Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

doi: 10.3791/54252 Published: October 8, 2016

Summary

İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 - - adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kalp uzun bir post-mitotik organı olarak kabul edilmiştir. Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar, yetişkin insan kalbinde 1 sınırlı kardiyomiyosit devir varlığını göstermiştir. Kardiyomiyosit farklılaşma potansiyeline sahip yerli kök / progenitör hücreleri de perivasküler öncü hücreleri 2,3, en son yetişkin kemirgen ve Sca-1 + dahil olmak üzere insan kalpleri, c-kit +, cardiosphere oluşturan miyokardın içinde tespit ve oylandı. Bu hücreler, hücre transplantasyonu veya in-situ çoğalmasının uyarımı yoluyla kalp onanmı / rejenerasyonunu arttırmaya yönelik terapiler için ilgi çekici adaylardır.

Mezenşimal kök / stromal hücreler (MSC), kardiyovasküler tamir 6 olarak MSC terapötik uygulamalarının 4,5 klinik çalışmalar çok patolojik durum için yapılmıştır, hemen hemen her insan dokusundan izole edilmiştir, graft-versus-host-hastalığını 7 8. Yararlı etkileri için MKH yeteneği atfedilen: inflamasyon 9 sitelere ev; farklı hücre tipleri 10 içine ayırt; yanlısı onarıcı molekülleri 11 salgılarlar; ve konak immün yanıtları 12 modüle. MKH izolasyonu geleneksel plastik yüzeylere kendi tercihli bağlılık güvendi. Bununla birlikte, hücrelerin elde edilen popülasyon, tipik olarak 13 belirgin da çok düşüktür. Anahtar perivasküler hücre belirteçleri bir kombinasyonu ile (FACS) floresan aktive hücre kullanarak, multipotent MSC gibi ön-madde popülasyonu (- / CD34 - / CD45 - / - CD56 CD146 + / CD31) izole edilmesi ve saflaştırılması mümkün olmuştur yetişkin iskelet kası ve beyaz yağ 14 dahil olmak üzere birden insan dokuları.

Çeşitli kalp dışı dokularda perivasküler hücre popülasyonlarının kök / progenitör hücre özelliklerini bir olması gösterilmiştirnd kardiyovasküler ortamda klinik kullanım için araştırılmaktadır. Perisitler, en iyi bilinen perivasküler hücre alt biri, yeni damarların 15 gelişiminde dahil olmak üzere birçok patofizyolojik roller oynayabilir heterojen nüfus vardır, kan basıncı 16, ve damar bütünlüğü 17,18 bakım düzenlenmesi. Çoklu dokularda gösterildiği gibi, perisitlerin spesifik alt özgün MSC antijenleri ifade ve FACS saflaştırma 14 sonra birincil kültürdeki MSC benzeri fenotipleri sürdürmek. Ayrıca, bu hücreler, kararlı bir şekilde kültür içinde uzun vadeli fenotipleri korumak ve MSC 19,20 benzer çok-dizi farklılaşma potansiyel sergilerler. Bu sonuçlar perisitler zor MSC 14 kökeni biri olduğunu düşündürmektedir. perisitlerin terapötik potansiyeli, miyokardiyal yara bir azalma ile gösterilmiş ve işemik yaralı transplantasyon ardından kalp fonksiyonunun geliştirilmiştirkalpleri 21. Son zamanlarda, başarılı insan miyokartdan perisitleri saflaştırılmış ve iskelet Miyogenesis 3 yokluğu ile onların MSC gibi fenotipleri ve multipotency (adipogenesis kondrogenezis ve osteogenezis) gösterdi. Buna ek olarak, miyokard perisitler diğer organlarda arınmış meslektaşları ile karşılaştırıldığında farklı cardiomyogenic potansiyeli ve anjiyogenik kapasitelerini sergiledi.

