Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

doi: 10.3791/54252 Published: October 8, 2016

Summary

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 + CD34 - pericytes ו CD34 + CD146 - תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הלב מזה זמן רב נחשב איבר שלאחר mitotic. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מחזור cardiomyocyte מוגבל בלבות בני האדם המבוגר 1. תאי גזע / אב Native עם פוטנציאל התמיינות cardiomyocyte גם זוהו בתוך שריר הלב ב מכרסמים מבוגרים בליבותיהם, כולל SCA-1 +, c-kit +, cardiosphere יוצרים, ולאחרונה, 2,3 תאי מבשר perivascular. תאים אלה מייצגים מועמדים אטרקטיביים עבור טיפולים שמטרתם הגברת תיקון / התחדשות לב באמצעות השתלה תאית או גירוי של התפשטות in-situ.

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) בודדו כמעט מכל רקמה אנושית 4,5 ניסויים קליניים של היישומים הרפואיים של MSC בוצעו עבור במצבים פתולוגיים רבים כגון תיקון לב וכלי דם 6, שתל נגד מאכסן מחלה 7 8. השפעות מועילות יוחסו היכולת של MSCs ל: בית לאתרים של דלקת 9; להתמיין לסוגי תאים שונים 10; להפריש מולקולות פרו-מתקן 11; ולווסת תגובות מארח חיסון 12. בידודו של MSCs הסתמך באופן מסורתי על הדבקות המועדפת שלהם מצעי פלסטיק. עם זאת, האוכלוסייה של תאים והתוצאה היא בדרך כלל במידה ניכרת הטרוגניים 13. באמצעות תא פלורסנט מיון מופעל (FACS) עם שילוב של סמני תא מפתח perivascular, הצלחנו לבודד ולטהר אוכלוסייה מבשרת MSC הדמוי מולטיפוטנטיים (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) מ ברקמות אנושיות מספר כולל שרירי שלד מבוגרים ו -14 שומן לבן.

אוכלוסיות תאי perivascular ברקמות שאינן לב שונות הוכחו כבעלי תכונות של תאי גזע / אבnd נחקרים לשימוש קליני הגדרת הלב וכלי הדם. Pericytes, אחד תת תא perivascular הידוע ביותר, הם אוכלוסייה הטרוגנית ממלאות תפקידי pathophysiological מספר כולל בפיתוח הכלי החדש 15, ויסות לחץ דם 16, ותחזוקה של שלמות כלי דם 17,18. כפי שניתן לראות רקמות מרובות, תת-מערכות ספציפיות של pericytes המקורי להביע אנטיגנים MSC ולקיים פנוטיפים MSC הדמוי שלהם בתרבות העיקרית לאחר FACS טיהור 14. יתר על כן, תאים אלה ביציבות לשמור פנוטיפים שלהם לטווח הארוך בתוך התרבות להפגין פוטנציאל התמיינות רבה שושלת, בדומה MSCs 19,20. התוצאות מראות כי pericytes הוא אחד המקורות של MSC החמקמק 14. הפוטנציאל הטיפולי של pericytes הודגם עם ירידת הצטלקות שריר לב ומשופר תפקוד לב לאחר השתלה לתוך ischemically נפצעלבבות 21. לאחרונה, אנו מטוהרים בהצלחה pericytes מן שריר הלב האנושי והפגינו MSC דמוי פנוטיפים ו multipotency (adipogenesis, chondrogenesis ו osteogenesis) שלהם עם העדר myogenesis השלד 3. בנוסף, pericytes שריר הלב הציג יכולות פוטנציאליות ו angiogenic cardiomyogenic ההפרש בהשוואה לעמיתיהם מטוהרים מאיברים אחרים.

אוכלוסייה שנייה של ובתאים / גזע perivascular מולטיפוטנטיים, תא adventitial, מבודדת מייתר ורידי אדם saphenous על בסיס ביטוי CD34 החיובי 22. תאי adventitial ורידים הוכחו כבעלי פוטנציאל clonogenic, קיבולת בידול mesodermal ופוטנציאל proangiogenic במבחנה. השתלה של תאים אלה לתוך ליבם נפגע ischemically של עכברים הביא לירידה ב סיסטיק ביניים, גידול אנגיוגנזה זרימת הדם בשריר הלב, מופחת חדרית dilation, פליטת לב מוגברת חלק 23. מעניין לציין, כי תאי adventitial שומן הוכחו לאבד ביטוי CD34 ו upregulate ביטוי CD146 בתרבות בתגובה לטיפול angiopoietin השני, דבר המצביע על אימוץ פנוטיפ pericyte עם גירוי 24. בתוך הלב, לעומת זאת, אוכלוסיית תא adventitial טרם מטוהרת באופן פרוספקטיבי על ידי FACS ו / או גם מאופיין. ניצול הליכי בידוד תא המתוארות בסעיפים הבאים, אנו נמצאים כעת מאפיינת תאי adventitial שריר לב לחקור את הפוטנציאל שלהם ליישומים רגנרטיבית.

