Isolering av perivaskulär multi Precursor cellpopulationer från Human hjärtvävnad
Summary
Human hjärtvävnad hyser multi perivaskulära prekursor cellpopulationer som kan vara lämpliga för hjärtmuskelregenerering. Den teknik som beskrivs här gör det möjligt för den samtidiga isolering och rening av två multipotenta stromala cellpopulationer som är förknippade med nativa blodkärl, dvs. CD146 + CD34 – pericyter och CD34 + CD146 – adventitiala celler, från den mänskliga hjärtmuskeln.
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
Hjärtat har länge ansetts vara en post-mitotisk orgel. Dock har nya studier visat att förekomsten av begränsad omsättning cardiomyocyte hos vuxna människors hjärtan 1. Native stam / progenitorceller med cardiomyocyte differentiering potential har också identifierats i hjärtmuskeln hos vuxna gnagare och människors hjärtan, däribland SCA-1 +, c-kit +, cardiosphere bildande, och nu senast, perivaskulära prekursorceller 2,3. Dessa celler representerar attraktiva kandidater för behandlingar som syftar till att förbättra hjärt reparation / regenerering genom celltransplantation eller stimulering av in-situ spridning.
Mesenkymala stamceller / stromaceller (MSC) har isolerats från nästan varje mänsklig vävnad 4,5 Kliniska prövningar av de terapeutiska tillämpningar av MSC har genomförts för flera sjukdomstillstånd såsom hjärt reparation 6, graft-versus-host-sjukdom 7 </sup>, Och levercirros 8. Positiva effekter har tillskrivits förmågan hos MSCs till: hem till inflammationsställen 9; differentiera till olika celltyper 10; utsöndrar pro-reparativa molekyler 11; och modulerar värdimmunsvar 12. Isoleringen av MSC har traditionellt förlitat sig på sin företrädesrätt vidhäftning till plastsubstrat. Emellertid är den resulterande populationen av celler vanligen markant heterogen 13. Genom att använda fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) med en kombination av viktiga perivaskulära cellmarkörer, har vi kunnat isolera och rena en multi MSC liknande prekursorpopulation (CD146 + / CD31 – / CD34 – / CD45 – / CD56 -) från multipla humana vävnader inkluderande vuxen skelettmuskel och vitt fett 14.
Perivaskulära cellpopulationer i olika icke-hjärtvävnad har visat sig ha stam / progenitorceller egenskaper and utreds för klinisk användning i det kardiovaskulära inställningen. Pericyter, en av de mest välkända perivaskulära cellgrupper, är en heterogen population som spelar flera patofysiologiska roller bland annat i utvecklingen av nya fartyg 15, reglering av blodtryck 16, och underhåll av vaskulär integritet 17,18. Som visas i flera vävnader, specifika delmängder av pericyter inbyggt uttrycka MSC antigener och upprätthålla sin MSC-liknande fenotyper i primär kultur efter FACS rening 14. Dessutom är dessa celler upprätthålla stabilt sina långsiktiga fenotyper inom kultur och uppvisar flera härstamning differentiering potential, liknande MSC 19,20. Dessa resultat tyder på att pericyter är en av ursprunget till den svårfångade MSC 14. Den terapeutiska potentialen av pericyter har visats med en minskning av hjärtmuskel ärrbildning och förbättrad hjärtfunktion efter transplantation i ischemiskt skadadehjärtan 21. Nyligen vi framgångsrikt renade pericyter från mänskliga hjärtmuskeln och visade sina MSC liknande fenotyper och multipotens (adipogenes, kondrogenes och osteogenes) med avsaknad av skelett myogenes 3. Dessutom, hjärt pericyter uppvisade differential cardiomyogenic potential och angiogena kapacitet jämfört med motsvarigheter renade från andra organ.
En andra population av multi perivaskulära stam / progenitorceller, den adventitiala cell, har isolerats från humana vena ådror på grundval av positiva CD34 uttryck 22. Venösa adventitiala celler har visat sig ha klonogen potential, mesodermal differentieringskapacitet och proangiogenic potential in vitro. Transplantation av dessa celler in i ischemiskt skadade hjärtan möss resulterade i en reduktion av interstitiell fibros, en ökning av angiogenes och myokardial blodflöde, reducerad ventrikulär dilation och ökad hjärt ejektionsfraktion 23. Intressant nog har fett adventitiala celler visats förlora CD34 uttryck och uppreglera CD146 uttryck i kulturen som svar på angiopoietin II behandling, vilket tyder på att anta en pericyte fenotyp med stimulering 24. Inuti hjärtat emellertid den adventitiala cellpopulationen har ännu ej prospektivt renas genom FACS och / eller väl karakteriserade. Med hjälp av cellisoleringsprocedurer som beskrivs i följande avsnitt, är vi för närvarande karakteriserar hjärt adventitiala celler och undersöka deras potential för regenerativa applikationer.
Häri beskriver vi en metod att isolera och rena två subpopulationer av perivaskulära stam / progenitorceller från human fetal eller vuxen myokardiet. Denna blivande cellisolering metod gör det möjligt för forskare att få isogena perivaskulära stam / progenitorceller grupper från humana hjärt biopsier för jämförande studier och further utforska deras terapeutiska potential i olika hjärt patologiska tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ökande bevis stöder en begränsad förnyelseförmåga av den vuxna människans hjärta efter skada. Identifiering och karakterisering av inhemska prekursorceller som ansvarar för dessa regenerativa svar i skadade hjärtan är avgörande för både förståelsen av tillhörande mekanismer och signalvägar och utveckling av metoder för att utnyttja dessa celler terapeutiskt.
Tidigare protokoll har beskrivit isolering av perivaskulära prekursor cellgrupper från human skelettmuskel 25…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
- Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
- Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
- Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
- Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
- Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
- Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
- Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
- Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
- Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
- Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
- Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
- Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
- Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
- Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
- Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
