Summary
Abbiamo dimostrato un, trasportabile sistema di formazione doppio strato lipidico memorizzabili. Una membrana a doppio strato lipidico possono essere formate entro 1 ora con tasso di successo superiore all'80% quando un precursore membrana congelato è portato a temperatura ambiente. Questo sistema consentirà di ridurre i processi laboriosi e competenze associate a canali ionici.
Abstract
Un doppio strato lipidico artificiale, o nero dei lipidi di membrana (BLM), è un potente strumento per lo studio dei canali ionici e le interazioni delle proteine, così come per le applicazioni di biosensori. Tuttavia, le tecniche convenzionali di formazione BLM hanno diversi svantaggi e che spesso richiedono competenze specifiche e processi laboriosi. In particolare, BLM convenzionali soffrono di bassi tassi di successo di formazione e tempo di formazione della membrana incoerente. Qui, dimostriamo un sistema di formazione BLM immagazzinabile e trasportabile con il tempo diradamento controllato e una maggiore velocità di formazione BLM sostituendo film convenzionalmente utilizzati (politetrafluoroetilene, poliossimetilene, polistirolo) di polidimetilsilossano (PDMS). In questo esperimento, viene utilizzato un polimero poroso strutturato come PDMS film sottile. Inoltre, al contrario di solventi convenzionalmente impiegati con bassa viscosità, l'uso di squalene consentito un tempo diradamento controllato tramite assorbimento lento solvente PDMS, prolungando la vita della membrana. in annunciocondizione, usando una miscela di squalene e esadecano, il punto di congelamento della soluzione lipidica è aumentata (~ 16 ° C), in aggiunta, precursori di membrana sono stati prodotti che possono essere indefinitamente immagazzinato e trasportato facilmente. Questi precursori di membrana hanno ridotto BLM tempo formazione di <1 ora e ha raggiunto un tasso di formazione BLM del ~ 80%. Inoltre, gli esperimenti dei canali ionici con gramicidina A hanno dimostrato la fattibilità del sistema a membrana.
Introduction
Artificial doppio strato lipidico della membrana, o nero membrana lipidica (BLM), è un importante strumento per chiarire i meccanismi di membrane cellulari e canali ionici, nonché per comprendere le interazioni tra canali ionici e ioni / molecole. 1-7 Sebbene il metodo patch-clamp è spesso considerato il gold standard per gli studi di membrana cellulare, è laborioso e richiede agli operatori altamente qualificati per le misure di canali ionici. 8 Mentre ricostituite artificialmente membrane doppio strato lipidico sono emersi come strumenti alternativi per gli studi dei canali ionici, 9,10 essi sono anche associati con laboriosa processi e competenze specifiche. Inoltre, le membrane sono sensibili alle perturbazioni meccaniche. Applicazioni pratiche Quindi, tecnologie doppio strato lipidico introdotte fino ad oggi hanno limitato. 11
Al fine di migliorare la robustezza e la longevità delle membrane doppio strato lipidico, Costello et al. 12, e Ide e Yanagida
Lo sviluppo di una piattaforma di doppio strato lipidico ha ruotato principalmente attorno aumentare la robustezza e la longevità di BLM. Anche se la longevità di BLM è stata substantially migliorata di recente, le loro applicazioni sono state limitate a causa della mancanza di trasportabilità e conservabilità. Per superare questi problemi, Jeon et al. Ha creato un sistema a membrana immagazzinabile e ha introdotto un precursore di membrana (MP). 16 Per costruire un deputato, hanno preparato una miscela di decano n- e esadecano contenente 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) per controllare il punto di congelamento della soluzione lipidica tale che sarebbe congelare a ~ 14 ° C (sotto della temperatura ambiente, sopra la temperatura tipica frigorifero). In questo esperimento, la MP è stato suddiviso in una piccola apertura su una pellicola di politetrafluoroetilene (PTFE) e successivamente congelati in frigorifero a 4 ° C. Quando la MP è stato portato a temperatura ambiente, la MP scongelato e un doppio strato lipidico automaticamente formato, eliminando le competenze tipicamente associati con formazione della membrana. Tuttavia, il tasso di successo di BLM a base di MP era partire da ~ 27%, e formatio membranan tempo era praticamente inesistente (30 min a 24 ore), limitando le sue applicazioni pratiche.
In questo studio, un polidimetilsilossano (PDMS) a film sottile è usato al posto di un convenzionale film sottili idrofobiche (PTFE, poliossimetilene, polistirolo) a (a) tempo il controllo di produzione e (b) aumentare il tasso di successo della formazione BLM come precedentemente riportato da Ryu et al. 17 Qui, formazione della membrana è stata facilitata mediante estrazione di solventi a causa della natura porosa del PDMS, e il tempo necessario per la formazione della membrana è stata controllata con successo in questo studio. In questo sistema, come la soluzione lipidica è stata assorbita nella pellicola sottile PDMS, è stato raggiunto un tempo di formazione della membrana coerente. Inoltre, durata della membrana è stata prolungata dovuta ad un lento assorbimento dei solventi nei PDMS film sottile, un risultato dell'aggiunta di squalene alla soluzione lipidica. Abbiamo condotto misure ottiche ed elettriche per verificare che le membrane formate utilizzando questa tecnica sono adatti per isu studi canali.
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Protocol
1. Soluzione Preparazione
- Preparazione della soluzione tampone:
- Per formulare soluzione tampone, sciogliere 1 M KCl (cloruro di potassio), 10 mM Tris-HCl (Tris-cloridrato), e 1 mM EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) in acqua distillata e regolare il pH a 8,0.
- Filtrare la soluzione con un filtro di 0.20 micron. Per sterilizzare in autoclave la soluzione a 121 ° C per 15 min.
- Preparazione della soluzione lipidica per la pre-quadro:
- Per formulare la soluzione lipidica per preverniciatura, sciogliere 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) lipidi (w: v) in una miscela di 2: 8 n decano ed esadecano (v: v). Mescolare durante la notte utilizzando un rotatore.
- Preparazione della soluzione lipidica per la formazione della membrana:
- Per formulare la soluzione lipidica per la formazione della membrana, sciogliere 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidilcolina) lipidi (w: v) in una miscela di 2: 8 squalene ed esadecano (v: v). Mescolare durante la notte utilizzando un rotatore.
2. Formazione di un PDMS a film sottile
- Mescolare PDMS e il catalizzatore in un rapporto di 9: 1 (w / w) in una tazza di miscelazione per formare il prepolimero PDMS. Aggiungere 5 g di PDMS prepolimero ad una piastra di Petri per formare i PDMS pellicola sottile (spessore 200 - 250 micron). Distribuire PDMS pre-polimero usando una spalmatrice centrifuga a 800 rpm per 10 secondi per formare una pellicola sottile.
- Porre la capsula di Petri in un essiccatore sotto vuoto ad una pressione di 100 mTorr per 2 ore per rimuovere le bolle d'aria. Per polimerizzare il film sottile prepolimero, cuocere in forno per 5 ore a 70 ° C.
- Al fine di rendere un PDMS quadrati a film sottile, tagliare il film sottile PDMS polimerizzati in 2 x 2 cm 2 piazze. Utilizzare un 500 micron micro punzone per fare un'apertura nel centro di PDMS film sottile. Aperture pre-vernice con 3% soluzione DPhPC lipidi mescolati in 2: 8 decano n- e esadecano.
3. Fabrication Camera e Assembly
- Per realizzare la camera di BLM, disegno due blocchi simmetrici della camera utilizzando il software di disegno 3D con dimensioni esterne di 4 cm x 1,5 cm x 1 cm e dimensioni interne pozzetti di 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17.
- Craft la camera utilizzando un blocco di PTFE con una macchina CNC e seguire le istruzioni del produttore.
4. Montaggio Camera
- Per assemblare la camera, posizionare il film sottile preverniciato-PDMS tra i due blocchi PTFE tale che l'apertura sulla PDMS film sottile è allineato con il foro nella camera.
- Sigillare i bordi esterni della camera con un vetro di copertura con grasso (facilitando l'osservazione ottica). Immobilizzare la camera di assemblata utilizzando dadi e bulloni.
NOTA: Assicurarsi che la camera è ben sigillato, in modo che non vi siano perdite di liquido.
5. La formazione di membrana precursore con formazione accellerata di auto-assemblaggio (MPES)
- Usando una pipetta, depositare 0.5ml di 0,1% DPhPC lipidi mescolato 2: 8 n decano: esadecano sulla apertura della PDMS film sottile assemblato con la camera.
- Prima dell'uso, conservare la camera in un congelatore o frigorifero di sotto 10 ° C.
6. formazione della membrana e di verifica
- Per formare una BLM con MPES, prelevare la camera dal frigorifero e sospendere 2 ml di soluzione tampone in ciascun lato della camera. Impostare la camera da parte per <10 minuti fino a quando il precursore di membrana congelato si scioglie.
- Posizionare la camera su un micromanipolatore per controllare con precisione l'elevazione rispetto alla sorgente luminosa e il microscopio. Illuminare un lato della camera di come fonte di luce con un alogeno a fibre ottiche illuminatore per illuminare l'apertura dei PDMS a film sottile per l'osservazione ottica del processo di formazione BLM.
- D'altro lato, collocare un microscopio digitale verticalmente rispetto alla sorgente di luce per osservare la formazione BLM (ingrandimento da 200X).
- Per confermare la formazione BLM, osservare il centro dell'apertura dove il colore diventa più luminoso del annulus.
7. registrazione elettrica
- Per la misurazione elettrica, preparare elettrodi Ag / Cl con un filo d'argento 208 micron di spessore e candeggina in ipoclorito di sodio per> 1 min. Posizionare gli elettrodi Ag / Cl in ogni lato della camera abbastanza profonda da essere immersa nella soluzione tampone.
- Collegare gli elettrodi all'amplificatore microelettrodo. Utilizzando il software elettrofisiologia, applicare una forma d'onda triangolare mV ± 10 attraverso la membrana di acquisire un'onda quadra. Impostare l'applicazione di tensione facendo clic sulle frecce indicate su V_clamp (mV).
- Registrare le proprietà elettriche della membrana facendo clic sul pulsante di registrazione (icona rossa dot). Procedere con la registrazione fino a quando si osserva un'onda quadra uniforme. Uscire la registrazione facendo clic sull'icona quadrato nero.
8. Ion Canale incorporazione
NONE: Gramicidin A (GA) l'incorporazione avviene spontaneamente sulla formazione di BLM, come si aggiunge GA direttamente alla soluzione dei lipidi.
- Per osservare le attività di canale ga, applicare 100 mV attraverso la membrana ad una frequenza di campionamento di 5 kHz per misurare il potenziale della membrana tenuta. Impostare l'applicazione di tensione facendo clic sulle frecce indicate su V_clamp (mV).
- Registrare le proprietà elettriche del costituzione gA facendo clic sul pulsante di registrazione (icona rossa dot). Proseguire la registrazione fino a quando si osserva salti di corrente. Uscire la registrazione facendo clic sull'icona quadrato nero.
- Dopo l'acquisizione dei dati elettrici, filtrare i dati con un filtro passa-basso Bessel a 100 Hz utilizzando un software di elettrofisiologia.
- Osservare i salti di corrente nella tenuta dei dati potenziali filtrata (ogni salto corrente, ~ 0,15 ns, rappresenta dimerizzazione di un canale ionico GA) per verificare gA incorporazione.
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Representative Results
Ottimizzazione di MPES Soluzione Composizione
Diverse composizioni di lipidi e solventi sono stati testati con successo per ricostituire le membrane doppio strato lipidico da MPES. Il sistema MP con una miscela di decano n- ed esadecano contenente 3% DPhPC 14 mostrato un basso tasso di successo di formazione della membrana (~ 27%). Inoltre, il film PDMS estratta continuamente soluzione lipidica, era necessario ottimizzare composizione del solvente per mantenere una membrana doppio strato lipidico intatta. Pertanto, squalene, che ha una viscosità di 12 cP a 20 ° C 18 è stato usato al posto di decano n-, che ha una viscosità di 0,92 cP a 20 ° C. 19 Quando è stato usato squalene, sia la stabilità e la longevità aumentata a causa di un tasso ridotto di assorbimento solvente PDMS. tabella 1 confronta il tempo di diradamento, durata, e la percentuale di successo delle membrane con diverse composizioni di solventi.
Quando è stata utilizzata decano n-, formazione della membrana era incoerente e membrane frequentemente rotto in un breve periodo di tempo, a causa di rapido assorbimento del solvente mediante PDMS film sottili. D'altra parte, quando è stato usato squalene, tempo di rottura della membrana è stata ritardata. Inoltre, il tempo di formazione della membrana diventa più consistente, tasso di successo di formazione di membrane migliorata, e la longevità delle membrane aumentato.
Formazione della membrana da membrana precursore (MP)
Un MP è la forma congelata di soluzione lipidica che diventa prontamente utilizzabili allo scongelamento a temperatura ambiente. La soluzione lipidica contenente una miscela di decano n- ed esadecano in una piccola apertura in una pellicola sottile PDMS congela sotto i 16 ° C, ed è indefinitamente immagazzinabile e trasportabile in forma congelata. La Figura 1 illustra il montaggio di un film sottile PDMS con PTFE Chamber per la produzione di un parlamentare. Prima dell'uso, la camera di PTFE è stato ritirato dal frigorifero per formazione della membrana. Qui, i PDMS film sottile che contiene la soluzione lipidica congelato è stato collocato tra le due metà di camere in PTFE. Quando soluzione tampone è stato successivamente aggiunto alla entrambi i lati della camera a temperatura ambiente, la membrana lipidica a due strati costituito spontaneamente allo scongelamento del precursore membrana congelati (MP).
Dopo lo scongelamento, la soluzione lipidica diluito come descritto nella Figura 2. Quando il precursore di membrana congelati scongelati, due monostrati lungo le interfacce tra tampone e soluzione lipidi sono stati portati a contatto. 20 Dopo la formazione della membrana, monomeri ga che sono stati pre-miscelato in lipidi soluzione ha mostrato attività di canale.
L'osservazione ottica delle membrane
Al fine di verificare otticamente formazione della membrana, abbiamoluce trasmessa utilizzato per visualizzare la membrana. Dopo formazione della membrana, la membrana è apparso più luminoso le frazioni a causa del processo di assottigliamento-out, e il centro dell'apertura (la posizione di formazione della membrana) era più luminosa dell'annulus. Figura 3 mostra formazione della membrana osservata tramite microscopia digitale. La membrana assottigliato-out con successo su di scongelamento.
Misurazione elettrica di un doppio strato lipidico
Abbiamo misurato le correnti elettriche attraverso la membrana utilizzando un amplificatore per calcolare spessore della membrana. elettrodi Ag / AgCl sono stati sommersi in entrambe le camere per la misura elettrica. Quando 10 mV picco-picco dell'onda triangolare è stato applicato attraverso la membrana, l'onda triangolare è stato convertito in un'onda quadra di corrente dovuta alla caratteristica della membrana lipidica a due strati (che agisce come un condensatore). 21 Come risultato, siamo stati in grado di stimare lo spessore della membranautilizzando la seguente equazione:
dove I (t) rappresenta la corrente elettrica e C rappresenta capacitanza attraverso la membrana. V rappresenta la tensione applicata picco-picco (20 mV per 0.0625 sec). Qui, C può essere espresso con la permittività di spazio libero (8.85 x 10 12 F / m 2), la costante dielettrica dei lipidi (2,1), 22 A, l'area della membrana (~ 1,29 x 10 -7 m 2), d, lo spessore del doppio strato. Con i dati ottici in figura 3 e dati elettrici, abbiamo calcolato lo spessore della membrana di essere ~ 4 nm. Inoltre, la membrana ricostituito soddisfatto un livello guarnizione giga ohm (> 1 G), che in genere è richiesto per gli studi canali ionici. 23
Ion Canale Attività di Gramicidin A (GA)
Per verificare la fattibilità del controllo dei canali ionici con il doppio strato lipidico formato dal MP, abbiamo incorporato Ga, uno dei canali ionici più frequentemente utilizzati per la verifica la formazione della membrana. Gramicidina A incorpora nella membrana come due subunità distinte che in seguito dimerize. 7 Ion forma canali su dimerizzazione di Ga, e gli ioni permeare attraverso il canale ionico GA. La figura 4 illustra l'incorporazione e la dimerizzazione di GA. Su gA dimerizzazione, GA livelli di conduttanza del canale erano 28 pS, in linea con i risultati di precedenti relazioni. 3
| concentrazione di lipidi | Solvente | Diradamento (min) | Durata (min) | Tasso di successo |
| 0,1% | 2: 8 squalene: esadecano | 50,6 (± 30,9) | 52,4 (± 30,9) | 77,8% |
| 0,1% | 2: 8 n decano: esadecano | 13.2 (± 12.3) | 10.8 (± 7.8) | 75,2% |
| 1% | 2: 8 n decano: esadecano | 15.8 (± 8.8) | 26,2 (± 25,3) | 69,3% |
| 1% | 2: 8 n decano: esadecano | 13,8 (± 13,3) | 23,6 (± 30,1) | 55,6% |
| 1% | 2: 8 n decano: esadecano | 13,6 (± 10,3) | 8.9 (± 3.0) | 50,0% |
Tabella 1. Ottimizzazione della composizione della soluzione MPES. 0,5 ml di soluzione di lipidi è stato sospeso su un'apertura film sottile PDMS (500 micron di diametro). Qui, abbiamo variato la concentrazione di lipidi, la composizione di solvente, e pre-verniciatura. 17. Adattato con il permesso di Ryu, H. et al. 7
Figura 1. Schema del sistema di formazione della membrana. La dimensione esterna di ogni metà della camera era di 4 cm x 1,5 cm x 1 cm, e la dimensione del pozzo interno era di 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm. Il pozzo interno era abbastanza grande da ospitare 2 ml di soluzione tampone. Su ogni blocco di PTFE c'erano dei buchi di avere la sottile pellicola contatto PDMS con soluzione tampone. L'altro lato è stato sigillato con un vetro di copertura per l'osservazione ottica di BLM. Infine, i blocchi da camera sono state rinforzate con bulloni e dadi per evitare perdite di liquido.4258 / 54258fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema di congelato membrana Precursore con accellerata di auto-assemblaggio (MPES) formazione. Soluzione dei lipidi sui PDMS apertura a film sottile possono essere congelati per un periodo indefinito. Quando il precursore della membrana congelato è stato portato in temperatura ambiente per scongelare, la formazione di doppio strato lipidico è facilitata grazie all'estrazione di solvente idrofobico nelle PDMS a film sottile. Come monomeri GA sono stati aggiunti direttamente nella soluzione di lipidi, GA canali ionici formate subito dopo la formazione della membrana. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Schema microscopica del processo di assottigliamento-out. Dopo lo scongelamento di MPES e conseguente assorbimento di solventi idrofobi, il processo di diradamento stata facilitata sull'apertura dei PDMS film sottile, e la membrana è stata formata entro due minuti dopo scongelamento. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Misure elettriche al momento della costituzione della gramicidina A. corrente salta su è mostrato costituzione e dimerizzazione GA nella membrana. Un'ampiezza di ~ 28 pS è stato osservato dopo dimerizzazione di monomeri GA (100 mV tenendo potenziale; 100 Hz Bessel filtro passa-basso).rget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
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