בזאת אנו מתארים שיטה לבודדת ולטהר שתי תת-אוכלוסיות של תאי גזע / אב perivascular מ שריר לב עוברי או אדם בוגר. שיטה פוטנציאלית לצינוק זה תאפשר לחוקרים לקבל גזע perivascular isogenic / אב תת תא ביופסיות לב אנושיות ללימודים השוואתיים further לחקור הפוטנציאל הטיפולי שלהם שונים במצבים פתולוגיים הלב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עיבוד 1. לדוגמא אדם לב

  1. ודא כי כל הנוזלים, מכולות, המכשירים, והשטח המבצעי הייעודי הם עקרים.
  2. מניחים את המדגם ברקמת הלב (רכש על ידי בנק רקמות או צוות המנתחים) במדיום אחסון מורכב בינוני הנשר שונה של צונן Dulbecco (DMEM) המכילה סרום שור העובר 20% (FBS) ו -1% סטרפטומיצין פניצילין (P / S) על הקרח לתחבורה 3.
  3. הסר את מדגם הלב ממדיום האחסון ולשטוף עם מדיום כביסה מורכב פוספט שנאגר מלוח (PBS) בתוספת 2% FBS ו -1% P / S. בעת טיפול המדגם, השתמש קנס מלקחיים הטו לתפוס כלי גדול או קרום לב ולמזער מוחצת של שריר הלב.
  4. לצלול המדגם במדיום כביסה בצלחת פטרי ולהסיר את קרום הלב, endocardium וכלי דם גדולים עם איריס מספריים מעוקרים מלקחיים קנס שקצהו כמתואר 3.
  5. חותכים את myoca הנותריםrdium לחתיכות קטנות של כ 1 מ"מ 3 באמצעות סכין גילוח צד אחד או זוג מספרי איריס חדה. הערה: תשואות תא הגבוהות ביותר תושגנה אם דגימות מעובדים באופן מיידי. אם חל עיכוב בלתי נמנע, אחסון של ברקמת הלב מעובד במדיום אחסון טריים (> 5 מ"ל לכל 1 ס"מ 3 רקמות) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך עד 72 שעות אפשרי, אולם ככל הנראה עם ירידה הקשורים בתשואה התא.

עיכול 2. של רקמות בידוד של תאים

  1. טרי שמרכיבים את פתרון העיכול המהווים 1.5 מ"ל כל אחד collagenase אני, collagenase II, ו- IV collagenase (בבת 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ב DMEM) וחמים עד 37 מעלות צלזיוס waterbath.
    הערה: נפח וריכוז collagenases מתאימים דגימות של כ 1 ס"מ 3.
  2. סנן את חתיכות רקמה מושעה דרך מסננת 100 מיקרומטר ולשטוף פעמיים עם PBS. מעבירים את חתיכות רקמה למיכל 30 מ"ל סטרילי עםמכסה אטום בחוזקה.
    הערה: סירים רחבים קצרים ולא צינורות צרים גבוהים לתת תוצאות טובות יותר. לחלופין, לשים פיסות רקמה בתוך שפופרת סטרילית 50 מ"ל ומניחים אופקיים אם מיכל 30 מיליליטר אינו זמין.
  3. הוסף את כל הפתרונות העיכול (4.5 מ"ל סה"כ) ולמקם את המיכל בתוך שקית פלסטיק אטום באמבט מים רועד 37 ° C מוגדר 120 סל"ד. לחלופין, לאטום את המיכל עם הסרט פרפין ומניחים שייקר מסלולית מחוממת מוגדר 120 סל"ד.
  4. לאחר 15 דקות, להסיר ו להפוך את הסיר שלוש פעמים לפני ההחלפה במשך 15 דקות נוספות. הסר להרוות את collagenases עם 5 מ"ל של DMEM בתוספת FBS 20% ו -1% P / S.
  5. Triturate לעכל ידי pipetting בעדינות עשרה עד עשרים פעמים עם טפטפת סרולוגיות 10 מ"ל להיפרד כל גושים ברקמה. סנן את ברצף ההשעיה דרך 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ולבסוף מסננות תא 40 מיקרומטר להסיר חומרים מעוכלים ו לקבל השעיה תא בודד.
    הערה: אין לשטוף בין מסננות התא כדי למנוע תא debrisgenerated ידי תהליך העיכול אנזים.
  6. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 200 במשך 4 דקות, בזהירות למזוג supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של תא אדום lysing חיץ עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר לפני דילול עם 4 מ"ל של מדיום שטיפה.
  7. חזור על השלב צנטריפוגה מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של מדיום שטיפה. מערבבים היטב ולקחת 10 μl של ההשעיה תא עבור ספירת תאים.
  8. מערבבים 10 μl של ההשעיה תא עם 10 μl של כתם כחול Trypan ומקום 10 μl של התערובת על hemocytometer תקן ספירת תאים. ספירת תאים בהירים, בסיבוב הנוכחי בכיכרות הפינתיות (כל מחולק שש עשרה ריבועים קטנים) ולחלק 4 כדי לקבל את הממוצע לכל מ"ר בפינה. הכפל את הממוצע על-ידי 2 לחשבון עבור גורם לדילול הכתם ולאחר מכן ב -10 4 כדי לקבל את המספר הכולל של תאים לכל 1 מ"ל של המדגם.