Multipotent perivasküler kök / progenitör hücrelerin, adventisyal hücrenin ikinci bir nüfus, pozitif CD34 ifade 22 temelinde insan safen damarlar izole edilmiştir. Venöz adventisya hücrelerinin klonojenik potansiyel mezodermal farklılaşma kapasitesi ve in vitro proanjiyojenik potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Farelerin işemik yaralı kalplerine bu hücrelerin nakli geçiş fibrozu bir azalma, anjiyojenez ve miyokardiyal kan akışında bir artış, azalan ventriküler dil ile sonuçlanmıştıration ve artmış kardiyak ejeksiyon fraksiyonu 23. İlginç bir şekilde, adipoz adventisya hücrelerinin stimülasyon 24 ile perisit fenotip kabul öne CD34 ekspresyonunu vermek ve Anjiyopoietin II tedaviye yanıt olarak kültür CD146 ekspresyonunu yukarı regüle ettiği gösterilmiştir. kalp içinde, ancak, adventisya hücre popülasyonu arasından ileriye FACS ve / veya iyi karakterize ile saflaştırılmıştır edilmemiştir. Aşağıdaki bölümlerde açıklanan hücre izolasyon prosedürleri kullanarak, şu anda miyokard adventisyal hücreler karakterize ve rejeneratif uygulamalar için kendi potansiyelini araştırıyor.

Bu yazıda izole ve insan fetal veya yetişkin miyokartdan perivasküler kök / progenitör hücrelerin iki alt popülasyonlar arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu prospektif hücre izolasyon yöntemi karşılaştırmalı çalışmalar ve furthe için insan kalbi biyopsilerinden izogenik perivasküler kök / progenitör hücre alt grupları elde etmek için araştırmacılar sağlayacakr çeşitli kardiyak patolojik durumlarda terapötik potansiyelini keşfetmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İnsan Kardiyak 1. Numunenin işlenmesi

  1. tüm sıvılar, konteynırlar, aletler ve özel operasyon alanı steril olduğundan emin olun.
  2. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve buz üzerinde% 1 penisilin-streptomisin (P / S) ihtiva eden soğutulmuş bir Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) oluşan bir depolama ortamında (doku banka ya da cerrahi tarafından temin edilir), kardiyak doku numunesi yerleştirin ulaşım 3 için.
  3. depolama aracından kalp örnek çıkarın ve% 2 FBS ve% 1 P / S ile takviye edilmiş fosfat tamponlu tuz (PBS) oluşan bir yıkama ortamı ile yıkayın. örnek tutarken, büyük damarları ya da perikard kavramak ve miyokard kırma aza indirmek için ince uçlu forseps kullanabilir.
  4. Bir petri yıkama ortamı içinde örnek daldırın ve 3 açıklandığı gibi sterilize edilir, iris makasları ve ince uçlu forseps ile perikard, endokardı ve büyük kan damarları çıkarın.
  5. Kalan myoca CutBir tek taraflı jilet veya keskin iris makas kullanarak yaklaşık 1 mm 3 küçük parçalar halinde rdium. Not: Örnekler hemen işleme durumunda yüksek hücre verimler elde edilir. Bir gecikme kaçınılmaz ise taze depolama ortamında işlenen kardiyak doku, depolama (> 1 cm3 doku başına 5 mi) kadar 72 saat boyunca 4 ° C 'de, ancak, muhtemelen hücre verimi ilişkili bir düşüş mümkündür.

