Summary
Vi viser en lagringsdyktig, transportable lipid bilaget formasjonssystem. En lipid dobbeltlag-membranen kan dannes i løpet av 1 time med over 80% suksessrate når en frossen membranforløperen bringes til omgivelsestemperatur. Dette systemet vil redusere arbeidskrevende prosesser og kompetanse knyttet til ionekanaler.
Abstract
En kunstig lipid bilaget, eller svart lipid membran (BLM), er et kraftig verktøy for å studere ionekanaler og proteininteraksjoner, så vel som for biosensor anvendelser. Men konvensjonelle BLM dannelsesteknikker har flere ulemper, og de ofte krever spesifikk kompetanse og arbeidskrevende prosesser. Spesielt vanlige BLMs lider av lave formasjons suksess priser og inkonsekvent membrandannelse tid. Her viser vi en storable og transportable BLM formasjonssystem med kontrollert uttynnings tid og forbedret BLM dannelseshastigheten ved å erstatte konvensjonelt brukte filmer (polytetrafluoretylen, polyoksymetylen, polystyren) til polydimethylsiloxane (PDMS). I dette forsøk er en porøs strukturert polymer, slik som PDMS tynn film anvendes. I tillegg, i motsetning til konvensjonelt anvendte løsningsmidler med lav viskositet, bruk av squalen tillates en kontrollert uttynnings tid via langsom oppløsningsmiddel absorpsjon av PDMS, forlenge levetiden membran. i annonsendition, ved anvendelse av en blanding av skvalen og heksadekan, frysepunktet for lipidoppløsningen ble øket (~ 16 ° C), i tillegg er membranforløpere ble produsert som kan lagres på ubestemt tid og lett kan transporteres. Disse membran forløpere har redusert BLM dannelse tiden av <1 time og oppnådde en BLM dannelse hastighet på ~ 80%. Videre har ionekanal eksperimenter med gramicidin A demonstrert muligheten for membransystemet.
Introduction
Kunstig lipid bilaget membran, eller svart lipid membran (BLM), er et viktig verktøy for å belyse mekanismene for cellemembraner og ionekanaler, samt for å forstå samspillet mellom ionekanaler og ioner / molekyler. 1-7 Selv om patch-clamp-metoden blir ofte regnet som gullstandarden for cellemembran studier, er det arbeidskrevende og krever høyt kvalifiserte operatører for ionekanal målinger. 8 Mens kunstig utblandede lipidbllag membraner har dukket opp som alternative verktøy for ionekanal studier, 9,10 de er også forbundet med strevsom prosesser og spesifikk kompetanse. Videre membraner er utsatt for mekaniske forstyrrelser. Derfor har lipidbilag teknologier introduseres dato begrensede praktiske anvendelser. 11
For å øke robusthet og lang levetid på lipidbllag membraner, Costello et al. 12, og Ide og Yanagida
Utviklingen av et lipidbilag plattformen har først og fremst dreid seg om å øke robusthet og lang levetid på BLMs. Selv lang av BLMs har vært substantially forbedret nylig, har sine søknader vært begrenset på grunn av manglende mobilitet og ability. For å overvinne disse problemene, Jeon et al. Opprettet en storable membran system og innførte en membran forløper (MP). 16 Å konstruere en MP, de forberedt en blanding av n- dekan og heksa inneholder 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidylcholin) for å styre frysepunktet til lipidoppløsningen, slik at det ville fryse ved ~ 14 ° C (under romtemperatur, over typiske kjøleskapstemperatur). I dette forsøk ble MP spredt over en liten åpning på et polytetrafluoretylen (PTFE) film og deretter frosset i et kjøleskap ved 4 ° C. Når MP ble brakt til romtemperatur, MP tint og et lipidbilag som automatisk ble dannet, noe som eliminerer ekspertise vanligvis forbundet med membrandannelsen. Men suksessen rate av BLM laget fra MP var så lav som ~ 27%, og membran formation gang var inkonsekvent (30 min til 24 timer), noe som begrenser dens praktiske anvendelser.