= "Jove_title"> 3. תוויות תא ומיון

  1. הוסף 50 μl של עכבר בסרום על השעיית תא דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לחסום נוגדן הלא ספציפי מחייבות.
  2. צנטריפוגה ההשעיה תא עם סרום עכבר ב XG 200 במשך 4 דקות, להסיר supernatant, מחדש להשעות במדיום כביסה בריכוז של 1 x 10 6 תאים לכל 100 μl.
  3. Aliquot 50 μl כל אחד השעית התא עבור אלוטיפ ובקרות בלא כתם לשתי התחתון קלקר עגול cytometry זרימת צינורות מכן למקם את הנפח הנותר לתוך צינור שלישי מכתים צבע רב.
  4. הוספת CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, ונוגדנים CD146-AF647 (כל 1: 100) על השעיית תא בודד עבור מכתים צבע רב. על בקרת אלוטיפ, להוסיף כמויות מקבילות של PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- ונוגדני אלוטיפ AF647 מצומדות. בעדינות פיפטה לערבב נוגדנים עם תאי דגירה כל הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20דקות בחושך.
  5. כן חרוזים מלאי פיצוי על ידי הוספת טיפה אחת של חרוזים חיוביים 100 μl של מדיום כביסה בחמישה קלקר עגול צינורות זרימת cytometry תחתונים. הוספת CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, ונוגדנים CD146-AF647 (כל 1: 100) בנפרד לכל אחד 5 הצינורות. דגירה כל הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך.
  6. במהלך הדגירה, להכין צינורות איסוף כל תא עם 500 μl של האנדותל צמיחה בינוני-2 (EGM-2) בינוני תרבות ומקום על 4 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר דגירה נוגדן, להוסיף 5 מ"ל של מדיום כביסה לשטוף תאים וחרוזים על מנת להסיר נוגדן מאוגד. צנטריפוגה כל הצינורות ב XG 200 במשך 4 דקות. חזור על שלב כביסת צנטריפוגה. בזהירות למזוג supernatant פיפטה בעדינות כאשר מחדש השעיית תאים.
  8. מחדש להשעות במדיום כביסה בריכוז של כ 1 x 10 6 תאים לכל 250 μl. Re- להשעות את החרוזים 100 μl של כביסה מedium.
  9. להעביר את כל מתלי התא חרוז אל סדרן התא על קרח בחושך. להוסיף 1 טיפה של חרוזים שלילי הצינורות מלאי פיצוי חרוז החיוביים ולהשתמש אלה הגדרה פיצוי הקרינה.
  10. הפעל לתאי קבוצה בלא כתם על פי הוראות היצרן כדי להקים את קרינת הרקע ולהגדיר את המתחים להודעה הבא: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. שולט isotypes המתנהל על פי הוראות היצרן כדי לקבוע את סף קרינת רקע הקשורים הלא ספציפי מחייב. הפעל את המדגם רב צבע מוכתם לאסוף את pericyte ו אוכלוסיות תאים adventitial לתוך צינורות אוסף (איור 1).
    הערה: תשואות תא קיימא אופטימליות כ 3% של דיסוציאציה התא כולל החייה עבור pericytes ו -4% עבור תאי adventitial.