Hücre Doku ve İzolasyonu 2. Sindirim

  1. Taze 1.5 mi ihtiva eden sindirim çözelti hazırlayın kolajenaz her birinden, bir su banyosu içinde 37 ° C'ye ısınmaya (0.5 mg / DMEM ml'de tümü) kolajenaz II ve kolajenaz, IV.
    Not: Ses ve kollajenazlar konsantrasyonu yaklaşık 1 cm3 numuneler için uygundur.
  2. 100 mikron süzgeç vasıtasıyla asılı doku parçaları Filtre ve PBS ile iki kez yıkayın. steril 30 ml konteyner ile doku parçaları aktarınsıkıca kapatılmış kapak.
    Not: Kısa geniş tencere ziyade uzun dar tüpler daha iyi sonuç verir. Seçenek olarak ise, steril bir 50 ml tüp içinde doku parçaları koyun ve 30 mi kabı kullanılabilir durumda değilse, yatay olarak yer.
  3. hepsi sindirim çözümleri (4.5 mi toplam) ilave edin ve 120 rpm'ye ayarlanmış 37 ° C sıcaklıkta çalkalanarak su banyosu içinde kapalı bir plastik torba içinde kap yerleştirmek. Alternatif olarak, 120 rpm ayarlanmış ısıtılmış orbital çalkalayıcı parafin film ve yer ile kaba kaynatma.
  4. 15 dakika sonra çıkarın ve 15 dakika daha değiştirmeden önce tencerede üç kez ters çevirin. Çıkarın ve% 20 FBS ve% 1 P / S ile takviye edilmiş DMEM, 5 ml kolajenazları söndürün.
  5. yavaşça herhangi bir doku kümeleri kırmak için 10 ml serolojik pipet 1020 kez pipetleme özetini çiğnemek. sindirilmemiş malzemeleri çıkarın ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için, 100 um ile 70 mikron ve nihayet 40 mikron hücre süzgeçler süspansiyon sırayla Filtre.
    Not:enzim sindirimi işlemiyle debrisgenerated hücreyi önlemek için hücre süzgeçler arasında durulama yapmayın.
  6. Santrifüj, 4 dakika boyunca 200 xg'de hücre süspansiyonu, dikkatli bir şekilde süpernatant süzün ve Yıkama ortamının 4 ml ile sulandırıldı, oda sıcaklığında 2 dakika süreyle tampon yokedici kırmızı hücre 1 ml pelet yeniden askıya.
  7. santrifüj adımı yineleyin ve yıkama orta 1 ml pelet yeniden askıya. İyice karıştırın ve hücre sayımı için hücre süspansiyonu 10 ul alır.
  8. Tripan mavi rengin 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın ve hücre sayımı için standart bir hemasitometre karışımı 10 ul koyun. Köşe kare başına ortalama elde etmek için 4 ile dört köşe kareler mevcut parlak, yuvarlak hücre sayısını (her on altı küçük kareler bölünmüştür) ve bölme güvenin. Leke seyreltme faktörü hesaba 2 ile ortalama çarpma ve daha sonra 10 4 numunenin 1 ml başına hücre sayısını elde etmek için tarafından.

  1. Hücre süspansiyonuna fare serumu 50 ul ilave edin ve 20 dakika spesifik olmayan bağlanma antikorun bloke etmek için 4 ° C'de inkübe edin.
  2. Santrifüj, 4 dakika boyunca 200 x g'de fare serumu ile hücre süspansiyonu, süpernatant kaldırmak ve 100 ul başına 1 x 10 6 hücre bir konsantrasyonda yıkama ortamı içinde yeniden askıya.
  3. Kısım iki polistiren yuvarlak dibine 50 ul izotip ve boyanmamış kontroller için hücre süspansiyonu her tüpler daha sonra çok renkli boyama için üçüncü bir tüp içine kalan hacmi yerleştirin akım sitometri.
  4. çok renkli boyama tek bir hücre süspansiyonu: (100 Tüm 1) CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 ve CD146-AF647 antikor ekleyin. izotip kontrolü için, PE, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP Cy5.5- ve AF647-konjuge izotip antikorlarının eş hacimli ekleyin. Yavaşça pipetle hücreler antikorları karıştırın ve 20 boyunca 4 ° C 'de tüm tüpler kuluçkalanmasıKaranlıkta dak.
  5. alt akım sitometri boruları yuvarlak beş polistiren yıkama ortamı 100 ul olumlu boncuk bir damla ekleyerek kompanzasyon kontrolü boncuk hazırlayın. ayrı 5 tüplerin her birine: (100 Tüm 1) CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 ve CD146-AF647 antikor ekleyin. Karanlıkta 20 dakika boyunca 4 ° C 'de tüm tüpler inkübe edin.
  6. İnkübasyon sırasında, hücre toplama tüpleri Endotel Gelişim Ortamı-2, 4 ° C'de (EGM-2) kültür ortamının yeri ve 500 ul her hazırlanması.
  7. Antikor inkübasyondan sonra, bağlanmamış antikorların çıkarılması için hücreler ve boncuklar yıkamak için yıkama ortamı 5 ml ekleyin. Santrifüj 4 dakika boyunca 200 xg'de bütün tüpler. Yıkama ve santrifüj adımı yineleyin. hücrelerin yeniden askıya dikkatle yavaşça süpernatant ve pipet süzün.
  8. 250 ul başına yaklaşık 1 x 10 6 hücre bir konsantrasyonda yıkama ortamı içinde yeniden askıya. Yıkama m 100 ul boncuk yeniden askıyaedium.
  9. karanlıkta buz üzerinde hücre sıralayıcı bütün hücre ve boncuk süspansiyonlar taşıyın. Pozitif boncuk kompanzasyon kontrolü tüpler negatif boncuk 1 damla ekleyin ve floresan tazminat ayarlamak için bu kullanın.
  10. Arka plan floresan kurmak ve aşağıdaki gerilimleri ayarlamak için üreticinin talimatlarına göre boyanmamış kontrol hücreleri çalıştırın: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. üreticinin talimatlarına göre çalıştırılabilir izotipleri kontrol spesifik olmayan bağlanma ile ilgili eşiğe eşik kurmak. (Şekil 1) Çok renkli lekeli örneği çalıştırmak ve toplama tüpleri içine pericyte ve adventisyal hücre popülasyonlarının toplamak.
    NOT: Optimal canlı hücre verimleri perisitlere için toplam canlı hücre ayrışma yaklaşık% 3 ve adventisyal hücreler için% 4'tür.

