dans ECM est le plus prononcé à ces jeunes âgés de 13 ans. - Sélectionnez villosités bien vascularisé avec des colonnes de cellules EVT de premier plan. Colonnes de cellules EVT sont visualisées sous forme de bulbe, "floue", extrémités "moelleuses" (voir flèches sur la figure 2A).
- Utilisez des pinces stériles pour transférer 3 ou 4 arbres villeux dans chaque Transwell. Ajuster branches pour arbre est positionné à plat au sommet d'ECM et branches agglomérées séparées.
- Micro-disséquer les tissus déciduale avec springer disséquer des ciseaux et des pinces stériles, pour établir 3 mm 3 cultures d'organes déciduales (Figure 3A).
NOTE: Les échantillons contiennent deux distypes tinctes de tissus déciduales, parietalis decidua et decidua capsularis (fragments de droite tissus, respectivement, la figure 3A gauche et). - Coupez avec des ciseaux pour créer 3 mm 3 morceaux de decidua parietalis. Decidua capsularis est pas utilisé pour ces cultures. Utilisez une pince pour taquiner loin du sang maternel coagulé.
- Utilisez des pinces stériles pour transférer 3-4 morceaux de decidua dans chaque Transwell.
- Ajouter 1ml de Collection médias à fond du puits. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2
- Pour les expériences dans lesquelles il est important d'imiter la tension d'oxygène du placenta premier trimestre de grossesse normale, maintenir des cultures d'organes villeux hypoxie relative (3% de O 2).
REMARQUE: Les options de laboratoire comprennent de petites chambres hypoxie de l' incubateur qui correspondent à l' intérieur des incubateurs existants, ou un incubateur tri-gaz qui introduit le gaz N 2 externe pour abaisser la concentration en oxygène. - Ajouter 1 ml de Villous ou moyenne déciduale (Table 1) vers le haut de Transwell après 12-16 heures de culture.
NOTE: L'absence de médias au cours de la première nuit dans la culture permet aux colonnes de cellules de trophoblastes extravilleux d'envahir (culture villeux), et pour le tissu (à la fois des villosités et déciduale) pour devenir solidement ancré dans l'ECM. Dans notre expérience, des cultures d'organes déciduales restent viables pendant 72 h et organes villous cultures pour 96 h. Nous recommandons paramètres expérimentaux qui tombent dans ce délai. Voir le tableau 1 pour la composition du milieu Villous et déciduale. Moyen Villous a un pourcentage élevé de FBS, tandis que le milieu déciduale est complété par des hormones de grossesse (progestérone, 17ß-estradiol) qui maintiennent l'état decidualized (tableau 1).
5. Préparation de L. monocytogenes cultures
NOTE: Pour le protocole détaillé sur le stockage à long terme de L. monocytogenes, et la culture et la croissance des this organisme en infusion cerveau - coeur (BHI) et l' agar, s'il vous plaît se référer à Wang et al. 14
- Choisissez un seul L. monocytogenes colonie strié plaque de gélose BHI et ensemencer 3 ml de bouillon BHI.
- Incuber L. monocytogenes culture de la nuit (16 h), dans une position inclinée, à 30 ° C.
. REMARQUE: Ces conditions de culture permettent la croissance bactérienne pour atteindre la phase stationnaire L. monocytogenes est flagellé à 30 ° C, ce qui augmente l' invasion de la cellule hôte 15.
6. Infection des cultures d'organes avec L. monocytogenes
- Chaud PBS et Villous ou moyenne déciduale (tableau 1) à 37 ° C.
- Utilisez des pinces stériles pour enlever les morceaux de culture d'organes qui n'envahissent dans l'ECM, et sont donc flottant dans le puits.
- Aspirer soigneusement les médias de bas de Transwell. Rincer transwell supérieure et inférieure à deux reprises par un léger pipetage 1 ml de guerrem PBS dans le puits, et aspirer soigneusement entre les deux. pipette doucement 1 ml de sans antibiotique Villous ou déciduale médias à Transwell supérieure et inférieure. Veillez à ne pas perturber la culture d'organe.
- Laissez le tissu incuber dans des milieux sans antibiotiques pendant au moins une heure pour assurer que les antibiotiques ont été enlevés.
NOTE: A la phase stationnaire de la densité du L. la culture monocytogenes est d' environ 1 x 10 9 unités formant colonie (UFC) par ml. Le nombre de bactéries utilisées pour infecter des cultures d'organes doit être déterminée de manière empirique pour répondre aux besoins expérimentaux. - Pour type sauvage L. monocytogenes expériences d'infection de routine montrent une invasion robuste avec une dilution au 1:50 de la nuit (4 x 10 7 L. monocytogenes dans 1 ml de milieu par puits). Resuspendre le nombre approprié de bactéries dans Villous ou déciduale milieu sans antibiotiques.
- Aspirer le milieu du haut de transwell. ajouter doucement 1 ml d'inoculum. Incuber les plaques à 37° C dans 5% de CO2 pour permettre une invasion bactérienne.
- Éliminer les bactéries extracellulaires par aspiration média à partir transwell supérieure et inférieure. Rincer les puits deux fois avec du PBS chaud. Ajouter 1 ml de villosités ou un support déciduales supplémenté avec 50 pg ml - 1 de gentamicine. Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO2.
NOTE: L. monocytogenes est une bactérie intracellulaire facultative qui peut se développer dans un milieu extracellulaire, développer à l' intérieur des cellules, et la propagation de la cellule à cellule sans accéder à l'espace extracellulaire. Gentamicine a un effet bactéricide sur extracellulaire L. monocytogenes, et permet ainsi la mesure de intracellulaire L. monocytogenes croissance et la propagation à travers la culture d'organes 16.
NOTE: Reproductible L. l' infection par le monocytogenes des cultures d'organes villeux et decidua se produit avec 5 h temps d'incubation. Le temps d'incubation avant l'addition de gentamicine peut être modifié en fonction des besoins expérimentaux et abilité de l'organisme à envahir les tissus. Pour mieux comprendre les sites anatomiques les plus vulnérables à l' infection, la réduction des temps d'incubation peuvent être utilisés 2. - Maintenir les plaques à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant toute la durée de l'expérience. Changer les médias ensemble dans chaque puits par jour.
NOTE: Dans notre expérience, L. monocytogenes cultures d'organes déciduales infectés par le restent viables pendant 48 h et organes villous cultures pendant 72 heures.
7. Récolte des cultures d'organes pour histopathologie
- Préparer une nouvelle solution de paraformaldéhyde 4% en diluant 10 ml d'une 16% actions ampoule dans 30 ml de PBS. Magasin paraformaldéhyde 4% à 4 ° C, à l'abri de la lumière, et d'utiliser moins d'une semaine. Porter à la température ambiante avant utilisation.
- Aspirer le milieu de Transwell supérieure et inférieure. Rincer délicatement les puits deux fois avec du PBS à la température ambiante. Ajouter délicatement 1ml paraformaldéhyde 4% à Transwell haut pour couvrir complètement la culture d'organe.
- Incuberdans 4% de paraformaldehyde à la température ambiante pendant 20 min. Évitez de plus longues durées d'incubation, car cela pourrait conduire à une fixation du tissu.
- Aspirer le paraformaldehyde et le puits de rinçage deux fois avec du PBS à la température ambiante. Intégrer les cultures d'organes fixes en milieu OPO, gel, et de l'article sur un cryostat ( "fixe gelé"). En général, le tissu congelé fixe est plus facile à la section de tissu congelé sans fixation préalable.