4. תרבית תאים

  1. בחר תרבות צלחות בגודל מתאימה על פי התוצאה של מיון FACS. הוספת 100 μl של פתרון ג'לטין סטרילי 0.2% לס"מ 2 של אזור הגידול להתסיס ידני כדי לצפות את בארות כולו. דגירה צלחות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהסיר פתרון ג'לטין לחלוטין. שמור את התאים שנאספו על הקרח בזמן הכנת צלחות תרבות.
    הערה: pericytes מסודרים טרי ותאי adventitial לגדול גם כאשר זורעים בצפיפות של 30,000 עד 40,000 תאים / 2 ס"מ על משטח תרבות ג'לטין מצופה.
  2. צנטריפוגה שנאספו תאים טרי ב XG 200 במשך 4 דקות בעדינות מחדש להשעות את התא גלולה ב הכמות המתאימה של EGM-2.Seed התאים על צלחות מצופה ג'לטין.
    הערה: המספר האמיתי של תאים להיות זורע לכל טוב וכמות EGM-2 להתווסף תלוי בבחירת הצלחת. לדוגמה, 0.5 מ"ל ו 1 מ"ל EGM-2 נדרשים לכל טוב עבור -48 ו 24 גם צלחות בהתאמה.
  3. המרת EGM-2 בינוני צמיחת תאים perivascular (DMEM בתוספת FBS 20% ו -1% P / S) עבור שני pericytes ותאי adventitial פעם תאים התיישבו ודבקו לצלחת (לאחר לפחות 72 שעות). שנה את התקשורת בכל 72 שעות מאותו רגע והלאה. לבצע ראשוני וכל incubations הבא ב 5% CO 2 ו ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. לנתק תאים באמצעות EDTA 0.05% טריפסין כאשר pericytes ותאי adventitial להגיע 80 עד מפגש 90%. להרוות עם FBS 20% ב- PBS, צנטריפוגות ב XG 200 במשך 4 דקות, מחדש להשעות במדיום צמיחת תאים perivascular, ולאחר מכן מעבר התאים ב יחס של 1: 3 על תרבות צלחות קלקר ללא ציפוי. מפסוק 2 ואילך, תאי המעבר ביחס של 1: יחס 5 (או כ -7,000 תאים / 2 ס"מ) צלחות או צלוחיות תרבות קלקר ללא ציפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאים בודדים נבדלו פסולת כפילויות על בסיס חלוקות פיזור קדימה והצד. תאים חיים זוהו על ידי הכישלון שלהם לקחת את צבען DAPI. האסטרטגיה gating נבחר על בסיס תיוג אלוטיפ של חיה זו, דיסוציאציה התא כולו-לב (איור 1). מתוך תאי חיים, CD45 + תאים היו מגודרים החוצה ראשונה, ואחריו CD56 + תאים. תאי CD144 + אנדותל ואז הוצאו מן CD56 - חלק. מתוך אוכלוסייה זה סופי, CD146 + / CD34 - pericytes ו CD146 - / CD34 + תאים adventitial נבחרו ולאחר מכן אספו (איור 2). מיד לאחר איסוף תאים, מדגם קטן של כל תת-אוכלוסייה (500-1,000 תאים) מחדש להפעיל באמצעות סדרן כדי לאשר חלוקת התא היה כפי שנרשמו מהסוג הראשוני. Peric שריר הלב FACS מטוהר ytes ותאי adventitial הן מפגינים ציר כדי stellate מורפולוגיה תא בתרבות (איור 3).

איור 1
איור 1:. אסטרטגית Gating FACS מגרש נקודות נציג שליטת אלוטיפ שכותרתו תאים ניתקים לב אנושיים להמחיש את המיצוב של שערים מהסוג .. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: טיהור FACS של תאי perivascular שריר לב מיון נציג של שני תת-האוכלוסיות של תאי מבשר perivascular לב ממדגם שריר לב אנושי אחת..es / ftp_upload / 54,252 / 54252fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. מורפולוגיה תא perivascular בתרבות שתי אוכלוסיות תאים מבשר perivascular הלב, pericytes (פאנל משמאל) תאים adventitial (מימין) מוינו הומוגניות ידי FACS טיהור והרחיב עוד בתרבות (ב מעבר 3, ברים סולם = 50 מיקרומטר ). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ראיות הגדלת תומך יכולת התחדשות מוגבלת של הלב האנושי המבוגר לאחר פציעה. זיהוי ואפיון של תאי מבשר יליד אחראים תגובות התחדשות כאלה לבבות פגועים הם קריטיים עבור שני להבנת מנגנונים הקשורים מסלולי איתות ופיתוח הגישות לנצל תאים אלה טיפוליים.