I denne studien er et polydimetylsiloksan (PDMS) tynn film som brukes i stedet for en vanlig hydrofobe tynne filmer (PTFE, polyoksymetylen, polystyren) til (a) kontroll fabrikasjon tid og (b) øke suksessraten av BLM formasjon som tidligere rapportert av Ryu et al. 17 Heri membrandannelsen ble forenklet ved ekstraksjon av oppløsningsmidler på grunn av den porøse natur av PDMS, og den tid som kreves for membrandannelse ble vellykket kontrollert i denne studien. I dette system, som lipidoppløsningen ble absorbert inn i PDMS tynn film, ble en konsistent membrandannelsen tid oppnådd. Dessuten ble membran levetid forlenges på grunn av langsom absorpsjon av løsningsmidler inn i de PDMS tynn film, et resultat av tilsetningen av squalen til lipidoppløsningen. Vi gjennomførte optiske og elektriske målinger for å verifisere at membraner dannet ved hjelp av denne teknikken er passende for ipå kanaler studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Løsning Forberedelse
- Fremstilling av bufferløsning:
- For å formulere bufferoppløsning, oppløses 1 M KCl (kaliumklorid), 10 mM Tris-HCl (tris-hydroklorid), og 1 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic syre) i destillert vann, og justere pH til 8,0.
- Filtrer løsningen ved hjelp av et 0,20 um filter. For å sterilisere, autoklaver-løsning ved 121 ° C i 15 min.
- Utarbeidelse av lipid løsning for pre-maleri:
- For å formulere den lipidoppløsningen for pre-maleri, oppløse 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidylcholin) lipid (w: v) i en blanding av 2: 8 n -decane og heksadekan (v: v). Rør over natten ved hjelp av en rotator.
- Utarbeidelse av lipid løsning for membran formasjon:
- For å formulere den lipidoppløsningen for membrandannelsen, oppløse 0,1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfatidylcholin) lipid (w: v) i en blanding av 2: 8 squalene og heksa (v: v). Rør over natten ved hjelp av en rotator.
2. Dannelse av en PDMS Thin Film
- Bland PDMS og herdemiddel i en 9: 1 (w / w) forhold i en blandekopp for å danne PDMS forpolymer. Tilsett 5 g av PDMS forpolymer til en petriskål for å danne de PDMS tynn film (med tykkelse på 200-250 um). Spre PDMS pre-polymer ved anvendelse av en spinn-belegger ved 800 rpm i 10 sekunder for å danne en tynn film.
- Sett petriskål inn i en vakuum-eksikkator ved et trykk på 100 mTorr i 2 timer for å fjerne luftbobler. Å polymerisere den ferdigpolymertynnfilm, bake i en ovn i 5 timer ved 70 ° C.
- For å gjøre en firkantet PDMS tynn film, kutte den polymeriserte PDMS tynn film til 2 x 2 cm kvadrater 2. Bruk en 500 um mikro dor for å lage en åpning i midten av PDMS tynn film. Pre-maling åpninger med 3% DPhPC lipid løsning blandet i 2: 8 n- dekan og heksa.
3. Chamber Fabrikasjon og Assembly
- For å fremstille BLM kammeret, utforming to symmetriske blokker av kammeret ved bruk av 3D-tegning programvare med utvendige dimensjoner på 4 cm x 1,5 cm x 1 cm og indre-brønners dimensjoner på 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17.
- Craft kammeret ved hjelp av en PTFE blokk med en CNC-maskin og følg produsentens anvisninger.
4. Chamber Assembly
- For å montere kammeret, plasserer den ferdigmalte-PDMS tynn film mellom de to PTFE-blokkene, slik at åpningen på den PDMS tynn film er på linje med hullet i kammeret.
- Forsegle de ytre kanter av kammeret ved hjelp av et dekkglass med fett (tilrettelegge optisk observasjon). Immobilisere den monterte kammeret ved hjelp av muttere og bolter.