NOTE: Pour le protocole complet sur octobre plongement et tronçonnage congelé, s'il vous plaît accéder à des sections pertinentes des protocoles publiés 17,18. En fonction des besoins expérimentaux et matériel de laboratoire disponibles et le stockage, le tissu peut plutôt être inclus dans la paraffine et sectionnés sur un microtome 19. - Préparer d' autres lames de tissu pour hématoxyline & éosine routine, immunofluorescence, ou immunohistochimie 18,20,21.
Representative Results
Figure 1 (modifié de Zeldovich & Bakardjiev 22) schématise la barrière placentaire pertinente et l' anatomie utérine. La figure 2 montre brute représentative et images histologiques de villosités placentaires, tandis que la figure 3 montre les tissus déciduale.
Ce protocole décrit d'abord la collecte des placentaire frais et de tissus déciduale à l'hôpital ou à la clinique. Le spécimen récolté est un mélange de placentaire fœtal (villosités) et des composants de l'utérus maternel (decidua). Après rinçage avec un tampon contenant des antibiotiques à large spectre et antifongiques, l'ensemble de l'échantillon est inspecté par l'oeil en utilisant une boîte à lumière. Villi et decidua sont placés dans des tubes séparés et transportés sur la glace au laboratoire. Au laboratoire, un microscope de dissection est utilisé pour apprécier les caractéristiques morphologiques fines de tissus sains. photographies représentatifs devillosités (figure 2A) et les tissus déciduales (Figure 3A) qui ont été acquises avec un microscope à dissection avec deux sources lumineuses externes du col de cygne sont présentés pour référence.
cultures d'organes villosités sont générés à partir des premiers échantillons de trimestre. Les cultures se composent de petits arbres villosités terminales avec 2-6 branches. Il est important de disséquer les branches villosités qui se terminent dans les colonnes du trophoblaste extravilleux et sont bien vascularisé. Ces caractéristiques sont considérées comme "pelucheux" ou "floue" extrémités de branche (pointes de flèche), et la faible linéaire teinte rose à rouge que les cours à travers les branches de l'arbre sur la gauche de la figure 2A. En revanche, la vascularisation et trophoblastes extravilleux ne sont pas facilement visualisées pour l'arbre sur la droite de cette image, qui serait optimale pour la culture. Au cours de la première journée de la culture, les trophoblastes extravilleux migrent dans l'ECM, thus ancrage des arbres villosités dans la matrice sur le Transwell.
cultures d'organes déciduales sont générés à partir des premiers et au début du deuxième trimestre de spécimens. La muqueuse utérine entière se transforme en decidua très peu de temps après l'implantation. Plus précisément, déciduale basal définit la muqueuse utérine sous-jacente directement sur le site du placenta / implantation, déciduale capsularis définit la muqueuse recouvrant le foetus et la caduque pariétale se réfère au reste de la muqueuse utérine. Visualisation sous un microscope de dissection montre que l'échantillon gestationnel précoce se compose essentiellement de parietalis decidua et decidua capsularis ( de gauche et de fragments de tissus à droite, respectivement, sur la figure 3A). La caduque ovulaire se distingue facilement par sa mince nature membraneuse. Pour les cultures d'organes, decidua parietalis est coupé à 3 mm 3 fragments avec des ciseaux micro-dissection et adhélocation sang coagulé est retiré avec une pince.
Après une nuit d' incubation, les tissus sont infectés par L. monocytogenes. Le protocole d'infection décrit ci - dessus est basée sur l'essai de protection contre la gentamicine utilisée pour étudier la croissance intracellulaire et la propagation des bactéries intracellulaires facultatives à 16. Cultures d'organes dans un milieu sans antibiotiques sont incubés avec L. monocytogenes pendant 5 heures. Les cultures sont lavées avec du PBS stérile pour éliminer les bactéries du milieu. Par la suite, la gentamicine est ajouté pour éliminer les organismes extracellulaires. Avant la littérature de notre laboratoire a utilisé immunofluorescence et la microscopie confocale pour déterminer la localisation tissulaire bactérienne à différents moments après l' infection 2. des cultures d'organes sont rincées dans du PBS, fixées dans du paraformaldéhyde 4%, et soit congelé enrobé dans un milieu octobre et stocké à -80 ° C, soit inclus dans la paraffine et on conserve à la température ambiante. Des sections de tissu peuvent être stained pour immunofluorescence (IF) ou immunohistochimique (IHC) analyse des bactéries et de la localisation des cellules eucaryotes. Figure 2B est un représentant IF image d'une section gelée préparée à partir d' une culture d'organes villous 8.3 d' une semaine à 72 heures après l' infection. Notez le lourd fardeau bactérienne (fluorescence verte) dans les EVTS aux extrémités des branches des villosités, et le manque relatif de bactéries dans l'arbre-lining syncytiotrophoblaste (fluorescence rouge) couche. Dans des travaux antérieurs, nous avons utilisé la même IF coloration pour localiser L. monocytogenes dans les cultures d'organes villeux à différents timepoints après l' infection. Plus de 72 heures, l'infection propagation de EVT dans cytotrophoblastes sous-syncytial et stroma villositaire sous-jacent. Notamment, la couche de synyctiotrophoblast est résistante à l' infection par deux.
images microscopiques lumière représentatifs de coupes de tissus déciduales H & E-tachés paraffine préparés à partir de 14,3 semaines specimens sont représentés sur les figures 3B et 3C. Cette membrane Transwell ECM revêtu a été incorporé pour montrer la culture d'organes in situ (figure 3B). L'image montre les glandes épithéliales bordées (astérisque) et vascularisation endothéliale doublé (diamant) positionnées de manière hétérogène dans le compartiment des cellules stromales déciduale. En outre, il existe des cellules du système immunitaire maternel dispersés à travers le stroma déciduale à une densité variable. IHC et IF coloration peut être utilisée pour déterminer la localisation des bactéries micro-anatomiques, par rapport aux cellules immunitaires résidentes spécifique. A titre d'exemple, les macrophages CD14 + (fluorescence verte) localisent à la paroi du système vasculaire et sont dispersés à l' intérieur du stroma (figure 3D), tandis que les gros agrégats de L. monocytogenes (fluorescence rouge) sont observées principalement dans le stroma decidual à 48 heures après l' infection (Figure 3D).
| Le tampon de lavage | Milieu de Collection | moyen villous | moyen déciduale |
| PBS | DMEM / F-12 avec GlutaMAX | DMEM / F-12 avec GlutaMAX | DMEM / F-12 avec GlutaMAX |
| Pénicilline 100 Ul / ml | Sérum fœtal bovin 2,5% | Sérum fœtal bovin 20% | Sérum fœtal bovin 2,5% |
| Streptomycine 100 pg / ml | Pénicilline 100 Ul / ml | Pénicilline 100 Ul / ml | 17β-estradiol 300 pg / ml |
| Gentamicine 50 ug / ml | Streptomycine 100 pg / ml | Streptomycine 100 pg / ml | Progestérone 20 ng / ml |
| Amphotéricine B 1,25 pg / ml | Gentamicine 50 ug / ml | ||
| < / Td> | Amphotéricine B 1,25 pg / ml |
Tableau 1:. Média recettes Composants et concentrations pour la préparation du tampon de lavage, moyenne Collection, moyenne Villous, et moyen déciduale.
Figure 1. placentaire structure. (A) Structure de l' unité foeto-placentaire dans l' utérus maternel, (B) Agrandissement de la case dans (A) souligne que trophoblaste fœtal (T) bordée villosités placentaires sont baignées dans le sang maternel et ancrées dans la decidua par trophoblastes extravilleux (EVT). Villosités sont contenus dans les vaisseaux foetaux (FV), les fibroblastes, les macrophages et les foetus. Modifié à partir de Zeldovich & Bakardjiev 22. "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: des cultures d'organes villosités - brute représentant et images microscopiques (A) Deux arbres villosités terminales avec un âge gestationnel de 6 semaines, comme vu sous un microscope à dissection.. Notez les extrémités "moelleuses" (pointes de flèche) et vascularisation fœtale importante qui parcourent les branches de l'arbre sur la gauche qui font de ce morceau adapté à la culture d'organes. (B) La microscopie en immunofluorescence de la culture d'organes (âge gestationnel 8,3 semaines) après l' infection 72 h par la bactérie Listeria monocytogenes, mettant en évidence la charge bactérienne lourde [vert] dans trophoblastes extravilleux. DAPI est représenté en bleu, et ßhCG + syncytiotrophoblastes en rouge. Barres d'échelle = 1 mm (A), 250 um (B).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Culture d'organes déciduale - brute représentant et images microscopiques [gauche] et decidua capsularis parietalis (A) decidua [droit] à l' âge gestationnel 6 semaines, vue sous un microscope de dissection. Section (B) H & E teinté de culture d'organe de 14,3 semaines l' âge gestationnel decidua montre glandes et vasculature organisés tout au long hétérogène stroma déciduale. Le (diamant, ◆) et l'astérisque (*) soulignent navire représentant et de la glande, respectivement. ligne Brown au bord inférieur est Transwell membrane, sur le bord. (C) H & E tachés section de 14,3 semaines decidua âge gestationnel parietalis culture d'organes au plus haut grossissement demonstrates artérioles spiralées musculaire à parois intégrées dans stroma déciduale. les cellules immunitaires maternelles sont petites et rondes noyaux sombres, et sont irrégulièrement réparties tout au long du stroma. (D) de la microscopie par immunofluorescence de la culture d'organes post - infection 48 h avec L. monocytogenes, mettant en évidence les grandes zones de bactéries [rouges] dans stroma déciduale et CD14 maternelle + macrophages [vert] alignant un espace vasculaire tortueux et dispersés dans le stroma. Barres d'échelle = 1 mm (A), 250 um (B), 50 um (C et D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Discussion
, les souches transgéniques et knockout souris consanguines peuvent servir dans des systèmes expérimentaux pour tester robuste mécanismes. Cependant, en dépit de la conservation générale du matériel génétique de base, les génomes fonctionnels de souris et les humains montrent des différences significatives dans les éléments régulateurs 23. Il est donc pas surprenant, que les études précliniques prometteurs dans des modèles animaux ne sont parfois pas récapitulé chez des patients humains. Le placenta montre la diversité interspécifique très élevé, rendant ainsi les modèles animaux moins de idéal pour l'étude des maladies humaines 24. Reconnaissant à la fois les différences notables en immunologie humaine et de la souris 25, et l'évolution divergente prononcée dans l' anatomie du placenta, il est prudent d'envisager l'utilisation des ex vivo des cultures d'organes de tissus gestationnels humains aux fins d' enquête expérimentale.
Les descriptions, images photographiques et vidéo d'enseignement dans ce protocole instruisent chercheurs surcomment établir des villosités et des cultures d'organes déciduales sur tissu Transwell inserts de culture ECM-enduit. Les avantages de cette technique sont la simplicité relative de la micro-dissection mécanique et système de support de Transwell, en particulier par rapport à d'autres méthodes telles que les matrices 3D intégrées ou des cultures de tranche d'organes. Suspension de la culture d'organes sur le soutien de la membrane permet l'échange d'éléments nutritifs à toutes les surfaces de tissus et de la viabilité est maintenue pour la culture à court terme (96 h pour les cultures villeux, 72 h pour les cultures déciduales) technique .Cet permet d'étudier la biologie placentaire humaine au niveau du tissu niveau, indéniablement plus biologiquement pertinente que les modèles de culture cellulaire monocouche.
L'étape la plus critique dans ce protocole est le micro-dissection des pièces villeux et déciduales appropriées pour la culture d'organes. Morceaux de tissu optimales sont mises en évidence photographiquement (figure 2A et la figure 3A) pour aider les chercheurs pour lesquelsvisualisation des spécimens de gestation est nouveau. Il est particulièrement important de choisir des arbres villosités dont les branches se terminent par des colonnes de EVT, car ces cellules vont migrer dans l'ECM et aider à ancrer les villosités de la membrane. Pour les deux types de cultures d'organes est utile pour réduire au minimum les perturbations du tissu lors des changements de médias par pipetage d'une manière prudente et sans hâte.
Cette technique présente des difficultés minimes. À l'occasion, les échantillons montrent une contamination. La contamination bactérienne est habituellement (parfois poly-microbienne), et ne devient évidente après 1-2 jours de culture. Une fois que la contamination est observée, l'eau de Javel doit être appliquée, la culture mis au rebut, et l'incubateur de culture de tissu stérilisé pour éviter un problème à long terme. Il existe plusieurs façons possibles de contamination peut survenir: l'infection in utero, pendant l'intervention chirurgicale, au cours de spécimen récolte / transformation, ou lors de l'entretien de la culture d'organes. Les étapes de récolte et de transformation sont le moment le plus probableet le lieu de la contamination à introduire. Ainsi, il est important de réduire la durée pendant laquelle l'échantillon est manipulé lors de la collecte et de la micro-dissection. Cela permettra de réduire l'exposition de l'échantillon à la température ambiante, l'environnement non stérile. Selon la configuration du laboratoire, le microscope de dissection peut être situé à l'intérieur de la hotte de culture tissulaire stérile.
L'analyse histopathologique des cultures d'organes après l' infection par l'agent pathogène pertinent L. médicalement monocytogenes, est montré ici comme une application possible du protocole. Immunofluorescence localisation des bactéries et des cellules immunitaires de l'hôte après les rendements de l'infection de nouvelles connaissances sur la réponse de l'hôte humain à des agents pathogènes. Cultures d'organes déciduales pourraient servir ex vivo technique d'expérience complémentaire pour examiner les données générées par les infections in vivo de souris, y compris les rapports intrigants présentant des défauts dans les fonctions de défense des macrophages murins déciduales 26,27. En outre, l'homme orgune culture peuvent être utilisées dans des stratégies mixtes infection, comme un inoculum compétitif composé de plusieurs souches isogéniques de L. monocytogenes. infection concurrentielle des cultures d'organes est une manière sensible à tester la pertinence des facteurs de virulence chez l'hôte humain. Une contrainte de cette méthode est la viabilité des tissus, qui est limitée à la culture à court terme (96 h pour les cultures villeux, 72 h pour les cultures déciduales). Ceci est idéal pour l' infection par des microbes à croissance rapide tels que L. monocytogenes, mais plus les cultures peuvent être nécessaires pour les agents pathogènes qui prennent plus de temps pour établir et diffuser à travers les tissus.
Afin de réduire le fardeau mondial des complications de la grossesse, la recherche doit se concentrer sur la compréhension de la physiopathologie de l'interface materno-fœtale humaine. Bactérienne, fongique, et des agents pathogènes viraux qui traversent la mère au fœtus cause de complications dévastatrices de la grossesse et de l'infection fœtale. Contrôlée dans l' infection in vivo de laboratoire animals est généralement considéré comme l'étalon-or pour aborder la façon dont les agents pathogènes colonisent et de transit entre les organes 28. Parce que l'anatomie du placenta varie considérablement entre les espèces de mammifères, il est de la plus haute importance d'incorporer les tissus humains dans les stratégies de recherche. cultures d'organes villeux et déciduales humains sont des systèmes modèles très pertinents pour enquêter sur les interactions hôte-pathogène. Pour étudier cet organe encore mal compris vital, les chercheurs peuvent profiter de l'abondance de placenta humain jetés autrement et spécimens déciduales, en utilisant des stratégies de culture d'organes tels que décrits ici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. Pathogens and the placental fortress. Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