פרוטוקולים קודמים תיארו את הבידוד של תת תאים מבשר perivascular מ 25 שרירי השלד האנושי. עם זאת, היישום הישיר של טכניקות אלה לרקמות לב לעתים קרובות לייצר יבולי תא עניים מאוד. כתוצאה מכך, עשינו שינויים גדולים לפרוטוקול כדי להעשיר שתי subpopulations הדיסקרטית של תאי מבשר perivascular, כלומר pericytes ותאי adventitial, ביופסיות שריר לב אנושיות וכדי להקל על הטיהור סימולטני של שני תת. בידוד של שני אוכלוסיות תאים מן sמדגם ame לא רק ולשימוש אופטימלי ביופסיות ברקמת לב יקרות אלא גם מאפשר השוואה ישירה של תת תא perivascular ברור.

על מנת לקבל את התשואה המקסימלית של תאים, את הרעננות של דגימת רקמה היא בעלת חשיבות מכרעת. תשואות תא קיימא מרבות pericytes ותאי adventitial כ 3% ו -4% של דיסוציאציה התא החייה הכוללת בהתאמה. תשואות עשויות להשתנות במידה רבה מכל רחבי 30,000 עד 400,000 תאים לכל משנה והם תלויים במידה רבה על מספר גורמים, כולל את הכמות והאיכות של רקמת ההתחלה ואת משך השימור. תאי perivascular יחסית עדינים; דגימות הראו סימנים ברורים של שינוי autolytic תמיד להניב מספרים סלולריים נמוכים לאחר FACS. באופן דומה, תאי perivascular רגישים טכניקות עיכול קשות, ואת יתר העיכול גם יגרמו תשואת תא קיימא מופחתת. התאמות אישיות של זמן העיכול ומהירות תסיסה עשויות להיות נחוצות על ידי individuaמעבדות l. לבסוף, גיל תורם גודל מדגם יהיה גם השפעות משמעותיות על תשואות תא.

יש לנו מאופיין בהרחבת pericytes לב שהושג באופן זה 3. תאים אלה הפגינו ההומוגניות בתרבות ללא זיהום תא האנדותל. אוכלוסיית הכפלת פעמים של כ -60 שעות בין קטעי 3 ו -12 צוינה עם הביטוי העקבי של שני סמני pericyte המשותפים (phosphatase אלקליין, NG2 ו α-SMA) וסמני MSC קלסיים (CD44, CD73, CD90 ו CD105) על פני תקופה זו. מעניין לציין, שיש נמצא כי לאחר demethylation, שבריר pericytes הלב הביע את שעתוק cardiomyogenic גורמים מפריעים Nkx2.5 ו GATA4. כאשר השיתוף תרבותי עם cardiomyocytes עכברוש בילוד, שבריר pericytes demethylated הלב הביע את אלפא-actinin sarcomeric סמני חלבון לב טרופונין-T, עם קבוצת קטין נוספת מפגין ונתיבי סידן ציטופלסמית ספונטני. יחדיו, ממצאים אלה Suggest כי subpopulation של pericytes לב בעל פוטנציאל cardiomyogenic ועל כן היא עשויה לשחק תפקיד בתהליך תיקון שריר הלב הפנימי. בהשוואה pericytes, תאים adventitial הלב להישאר uncharacterized ברובו. הנתונים הראשוניים פורסמו שלנו מראים כי תאי adventitial לב להביע סמני pericyte כגון PDGFR-β ו NG2, אם כי ברמות נמוכות יותר pericytes לב, תוך לאבד CD34 בתרבות. תאים אלה גם להביע סמני MSC קלסיים ולהראות osteogenic ופוטנציאל בידול adipogenic. מחקרים נוספים של תאי adventitial לב כולל מאפייני angiogenic ופרו-קרדיוגני נמשכים.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בו זמנית, טיהור פרוספקטיבי pericytes לב ותא adventitial ממדגם ברקמת לב אנושית אחת. תאים אלה מייצגים אוכלוסיות תאי מבשר רומן מלב עם מאפייני cardiomyogenic פוטנציאליים שעלולים להתברר candidat המתאיםes עבור טיפולים בתאים בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324, (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33, (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98, (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94, (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81, (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21, (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15, (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35, (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47, (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20, (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31, (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6, (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51, (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15, (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314, (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67, (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121, (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109, (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21, (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).More

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter