Summary
我们展示了一个可存储，运输的脂质双分子层形成系统。的脂质双层膜可以在1小时内超过80％的成功率，当冷冻膜前体达到环境温度下形成。该系统将减少与离子通道相关的繁琐流程和专业知识。
Abstract
人工脂质双层，或黑脂质膜（BLM）是用于研究离子通道和蛋白质的相互作用，以及用于生物传感器的应用的有力工具。然而，传统的BLM形成技术具有若干缺点，它们经常需要特定的专门技术和费力的过程。特别是，传统的类脂膜从低形成的成功率和不一致的膜形成时间受到影响。在这里，我们通过替换传统使用的薄膜（聚四氟乙烯，聚甲醛，聚苯乙烯），聚二甲基硅氧烷（PDMS）展示与控制稀疏的时间和提高BLM形成率可存储和运输的BLM形成系统。在这个实验中，使用如PDMS薄膜的多孔构造的聚合物。此外，相对于具有低粘度的常规使用的溶剂，使用角鲨烯的通过溶剂吸收慢允许受控稀疏时间由PDMS，延长膜的寿命。在广告DITION，通过使用角鲨烯和十六烷的混合物中，脂质溶液的凝固点增加（〜16℃），此外，膜前驱体被生产，可以无限期储存和容易运输。这些膜的前体具有降低<1小时的BLM形成时间和达到〜80％BLM形成率。此外，与短杆菌肽A离子通道的实验证实了膜系统的可行性。
Introduction
人工脂质双层膜，或者黑脂质膜（BLM），为阐明细胞膜和离子通道，机制以及对于理解离子通道和离子/分子之间的相互作用的一个重要工具。1-7虽然膜片钳方法通常被认为是对细胞膜的研究的金标准，它是费力的并且需要对离子通道测量高度熟练的操作人员。8虽然人工重组的脂质双层膜已成为对离子通道的研究替代工具，9,10-它们也与费力相关联流程和具体的专业知识。此外，膜是易受机械扰动。因此，引入到日期脂质双层技术具有有限的实际应用。11
为了增强脂质双层膜，Costello 等人 12，和IDE和柳田的稳健性和寿命
脂质双分子层平台的开发越来越周围的鲁棒性和类脂膜的寿命已初步旋转。虽然类脂膜的寿命一直是苏最近bstantially提高，其应用被限制由于缺乏输送和耐贮性的。为了克服这些问题，全度妍等人创建了一个可存储的膜系统，并推出了隔膜前体（MP）。16要构建MP，他们准备正癸烷和十六烷的含有3％DPhPC（1,2-diphytanoyl-混合SN -glycero -3-磷脂酰胆碱）来控制脂质溶液，使得其将在〜14℃（室温以下，上述典型的冰箱温度）冻结的冰点。在该实验中，在MP被分布在一个小的孔上的聚四氟乙烯（PTFE）膜，并随后在4℃的冰箱中冷冻。当MP被带到室温，在MP解冻和脂质双层中自动形成的，消除了通常与膜形成相关的专门知识。然而，从MP制成BLM的成功率较低，为〜27％，和膜formation个时间不一致（30分钟至24小时），限制了其实际应用。
在这项研究中，如先前通过柳报道聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜来代替传统的疏水性薄膜（聚四氟乙烯，聚甲醛，聚苯乙烯）至（a）控制制造时间和（b）增加BLM形成的成功率等 17在这里，膜的形成是通过溶剂萃取，由于PDMS的多孔性容易，并且对于膜形成所需的时间在本研究中被成功控制。在这个系统中，作为脂质溶液吸收到的PDMS薄膜，一致的膜形成时间达到了。此外，膜的寿命延长，由于溶剂的缓慢吸收进入的PDMS薄膜，相加角鲨烯的到脂质溶液的结果。我们进行了光学和电学测量，以验证使用这种技术形成的膜是合适的对于i对渠道的研究。
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Protocol
1.溶液的制备
- 缓冲溶液的制备：
- 配制缓冲液中，溶解的1M的KCl（氯化钾）的10mM的Tris-HCl液（Tris-盐酸盐），和1mM EDTA（乙二胺四乙酸）在蒸馏水和调节pH值至8.0。
- 过滤器采用0.20微米的过滤器解决方案。灭菌，高压灭菌，在121℃下的溶液15分钟。
- 对于预涂装脂溶液的制备：
- 制定用于预喷漆的脂质溶液，溶解3％DPhPC（1,2- diphytanoyl- SN -glycero -3-磷脂酰胆碱）的脂质（重量：ⅴ）在2以下的混合物：8 N -癸烷和十六烷（ν： v）中。隔夜搅拌用旋转器。
- 的用于膜形成的脂质溶液的制备：
- 配制制膜的脂质溶液，溶解0.1％DPhPC（1,2-diphytanoyl- SN -glycero -3-磷脂酰胆碱）的脂质（重量：v）的以2:1的混合物：8平方ualene和十六烷（体积：体积）。隔夜搅拌用旋转器。
2.将PDMS薄膜的形成
- 在一个混合杯1（重量/重量）的比例，以形成与PDMS的预聚物：混合的PDMS和固化剂在一个9。 5克PDMS的预聚物添加到培养皿，以形成的PDMS薄膜（厚度200 - 250微米）。使用以800rpm旋涂10秒，以形成一种薄膜传播的PDMS预聚合物。
- 放置培养皿放入真空干燥器在100毫托的压力下2小时以去除气泡。以在70℃聚合的预聚物薄膜，烘烤在烘箱中5小时。
- 为了使一个正方形的PDMS薄膜，切聚合的PDMS薄膜成2×2 平方厘米的正方形。使用500微米的微冲，使一个孔中的PDMS薄膜的中心。预涂料孔与2混合3％DPhPC脂质溶液：8 正-癸烷和十六烷。
3.商会制作和奥丝mbly
- 来制造BLM室中，使用3D绘图软件用4厘米×1.5厘米×1cm到为1.5厘米×1.3厘米×0.8厘米17内孔的尺寸外尺寸的腔室的设计中有两个对称的块。
- 工艺采用PTFE块以数控机床室，并按照制造商的说明。
4.商会大会
- 为了组装腔室中，放置两种PTFE块之间的彩涂-PDMS薄膜使得在PDMS薄膜的孔与在腔室中的孔对准。
- 密封采用油脂的盖玻璃（促进光学观察）的腔室的外边缘。固定用螺母和螺栓装配腔室。
注意：确保该室是良好的密封，从而不存在液体泄漏。
5.前体膜的形成与加急自组装形成（MPES）
- 用吸管，0.5存8 N -癸烷：：0.1％DPhPC脂质在2混合微升十六烷到的PDMS薄膜与室组装的孔。
- 在使用之前，该腔室储存在冷冻或低于10℃的冰箱中。
6.膜形成和验证
- 以形成具有MPES一个BLM，从冰箱退出腔室和暂停将2ml缓冲溶液在腔室中的每一侧。抛开该室<10分钟，直到冻膜前体解冻。
- 腔室放置到一个显微以相对于所述光源和显微镜精确控制的高度。照亮腔室的一侧使用卤素光纤照明器照亮的PDMS薄膜为BLM形成工艺的光学观察的孔径的光源。
- 在另一边，垂直放置的数字显微镜相对于所述光源观察BLM形成（由20放大0X）。
- 以确认BLM的形成，观察其中颜色变得比环形亮的孔的中心。
7.电气录音
- 电气测量，准备用次氯酸钠一个208微米厚的银线和漂白剂> 1分钟银/氯电极。银/氯电极置于所述室足够深的每一侧被浸入缓冲溶液。
- 电极连接到微电极的放大器。使用电生理学软件，应用±10毫伏三角波形穿过膜以获得一个方波。设置通过点击V_clamp（毫伏）指示的箭头施加电压。
- 通过点击记录按钮（红点图标）记录膜的电性能。直到形成均匀的方波观察记录继续。通过单击黑色方形图标退出录音。
8.离子通道掺入
不E：短杆菌肽A（GA）自发成立后，发生形成BLM，因为GA直接添加到脂质的解决方案。
- 观察GA信道活动，以5千赫兹的采样速率穿过膜应用100毫伏测量保持该膜的电位。设置通过点击V_clamp（毫伏）指示的箭头施加电压。
- 通过点击录音键（红点图标）记录纳入GA的电气性能。直到电流跳观察进行录音。通过单击黑色方形图标退出录音。
- 电数据采集后，用低通贝塞尔滤波器在100赫兹使用电生理学软件过滤数据。
- 观察当前的跳跃在过滤控股潜在的数据（每个电流跳，0.15〜NS，代表GA离子通道的二聚化）来验证GA结合。
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Representative Results
MPES解决结构优化
脂质和溶剂的不同组合物进行测试，以从MPES成功重组脂质双层膜。在MP系统用正癸烷和十六烷含3％DPhPC 14的混合物表现出的膜形成（〜27％）的低成功率。另外，作为与PDMS膜连续地抽出脂质溶液，有必要优化溶剂组合物以维持完整的脂质双层膜。因此，角鲨烯，其在20℃具有12厘泊的粘度-C 18代替正-癸烷，其具有在20℃。19 0.92，粘度当使用角鲨烯，稳定性和寿命由于增加至通过PDMS溶剂吸收的减少率。 表1比较薄化时，寿命和成功使用不同的溶剂组合物膜的速度。
当使用正癸烷，膜形成是不一致和膜的时间很短的时间内频繁破裂，由于由PDMS薄膜的溶剂迅速吸收。另一方面，使用角鲨烯的时候，时间到膜破裂被推迟。此外，膜形成时间变得更一致，制膜提高，寿命的膜的成功率增加了。
从隔膜前体膜组（MP）
一个MP是脂类溶液冷冻形式，成为在室温下解冻容易使用。在一个小光圈含正-癸烷和十六烷的混合物脂质溶液PDMS薄膜低于冻结16℃，并且是在冷冻形式无限期可存储和运输。 图1示出的带的PTFE一个PDMS薄膜组件茶MBER生产的MP。在使用前，将PTFE室从冰箱用于膜形成撤回。此处，含有冷冻的脂质溶液与PDMS薄膜置于聚四氟乙烯室两个半部之间。当缓冲溶液在室温下随后加入到该腔室的两侧，自发地在冷冻隔膜前体（MP）的解冻形成脂双层膜。
解冻时，所述脂质溶液稀疏化如在图2中所描述，当冷冻的隔膜前体解冻，沿缓冲液和脂质溶液之间的界面两个单层被带入接触。20形成膜后，该被预混合GA单体在脂质溶液表明信道的活动。
膜的光学观测
为了验证光学膜的形成，我们使用透射光以可视化的膜。在膜形成，该膜出现比周围由于稀化过程更亮，和孔（膜形成的位置）的中心比环形亮。 图3示出了通过数字显微镜观察膜的形成。膜变薄成功出解冻后。
脂质双层的电测
我们使用放大器来计算膜厚度测量穿过膜电流。的Ag / AgCl电极浸入两院电气测量。当穿过膜施加10毫伏峰对峰的三角波，该三角波被转换为方波的电流由于脂双层膜（作为电容器）的特性。21其结果，我们能够估计所述膜的厚度使用下列公式：
其中I（t）表示的电流，C表示穿过膜电容。 V表示施加的峰 - 峰电压（20毫伏为0.0625秒）。此处，C可以用来表示，自由空间（8.85×10 12 F / M 2），脂质的介电常数（2.1），22 A中，膜的面积（〜1.29×10 -7 M的介电常数2），以及d，双层的厚度。与图3和电数据的光数据，我们计算该膜的厚度为〜4纳米。此外，再溶解后的膜满足的千兆欧姆级密封（> 1GΩ），这是通常需要离子通道的研究。23
短杆菌肽A的离子通道活动（GA）
验证与从MP形成脂质双层离子通道筛选可行性，我们引入GA，来检查膜形成的最常用的离子通道中的一个。短杆菌肽一个合并到膜为两个不同的亚基随后二聚化。在GA的二聚化7离子通道的形式，渗透离子通过GA离子通道。 图4说明掺入和GA的二聚化。经GA二聚体，GA通道电导水平分别为28 PS，与以前的报告结果一致。3
| 脂质浓度 | 溶剂 | 薄化时间（min） | 寿命（分） | 成功率 |
| 0.1％ | 2：8 角鲨烯：十六 | 50.6（±30.9） | 52.4（±30.9） | 77.8％ |
| 0.1％ | 2:8 ñ -癸烷：十六 | 13.2（±12.3） | 10.8（±7.8） | 75.2％ |
| 1％ | 2:8 ñ -癸烷：十六 | 15.8（±8.8） | 26.2（±25.3） | 69.3％ |
| 1％ | 2:8 ñ -癸烷：十六 | 13.8（±13.3） | 23.6（±30.1） | 55.6％ |
| 1％ | 2:8 ñ -癸烷：十六 | 13.6（±10.3） | 8.9（±3.0） | 50.0％ |
表1. MPES溶液组成的优化。 0.5微升的脂质溶液悬浮到的PDMS薄膜孔径（直径500微米）。在这里，我们改变脂质浓度，溶剂组成，和预绘画。17。适于与从柳，H。 等的权限。7
图1. 膜形成系统的示意图。该腔室的每个半部的外部尺寸为4cm×1.5厘米×1厘米，和内孔的尺寸为1.5cm×1.3厘米×0.8厘米。内还有大得足以容纳2毫升缓冲溶液。每个聚四氟乙烯块有孔有一个与缓冲溶液的PDMS薄膜接触。另一侧用一个玻璃盖用于BLM的光学观察密封。最后，腔室块被用螺栓和螺母，以避免液体渗漏加强。4258 / 54258fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2. 冻膜前驱体的示意图上的PDMS薄膜孔径可以冻结无限期加急自组装（MPES）的形成。脂质的解决方案。当将冷冻的膜的前体被带入室温解冻，脂质双层的形成是由于提取的疏水性溶剂的进入的PDMS薄膜容易。 GA的单体在脂液直接添加，经过成膜立即形成GA离子通道。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3.间隔剔除处理的显微图。一旦MPES和疏水溶剂的后续吸收解冻时，间隔剔除处理提供了便利的PDMS薄膜的孔径，解冻后两分钟内，形成该膜。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.在短杆菌肽A.当前掺入电测量跳跃在成立和GA的二聚到膜中。在GA单体的二聚化中观察到〜28 PS的幅度（100毫伏保持电位100赫兹贝塞尔低通滤波器）。rget =“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
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