MERK: Pass på at kammeret er godt forseglet, slik at det ikke er væskelekkasje.
5. Dannelse av Membran Precursor med Fremskyndet Selvmontering Formation (MPES)
- Ved hjelp av en pipette, innskudd 0,5ul av 0,1% DPhPC lipid blandet i 2: 8 n -decane: heksadekan på åpning av PDMS tynn film montert med kammeret.
- Før bruk, oppbevare kammeret i en fryser eller kjøleskap under 10 ° C.
6. Membran Dannelse og verifisering
- For å danne en BLM med MPES, trekke kammeret fra kjøleskapet og suspendere 2 ml bufferoppløsning på hver side av kammeret. Sett kammeret til side for <10 min før den frosne membranen forløper tiner.
- Plasser kammeret på en mikromanipulator for å nøyaktig kontrollere høyden i forhold til lyskilden og mikroskop. Belyse en side av kammeret som en lyskilde ved hjelp av et halogen fiberoptisk belysnings å lyse åpningen av PDMS tynnfilm for optisk observasjon av BLM dannelsesprosessen.
- På den andre siden, plasserer et digitalt mikroskop vertikalt i forhold til lyskilden for å observere BLM dannelse (forstørre ved 200X).
- For å bekrefte BLM formasjon, observere midten av åpningen der fargen blir lysere enn ringrommet.
7. Elektrisk Recording
- For elektrisk måling, forberede Ag / CL elektroder ved hjelp av en 208 mikrometer tykk sølvtråd og blekemiddel i natriumhypokloritt for> 1 min. Plasser Ag / Cl elektrodene til hver side av kammeret dypt nok til å være dyppet inn i bufferoppløsningen.
- Koble elektrodene til mikroelektroden forsterkeren. Ved hjelp av elektro programvare, bruke en ± 10 mV trekantet bølgeform over membranen for å tilegne seg en firkantet bølge. Sett søker spenning ved å klikke på pilene angitt på V_clamp (mV).
- Spill de elektriske egenskapene til membranen ved å klikke på opptaksknappen (rød prikk ikon). Fortsett med opptak til en ensartet firkantbølge er observert. Avslutt opptaket ved å klikke på svarte firkanten ikonet.
8. Ion Channel innlemmelse
IKKEE: gramicidin A (GA) inkorporering skjer spontant ved dannelsen av BLM, som gA tilsettes direkte til lipidoppløsningen.
- For å observere GA-kanal aktiviteter, anvende 100 mV over membranen ved en samplingsfrekvens på 5 kHz for å måle holde potensialet på membranen. Sett søker spenning ved å klikke på pilene angitt på V_clamp (mV).
- Spill de elektriske egenskapene til gA inkorporering ved å klikke på opptaksknappen (rød prikk ikon). Fortsett opptaket til dagens hopp er observert. Avslutt opptaket ved å klikke på svarte firkanten ikonet.
- Etter elektrisk datainnsamling, filtrere data med en lav-pass Bessel filter på 100 Hz ved hjelp av en elektro programvare.
- Observer dagens hopp i det filtrerte holde potensielle data (hver strøm hopp, ~ 0,15 ns, representerer dimerization av en gA ionekanal) for å verifisere gA innlemmelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimalisering av MPES Solution Sammensetning
Forskjellige sammensetninger av lipider og oppløsningsmidler ble testet for å kunne rekonstituere lipid dobbeltlag-membraner fra MPES. MP system med en blanding av n-dekan og heksadekan inneholdende 3% DPhPC 14 oppviste en lav suksessrate på membrandannelsen (~ 27%). I tillegg, som det PDMS filmen kontinuerlig ekstrahert lipid løsning, var det nødvendig å optimalisere oppløsningsmiddel preparatet for å opprettholde en intakt lipid dobbeltlag-membranen. Derfor, squalen, som har en viskositet på 12 cP ved 20 ° C 18 ble anvendt i stedet for n-dekan, som har en viskositet på 0,92 cP ved 20 ° C. 19 Når squalen ble anvendt, både stabilitet og lang levetid øker på grunn av en redusert sats av løsemiddel absorpsjon av PDMS. Tabell 1 sammen tynning ut tid, levetid, og suksessraten av membraner med forskjellige løsemiddel komposisjoner.
Når n- dekan ble anvendt, membrandannelsen var inkonsekvent og membraner ofte brudd i løpet av et kort tidsrom, på grunn av rask absorpsjon av løsningsmidlet ved PDMS tynne filmer. På den annen side, når squalen ble anvendt, ble tid til membranbrudd forsinket. I tillegg membran formasjon tid ble mer konsekvent, suksessrate på membran formasjon bedret seg, og lang levetid på membraner økt.
Membran Dannelse fra Membrane Precursor (MP)
En MP er frosset form av lipid-løsning som blir lett anvendelig ved opptining ved romtemperatur. Lipidet oppløsning inneholdende en blanding av n-dekan og heksadekan i en liten åpning i en PDMS tynn film fryser under 16 ° C, og er ubestemt tid kan lagres og transportable i frossen form. Figur 1 illustrerer monteringen av en PDMS tynn film med en PTFE chamber for å produsere en MP. Før bruk, ble det PTFE kammeret trekkes ut av kjøleskapet for membrandannelse. Heri ble det PDMS tynn film inneholdende den frosne lipidoppløsningen plassert mellom to halvdeler av PTFE kamre. Når bufferoppløsning ble deretter tilsatt til begge sider av kammeret ved værelsestemperatur, det ytterste lipid bilaget membranen dannes spontant ved tining av frossen membranforløperen (MP).
Etter tining, lipidoppløsningen tynnet ut som beskrevet i figur 2. Når det frosne membranen forløper tint, ble to monolag langs grenseflatene mellom buffer og lipid oppløsning bringes i kontakt. 20 Etter dannelse av membranen, GA monomerer som ble forhåndsblandet i lipidoppløsningen viste kanal aktiviteter.
Optisk Observasjon av membraner
For å verifisere optisk membrandannelsen, vibrukt overført lys for å visualisere membranen. Ved membrandannelsen, membranen først lysere enn omgivelsene på grunn av uttynningsprosessen, og senteret av åpningen (plasseringen av membrandannelse) var lysere enn ringrommet. Figur 3 viser membrandannelsen observert via digital mikroskopi. Membranen vellykket tynnet ut ved tining.
For elektrisk måling av et lipidbilag
Vi målte elektriske strømmer på tvers av membranen ved hjelp av en forsterker for å beregne membrantykkelse. Ag / AgCl elektroder ble neddykket i begge kamre for elektrisk måling. Når 10 mV topp-til-topp-trekantbølge ble påført over membranen, ble trekantbølge omdannet til en firkantbølge av strømmen på grunn av den egenskap ved lipid dobbeltlag-membranen (som virker som en kondensator). 21 Som et resultat, var vi i stand til å estimere tykkelsen av membranenved hjelp av følgende ligning:
hvor I (t) representerer elektrisk strøm og C representerer kapasitansen over membranen. V representerer den påførte topp-til-topp spenning (20 mV for 0,0625 sek). Heri, kan uttrykkes med C, permittiviteten av fritt rom (8,85 x 10 12 F / m 2), den dielektriske konstant av lipider (2,1), 22 A, arealet av membranen (~ 1,29 x 10 -7 m 2), og d tykkelsen av bilaget. Med de optiske dataene på figur 3, og elektriske data beregnet vi at tykkelsen av membranen for å være ~ 4 nm. I tillegg er den rekonstituerte membran tilfreds en giga-ohm nivå tetning (> 1 GΩ), som vanligvis er nødvendig for ionekanal studier. 23
Ionekanal Aktiviteter i gramicidin A (GA)
For å verifisere muligheten for ionekanal screening med det ytre lipid bilaget som dannes fra fler, inkorporert vi gA, en av de mest brukte ionekanaler for å verifisere membrandannelsen. Gramicidin A inkorporerer inn i membranen som to forskjellige subenheter som senere dimerisere. 7 ionekanaler formen ved dimerisering av gA, og ioner trenge gjennom gA ionekanal. Figur 4 illustrerer inkorporering og dimerisering av gA. Ved gA dimerization, GA kanal ledningsevne nivåene var 28 pS, i samsvar med resultatene fra tidligere rapporter. 3