4. Hücre Kültürü

  1. FACS sıralama sonucuna göre uygun boyut kültür plakaları seçin. Tüm kuyuları büyüme alanının cm2 başına steril% 0.2 jelatin çözeltisi 100 ul ekleyin ve ceket elle çalkalayın. 10 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve tam olarak jelatin solüsyonu çıkarın. kültür plakaları hazırlanıyor iken buz üzerinde toplanan hücreler tutun.
    Not: jelatin kaplı kültür yüzey üzerine 30.000 ile 40.000 hücre / cm2 yoğunluğunda tohumlanır yeni hazırlanmış kriteri perisitler ve adventitial hücreler de büyür.
  2. 4 dakika boyunca 200 x g'de yeni toplanmış hücreler santrifüj ve yavaşça EGM-2.Seed uygun miktarda jelatin kaplı plakalar üzerine hücre, hücre pelet yeniden askıya.
    Not: hücrelerin sayısı kuyu ve EGM-2 eklenecek miktarı başına numaralı seribaşı olan plaka seçiminize bağlıdır. Örneğin, 0.5 ve 1 ml EGM-2, sırasıyla 48- ve 24-kuyucuklu levhalar için oyuk başına ihtiyaç vardır.
  3. Değişim EGM-2 perivasküler hücre büyüme ortamı için (Hücreler (), en az 72 saat sonra, plaka yerleşmiş ve yapıştırılır sonra DMEM iki perisitler ve adventitial hücreleri% 20 FBS ve% 1 P / S) ile takviye edilmiştir. o andan itibaren Ortam her 72 saat değiştirin. C 5% CO2 ve 37 ° C'de, ilk ve sonraki bütün inkübasyonlar yapın.
  4. perisitler ve adventisyal hücreler 80-90% izdiham ulaştığınızda% 0.05 tripsin EDTA kullanılarak hücreleri ayırmak. Kaplanmamış polistiren kültür plakaları üzerine 3: 1 oranında daha sonra da geçiş hücreleri perivasküler hücre büyüme ortamı içinde yeniden askıya almak ve, PBS içinde% 20 FBS, 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile söndürün. Itibaren geçit 2, 1 pasaj hücreleri: 5 oranında (ya da yaklaşık 7.000 hücre / cm2), kaplanmamış polistiren kültür plakaları veya şişelere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tek hücreler ileri ve yan dağılım dağılımları esas alınarak enkaz ve çiftlerin ayırt edilmiştir. Canlı hücreler DAPI boya almak için onların başarısızlığı ile tespit edilmiştir. Ayırıcı stratejisi bu canlı bütün kardiyak hücre ayrılma (Şekil 1) izotip kontrolü etiketleme temelinde seçildi. Canlı hücrelerden, CD45 + hücreler, ilk olarak, üzerinden geçitlendi CD56 + hücreleri eklenmiştir. CD144 + Daha sonra endotel hücreleri CD56 çıkarıldı - fraksiyonu. Bu son nüfus kaynaktan, CD146 + / CD34 - perisitler ve CD146 - / CD34 + adventisya hücreler toplanmış, daha sonra (Şekil 2) seçilmiş ve. Hemen hücre alındıktan sonra, her alt popülasyonun küçük bir örnek (500-1,000 hücreleri) ilk sıralamada kaydedilen olduğunu hücre dağılımı onaylamak için sıralayıcı ile yeniden çalıştırıldı. FACS ile saflaştırılmış miyokardiyal Peric ytes ve adventitial hücreler bir kültür hücre morfolojisi (Şekil 3) stellat bir mil sergiler.

Şekil 1
Şekil 1:. Etiketlenmiş izotip kontrolü FACS Gating Stratejisi Temsilcisi noktalar araziler insan kalp hücrelerinin tür kapılarının konumlandırma göstermektedir ayrışmış .. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Miyokard perivasküler hücreler FACS saflaştırılması tek bir insan miyokard numuneden kardiyak perivasküler prekürsör hücrelerinin iki alt popülasyonlarının Temsilcisi sıralama..es / ftp_upload / 54252 / 54252fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. Kültür perivasküler hücre Morfoloji iki kalp perivasküler öncü hücre popülasyonları, (sağda) perisitler (sol panel) ve adventisyal hücreler = 50 um FACS saflaştırma homojenliği sıralanır ve daha fazla geçiş 3, Ölçek barlarda kültür (genişletilmiş edildi ). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Artan kanıtlar yaralanma sonrası yetişkin insan kalbinin sınırlı rejeneratif kapasitesi destekler. Yaralı kalplerinde böyle rejeneratif yanıtları sorumlu yerli öncü hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ilgili mekanizmalar ve sinyal yollarının anlaşılması ve terapötik bu hücreleri kullanmak için yaklaşımların geliştirilmesi hem de kritik öneme sahiptir.

Önceki protokoller insan iskelet kası 25 den perivasküler öncü hücre alt gruplarının izolasyonu tarif etmişlerdir. Ancak, kardiyak dokulara bu tekniklerin doğrudan uygulama genellikle çok kötü hücre verimleri ile sonuçlanır. Sonuç olarak, insan miyokardiyal biyopsilerinden perivasküler ön-madde hücreleri, yani perisitlerin ve adventitial hücreleri, iki farklı alt-popülasyonunu ettirecek ve her iki alt-eşzamanlı saflaştırılmasını kolaylaştırmak için protokole önemli ayarlamalar yaptık. s, her iki hücre popülasyonlarının izole edilmesiame örnek sadece değerli kardiyak doku biyopsi kullanımını optimize değil, aynı zamanda farklı perivasküler hücre alt direkt karşılaştırılmasını sağlar.

hücrelerin maksimum verim elde etmek için, doku numunesinin tazelik kritik bir önem taşımaktadır. perisitlerden ve adventisyal hücreler için maksimum canlı hücre verimleri yaklaşık% 3 ve sırasıyla toplam canlı hücre ayrışma% 4'tür. Verim alt küme başına yaklaşık 30,000 400,000 hücrelerden büyük ölçüde değişebilir ve miktarı ve başlangıç ​​doku kalitesinin ve koruma süresi de dahil olmak üzere bir dizi faktöre, oldukça bağımlıdır olabilir. Perivasküler hücreler nispeten hassas olan; otolitik değişimin kanıtlarını gösteren örnekler kaçınılmaz FACS sonra düşük hücre sayıları verir. Benzer bir şekilde, perivasküler hücreler sert sindirim tekniklerine duyarlıdır ve aşırı sindirim da azaltılmış canlı hücre verimi ile sonuçlanır. sindirim süresi ve ajitasyon hızının özelleştirilmiş ayarlamalar individua tarafından gerekli olabilirl laboratuarları. Son olarak, donör yaşı ve örneklem büyüklüğü de hücre verimleri üzerinde önemli etkileri olacaktır.

Biz yoğun bu şekilde 3'te elde edilen kardiyak perisitleri nitelendirmiştir. Bu hücreler endotel hücre kontaminasyonu ile kültüründe homojenlik gösterdi. pasajlar 3 ile 12 arasında yaklaşık 60 saat süreleri iki katına Nüfus hem ortak pericyte belirteçlerinin tutarlı ifadesi ile kaydedildi (alkalin fosfataz, NG2 ve α-SMA) ve bu süre içinde klasik MSC belirteçleri (CD44, CD73, CD90 ve CD105). Şaşırtıcı, bu demetilasyon sonra, kardiyak perisitlere bir kısmını cardiomyogenic transkripsiyon dile getirdi Nkx2.5 ve GATA4 faktörleri tespit edilmiştir. yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde ile kültürlü işbirliği yaparken, demetilatlanmış kalp perisitlere bir kısmını küçük bir grubu da kendiliğinden sitoplazmik kalsiyum akıları sergileyen sarkomerik protein belirteçlerinin alfa-aktinin ve kardiyak troponin-T, dile getirdi. Birlikte ele alındığında bu bulgular, SuggeKalp perisitlerin bir ICSI'nin nedenle cardiomyogenic potansiyele sahiptir ve st içsel miyokard onarım sürecinde bir rol oynayabilir. perisitlere ile karşılaştırıldığında, kardiyak adventisyal hücreler büyük ölçüde uncharacterized kalır. Bizim yayınlanmamış ön veriler kardiyak adventisyal hücreler kültürde CD34 kaybetme iken, kardiyak perisitlere daha düşük seviyelerde de olsa, böyle DPBFR-p ve NG2 gibi bazı pericyte işaretleri ifade öneririz. Bu hücreler aynı zamanda klasik MSC belirteçleri ifade ve osteojenik ve adipogenic farklılaşma potansiyeli göstermektedir. anjiyogenik ve pro-kardiyojenik özellikler de dahil olmak üzere kardiyak adventisyal hücrelerin ileri çalışmalar devam etmektedir.

Burada açıklanan protokol tek bir insan kalp doku örneğinden kalp perisitlerden ve adventisyal hücreler aynı anda, ileriye dönük arınma sağlar. Bu hücreler, uygun candidat olabileceği potansiyel cardiomyogenic özelliklere sahip yeni kalp öncü hücre popülasyonları temsilGelecekteki hücre tedavileri için es.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film - Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10x) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324, (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33, (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98, (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94, (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81, (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21, (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15, (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35, (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47, (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20, (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31, (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3, (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6, (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51, (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15, (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314, (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67, (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121, (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109, (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21, (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).More

Baily, J. E., Chen, W. C. W., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter