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Bioengineering

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

Published: July 10, 2016 doi: 10.3791/54258
Automatic Translation
1,3, 1,3, 1,3, 2,3,4, 1,3,4
1Department of Biological Engineering, Inha University, 2Department of Mechanical Engineering, Inha University, 3Biohybrid Systems Research Center (BSRC), Inha University, 4Convergent Research Center for Metabolism and Immunoregulation (CRCMI), Inha University

Summary

Demostramos un sistema almacenable, transportable lípidos formación de bicapa. Una membrana de bicapa lipídica se puede formar dentro de 1 h con tasa de éxito más del 80% cuando un precursor de membrana congelada se llevó a temperatura ambiente. Este sistema reducirá los procesos laboriosos y conocimientos asociados a los canales iónicos.

Abstract

Una bicapa lipídica artificial, o membrana lipídica negro (BLM), es una poderosa herramienta para el estudio de los canales iónicos y la interacción de proteínas, así como para aplicaciones de biosensores. Sin embargo, las técnicas de formación de BLM convencionales tienen varios inconvenientes y que a menudo requieren conocimientos específicos y procesos laboriosos. En particular, BLM convencionales sufren de bajas tasas de éxito de formación y tiempo de formación de la membrana inconsistente. Aquí, se demuestra un sistema de formación de BLM almacenable y transportable con el tiempo de espera adelgazamiento controlado y velocidad de formación de BLM mejorada mediante la sustitución de películas utilizadas convencionalmente (politetrafluoroetileno, polioximetileno, poliestireno) de polidimetilsiloxano (PDMS). En este experimento, se usa un polímero poroso estructurado tal como una película delgada PDMS. Además, a diferencia de los disolventes usados ​​convencionalmente con baja viscosidad, el uso de escualeno permite un tiempo de adelgazamiento de salida controlada por medio de absorción de disolvente lento por PDMS, prolongando la vida de la membrana. En anunciocondición, mediante el uso de una mezcla de escualeno y hexadecano, el punto de la solución de lípidos de congelación se incrementó (~ 16 ° C), además, se produjeron los precursores de membrana que se puede almacenar indefinidamente y fácilmente transportado. Estos precursores de membrana han reducido el tiempo BLM formación de <1 hora y se logró una tasa de formación de BLM de ~ 80%. Por otra parte, los experimentos de los canales iónicos con gramicidina A demostraron la viabilidad del sistema de membranas.

Introduction

Artificial membrana de bicapa lipídica, o membrana lipídica negro (BLM), es una herramienta importante para la aclaración de los mecanismos de las membranas celulares y los canales de iones, así como para la comprensión de las interacciones entre los canales iónicos e iones / moléculas. 1-7 Aunque el método de patch-clamp a menudo se considera el estándar de oro para los estudios de la membrana celular, es laboriosa y requiere operadores altamente calificados para las mediciones de los canales iónicos. 8 Aunque las membranas de bicapa lipídica reconstituidas artificialmente se han convertido en herramientas alternativas para los estudios de los canales iónicos, 9,10 también se asocian con laboriosa procesos y conocimientos específicos. Por otra parte, las membranas son susceptibles a perturbaciones mecánicas. Por lo tanto, las tecnologías de bicapa lipídica introducidas hasta la fecha han limitado las aplicaciones prácticas. 11

Con el fin de mejorar la robustez y la longevidad de las membranas bicapa de lípidos, Costello et al., 12, y Ide y Yanagida et al. 14 ideó una membrana de encapsulado de hidrogel (HEM) con íntimo contacto bicapa lipídica de hidrogel, lo que resulta en una mayor longevidad (hasta varios días). Para aumentar aún más la vida útil de la HEM, Malmstadt y Jeon et al. Crean una membrana de hidrogel encapsulado con la unión de hidrogel de lípidos a través de la conjugación covalente (cgHEM). 15 in-situ En ambos sistemas, tiempos de vida de la membrana aumentaron sustancialmente (> 10 días) . Sin embargo, los sistemas de formación de membrana no fueron lo suficientemente consistentes, y no se pueden guardar o entregados cuando sea necesario para liberar a la experiencia de uso de las bicapas lipídicas.

El desarrollo de una plataforma de bicapa lipídica ha girado principalmente en torno a aumentar la robustez y longevidad de BLM. Aunque la longevidad de BLM ha sido substantially mejorado recientemente, sus aplicaciones han sido limitados debido a la falta de capacidad de almacenamiento y facilidad de transporte. Para superar estos problemas, Jeon et al. Creado un sistema de membrana almacenable e introdujo un precursor de membrana (MP). 16 Para construir una MP, prepararon una mezcla de n-decano y hexadecano que contiene 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glicero-3-fosfatidilcolina) para controlar el punto de la solución de lípidos tal que se congelaría a ~ 14 ° C (por debajo de la temperatura ambiente, superior a la temperatura típica refrigerador) de congelación. En este experimento, la MP se extendió sobre una pequeña abertura en una película de politetrafluoroetileno (PTFE) y, posteriormente, congelado en un refrigerador a 4 ° C. Cuando el MP se llevó a temperatura ambiente, la MP descongela y una bicapa lipídica se formó automáticamente, eliminando la experiencia típicamente asociada con la formación de la membrana. Sin embargo, la tasa de éxito de la BLM a partir del MP fue tan baja como ~ 27%, y la membrana formation tiempo era incompatible (30 min a 24 h), lo que limita sus aplicaciones prácticas.

En este estudio, un polidimetilsiloxano (PDMS) de película fina se utiliza en lugar de un películas convencionales hidrófobos delgadas (PTFE, polioximetileno, poliestireno) a (a) el tiempo de control de fabricación y (b) aumentar la tasa de éxito de la formación de BLM como se informó anteriormente por Ryu et al. 17 en este documento, formación de la membrana fue facilitada por la extracción de disolventes debido a la naturaleza porosa de PDMS, y el tiempo requerido para la formación de membrana se controla con éxito en este estudio. En este sistema, como la solución de lípidos se absorbe en la película delgada PDMS, se consiguió un tiempo de formación de la membrana consistente. Por otra parte, la vida útil de la membrana se prolongó debido a la absorción lenta de disolventes en el PDMS película delgada, como resultado de la adición de escualeno a la solución de lípidos. Hemos llevado a cabo las mediciones ópticas y eléctricas para verificar que las membranas formadas utilizando esta técnica son adecuados para ien estudios de canales.

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Protocol

1. Preparación de la solución

  1. Preparación de solución tampón:
    1. Para formular solución tampón, disolver 1 M KCl (cloruro de potasio), 10 mM Tris-HCl (Tris-hidrocloruro), y EDTA 1 mM (ácido etilendiaminotetraacético) en agua destilada y ajustar el pH a 8,0.
    2. Filtrar la solución usando un filtro de 0,20 micras. Para esterilizar, esterilizar en autoclave la solución a 121 ° C durante 15 min.
  2. Preparación de la solución de lípidos para la pre-pintura:
    1. Para formular la solución de lípidos para la pre-pintura, disolver 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glicero-3-fosfatidilcolina) de lípidos (w: v) en una mezcla de 2: 8 n decano y hexadecano (v: v). Se agita durante la noche utilizando un rotador.
  3. Preparación de la solución de lípidos para la formación de la membrana:
    1. Para formular la solución de lípidos para la formación de la membrana, se disuelven 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glicero-3-fosfatidilcolina) de lípidos (w: v) en una mezcla de 2: 8 cuadradosualene y hexadecano (v: v). Se agita durante la noche utilizando un rotador.

2. Formación de una película delgada de PDMS

  1. Mezclar PDMS y agente de curado en una relación de 9: 1 (w / w) en una taza de mezcla para formar el prepolímero de PDMS. Añadir 5 g de PDMS prepolímero a una placa de Petri para formar los PDMS película delgada (espesor de 200 - 250 micras). Spread PDMS pre-polímero utilizando una recubridora de rotación a 800 rpm durante 10 segundos para formar una película delgada.
  2. Coloque la placa de Petri en un desecador de vacío a una presión de 100 mTorr durante 2 horas para eliminar las burbujas de aire. Polimerizar la película delgada pre-polímero, horneado en un horno durante 5 horas a 70 ° C.
  3. Con el fin de hacer un cuadrado de PDMS capa fina, cortar la película delgada de PDMS polimerizadas en 2 x 2 cm 2 casillas. Use un micro punzón 500 micras para hacer una abertura en el centro de los PDMS película delgada. Aberturas pre-pintura con solución de lípidos DPhPC 3% mezclada en 2: 8 n-decano y hexadecano.

3. Fabricación Cámara y Assembly

  1. Para fabricar la cámara de BLM, diseño de dos bloques simétricos de la cámara utilizando el software de dibujo 3D con dimensiones exteriores de 4 cm x 1,5 cm x 1 cm y dimensiones internas pocillos de 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17.
  2. Las embarcaciones de la cámara usando un bloque de PTFE con una máquina CNC y siga las instrucciones del fabricante.

4. Cámara de la Asamblea

  1. Para montar la cámara, coloque la película delgada pre-pintado-PDMS entre los dos bloques de PTFE de tal manera que la abertura de la película delgada de PDMS está alineado con el orificio en la cámara.
  2. Sellar los bordes exteriores de la cámara usando una cubierta de vidrio con grasa (facilitando la observación óptica). Inmovilizar la cámara montada utilizando tuercas y tornillos.
    NOTA: Asegúrese de que la cámara está bien sellada para que no haya ninguna fuga de líquido.

5. La formación de la membrana precursor con Formación Acelerada autoensamblaje (MPES)

  1. Con una pipeta, depositar 0,5l de 0,1% de lípidos DPhPC mezclado en 2: 8 n decano: hexadecano en la abertura de la película delgada PDMS montado con la cámara.
  2. Antes de usar, almacenar la cámara en un congelador o refrigerador por debajo de 10 ° C.

6. formación de la membrana y Verificación

  1. Para formar una BLM con MPES, retirar de la cámara de la nevera y suspender 2 ml de solución tampón en cada lado de la cámara. Ajuste la cámara de un lado a <10 min hasta que el precursor de las membranas congelado se descongela.
  2. Coloque la cámara en un micromanipulador para controlar con precisión la elevación con respecto a la fuente de luz y el microscopio. Iluminar un lado de la cámara como una fuente de luz usando una luz halógena de fibra óptica para iluminar la abertura del PDMS película delgada para la observación óptica del proceso de formación de la BLM.
  3. En el otro lado, colocar un microscopio digital verticalmente con respecto a la fuente de luz para observar la formación de BLM (magnificar por 200X).
  4. Para confirmar la formación de BLM, observar el centro de la abertura, donde el color se vuelve más brillante que el espacio anular.

7. registro eléctrico

  1. Para la medición eléctrica, preparar electrodos de Ag / Cl utilizando un alambre de plata 208 micras de espesor y lejía en hipoclorito de sodio durante> 1 min. Coloque los electrodos Ag / Cl en cada lado de la cámara lo suficientemente profunda para ser sumergido en la solución tampón.
  2. Conectar los electrodos al amplificador de microelectrodos. El uso de software de electrofisiología, aplicar una forma de onda triangular mV ± 10 a través de la membrana para adquirir una onda cuadrada. Establecer la aplicación de tensión haciendo clic en las flechas indicadas en V_clamp (mV).
  3. Registrar las propiedades eléctricas de la membrana haciendo clic en el botón de grabación (punto rojo icono). Proceder con la grabación hasta que se observa una onda cuadrada uniforme. Salir de la grabación haciendo clic en el icono cuadrado negro.

8. Incorporación un canal iónico

NOE: gramicidina A (gA) la incorporación se produce espontáneamente tras la formación de la BLM, como se añade gA directamente a la solución de lípidos.

  1. Para observar las actividades del canal gA, aplique 100 mV a través de la membrana a una velocidad de muestreo de 5 kHz para medir el potencial de la membrana que sostiene. Establecer la aplicación de tensión haciendo clic en las flechas indicadas en V_clamp (mV).
  2. Registrar las propiedades eléctricas de la incorporación gA haciendo clic en el botón de grabación (punto rojo icono). Proceder de la grabación hasta que se observa saltos de corriente. Salir de la grabación haciendo clic en el icono cuadrado negro.
  3. Después de la adquisición de datos eléctricos, filtrar los datos con un filtro de paso bajo de Bessel a 100 Hz usando un software de electrofisiología.
  4. Observar saltos de corriente en la celebración de los datos potenciales filtrada (cada salto de corriente, ~ 0,15 nS, representa la dimerización de un canal iónico GA) para verificar gA incorporación.

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Representative Results

Optimización de Solución MPES Composición
Diferentes composiciones de lípidos y disolventes se ensayaron para reconstituir con éxito membranas de bicapa lipídica de MPES. El sistema MP con una mezcla de n-decano y hexadecano que contiene 3% DPhPC 14 exhibió una baja tasa de éxito de la formación de la membrana (~ 27%). Además, como la película de PDMS se extrae continuamente solución de lípidos, era necesario para optimizar la composición del disolvente para mantener una membrana de bicapa lipídica intacto. Por lo tanto, el escualeno, que tiene una viscosidad de 12 cP a 20 ° C 18 se utilizó en lugar de n-decano, que tiene una viscosidad de 0,92 cP a 20 ° C. 19 Cuando se utilizó escualeno, tanto la estabilidad y la longevidad aumenta debido a una disminuida tasa de absorción de disolvente por PDMS. la Tabla 1 compara el tiempo de adelgazamiento de salida, tiempo de vida, y la tasa de éxito de las membranas con diferentes composiciones de disolvente.

Cuando se utilizó decano n-, formación de la membrana era inconsistente y la rotura de membranas con frecuencia dentro de un corto período de tiempo, debido a la rápida absorción de disolvente por PDMS películas delgadas. Por otra parte, cuando se utilizó escualeno, se retrasó el momento de rotura de la membrana. Además, el tiempo de formación de la membrana se volvió más consistente, tasa de éxito de la formación de membrana mejorado, y la longevidad de las membranas aumenta.

La formación de la membrana precursora de membrana (MP)
Un MP es la forma congelada de solución de lípidos que se convierte fácilmente utilizable después de la descongelación a temperatura ambiente. La solución de lípidos que contiene una mezcla de n-decano y hexadecano en una pequeña abertura en una película delgada de PDMS se congela por debajo de 16 ° C, y es por tiempo indefinido almacenable y transportable en forma congelada. La figura 1 ilustra el montaje de una película delgada de PDMS con un PTFE chamber para producir un MP. Antes del uso, la cámara de PTFE fue retirado de la nevera para la formación de membrana. En este documento, se colocó el PDMS película delgada que contiene la solución de lípidos congelado entre dos mitades de cámaras de PTFE. Cuando la solución tampón se añade posteriormente a los dos lados de la cámara a temperatura ambiente, la membrana de bicapa lipídica forma espontáneamente después de la descongelación del precursor de membrana congelada (MP).

Tras la descongelación, la solución de lípidos se diluían como se describe en la Figura 2. Cuando el precursor de membrana congelada se descongeló, dos monocapas a lo largo de las interfaces entre tampón y solución de lípidos se pusieron en contacto. 20 Después de la formación de la membrana, monómeros gA que eran pre-mezclado en el lípido disolución mostró actividades del canal.

Observación óptica de las membranas
Con el fin de verificar ópticamente formación de la membrana, sela luz transmitida se utiliza para visualizar la membrana. Tras la formación de la membrana, la membrana apareció más brillante que el entorno debido al proceso de adelgazamiento de salida, y el centro de la abertura (la ubicación de la formación de la membrana) era más brillante que la corona circular. La Figura 3 muestra la formación de membrana observada a través de microscopía digital. La membrana adelgazada-a cabo con éxito después de la descongelación.

Medición eléctrica de una bicapa lipídica
Medimos las corrientes eléctricas a través de la membrana utilizando un amplificador para calcular espesor de la membrana. electrodos de Ag / AgCl se sumergieron en ambas cámaras para medición eléctrica. Cuando 10 de onda triangular de pico a pico mV se aplica a través de la membrana, la onda triangular se convierte en una onda cuadrada de corriente debido a la característica de la membrana de bicapa lipídica (que actúa como un condensador). 21 Como resultado, hemos sido capaz de estimar el espesor de la membranautilizando la siguiente ecuación:

ecuación1

donde I (t) representa la corriente eléctrica y C representa la capacitancia a través de la membrana. V representa el voltaje aplicado de pico a pico (20 mV de 0,0625 seg). En este documento, C se puede expresar con, la permitividad del espacio libre (8,85 x 10 12 F / m 2), la constante dieléctrica de los lípidos (2,1), 22 A, el área de la membrana (~ 1,29 x 10 -7 m 2), y d, el espesor de la bicapa. Con los datos ópticos en la Figura 3 y los datos eléctricos, se calculó el espesor de la membrana para ser ~ 4 nm. Además, la membrana reconstituida satisfecho un sello nivel giga-ohm (> 1 GΩ), que normalmente se requiere para los estudios de canales iónicos. 23

Ion Channel Actividades de gramicidina A (GA)
Para verificar viabilidad de la detección del canal de iones con la bicapa lipídica formada a partir de la MP, incorporamos gA, uno de los canales iónicos de uso más frecuente para la verificación de la formación de membrana. Un gramicidin incorpora en la membrana como dos subunidades distintas que dimerize posteriormente. 7 canales de iones forma sobre la dimerización de la AG, y los iones penetran a través del canal iónico gA. La figura 4 ilustra la incorporación y la dimerización de la AG. Tras la dimerización gA, GA niveles de conductancia de los canales eran 28 pS, en consonancia con los resultados de los informes anteriores. 3

La concentración lipídica Solvente El adelgazamiento de salida (min) Curso de la vida (min) Tasa de éxito
0,1% 2: 8
escualeno: hexadecano 		50,6 (± 30,9) 52,4 (± 30,9) 77,8%
0,1% 2: 8
n decano: hexadecano 		13,2 (± 12,3) 10,8 (± 7,8) 75,2%
1% 2: 8
n decano: hexadecano 		15,8 (± 8,8) 26,2 (± 25,3) 69,3%
1% 2: 8
n decano: hexadecano 		13,8 (± 13,3) 23,6 (± 30,1) 55,6%
1% 2: 8
n decano: hexadecano 		13,6 (± 10,3) 8,9 (± 3,0) 50,0%

Tabla 1. Optimización de la composición de la solución MPES. 0,5 l de solución de lípidos se suspendió en una abertura de película delgada de PDMS (500 micras de diámetro). Aquí, variamos concentración de lípidos, la composición de disolvente y pre-pintura. 17. Adaptado con permiso de Ryu, H. et al. 7

Figura 1
Figura 1. Diagrama esquemático del sistema de formación de la membrana. La dimensión exterior de cada mitades de la cámara fue de 4 cm x 1,5 cm x 1 cm, y el tamaño del pozo interior fue de 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm. El pozo interior era lo suficientemente grande para alojar a 2 ml de solución tampón. En cada bloque de PTFE había agujeros para tener el contacto de la película delgada de PDMS con solución tampón. La otra cara fue sellado con una tapa de vidrio para la observación óptica de BLM. Por último, los bloques de cámara se reforzaron con pernos y tuercas para evitar fugas de líquido.4258 / 54258fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Diagrama esquemático de congelado precursora de membrana con Acelerado de autoensamblaje (MPES) la formación. Solución de lípidos en el PDMS apertura de película delgada puede ser congelado por un período indefinido. Cuando el precursor de membrana congelada fue llevado a temperatura ambiente para descongelar, la formación de bicapa lipídica se facilita debido a la extracción de disolvente hidrófobo en el PDMS capa fina. Como monómeros gA se añadieron directamente en la solución de lípidos, los canales iónicos formados gA inmediatamente después de la formación de la membrana. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3 = "/ Files / ftp_upload / 54258 / 54258fig3.jpg" />
Figura 3. Diagrama de microscópico del proceso de adelgazamiento de salida. Tras la descongelación de MPES y la posterior absorción de disolventes hidrófobos, el proceso de adelgazamiento de salida fue facilitado en la abertura de los PDMS de película delgada, y se formó la membrana dentro de los dos minutos después de la descongelación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Las medidas eléctricas sobre incorporación de gramicidina A. corriente salta a la incorporación y se muestra la dimerización de la AG en la membrana. Se observó una amplitud de ~ 28 pS en la dimerización de monómeros GA (100 mV potencial de mantenimiento; 100 Hz Bessel filtro de paso bajo).rget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For buffer solution
Tris-hydrochloride Sigma-Aldrich 1185-53-1 For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 60-00-4 For buffer solution
n-decane Sigma-Aldrich 44074-U For lipid solution
Hexadecane Sigma-Aldrich 544-76-3 For lipid solution
Squalene Sigma-Aldrich S3626 For lipid solution
Gramicidin A Sigma-Aldrich 11029-61-1 Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850356 For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit Dow Corning Asia To produce PDMS thin film
0.2 μm filter Satorius stedim 16534----------K To filter buffer solution
Rotator FinePCR AG To dissolve lipid homogeneously
Autoclave Biofree BF-60AC To sterilize buffer solution
Spin coater Shinu Mst SP-60P To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator Welch 2042-22 To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch Harris Uni-Core 0.5 To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine SME trading SME 2518 To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator Motic MLC-150C To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope Digital blue QX-5 To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode A-M Systems To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) Axon Instruments Axopatch 200B Amplifier To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)

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References

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