| lipid-konsentrasjonen | Løsemiddel | Tynning-out (min) | Levetid (min) | Suksess rate |
| 0,1% | 2: 8 squalene: heksa | 50,6 (± 30,9) | 52,4 (± 30,9) | 77,8% |
| 0,1% | 2: 8 n -decane: heksa | 13,2 (± 12,3) | 10,8 (± 7,8) | 75,2% |
| 1% | 2: 8 n -decane: heksa | 15,8 (± 8,8) | 26,2 (± 25,3) | 69,3% |
| 1% | 2: 8 n -decane: heksa | 13,8 (± 13,3) | 23,6 (± 30,1) | 55,6% |
| 1% | 2: 8 n -decane: heksa | 13,6 (± 10,3) | 8,9 (± 3,0) | 50,0% |
Tabell 1. Optimalisering av MPES løsning sammensetning. 0,5 ul av lipidoppløsningen ble suspendert på en PDMS tynn-film åpning (500 um diameter). Her varierte vi lipid konsentrasjon, sammensetning av løsemiddel, og pre-maleri. 17. Tilpasset med tillatelse fra Ryu, H. et al. 7
Figur 1. Skjematisk diagram av membrandannelsen system. Den ytre dimensjon av hver halvdelene av kammeret var 4 cm x 1,5 cm x 1 cm, og størrelsen på det indre brønn var 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm. Den indre vel var stor nok til å romme 2 ml bufferløsning. På hver PTFE blokk var det hull for å ha PDMS tynn film kontakt med bufferløsning. Den andre siden ble forseglet med et dekkglass for optisk observasjon av BLM. Til slutt ble de kammer blokkene forsterket med bolter og muttere for å unngå væskelekkasje.4258 / 54258fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk diagram av Frozen Membran Precursor med Fremskyndet Selvmontering (MPES) formasjon. Lipid løsning på PDMS tynn-film blenderåpning kan fryses på ubestemt tid. Når den frosne membranforløperen ble brakt inn i romtemperatur for å tine, blir lipid bilagsdannelse lettes på grunn av ekstraksjon av hydrofobt løsningsmiddel inn i de PDMS tynnfilm. Som GA monomerer ble direkte tilsatt i lipid løsning, GA ionekanaler dannet umiddelbart etter membrandannelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
= "/ Files / ftp_upload / 54258 / 54258fig3.jpg" />
Figur 3. Mikroskopisk diagram av uttynningsprosessen. Ved tining av MPES og påfølgende absorpsjon av hydrofobe oppløsningsmidler, ble det uttynningsprosessen lettes på åpningen av PDMS tynn film, og membranen ble dannet i løpet av to minutter etter tining. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Elektriske målinger ved inkorporering av gramicidin A. Current hopp ved inkorporering og dimerisering av gA inn i membranen er vist. En amplitude på ~ 28 pS ble observert ved dimerisering av Ga monomerer (100 mV holdepotensial; 100 Hz Bessel-lavpassfilter).rFå = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
- Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
- Bayley, H., Cremer, P. S. Stochastic sensors inspired by biology. Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).
- Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
- Majd, S., et al. Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).
- Kim, Y. R., et al. Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications. Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).
- Ryu, H., et al. Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes. Sci Rep. 5, (2015).
- Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. Patch clamping by numbers. Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).
- Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents. Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).
- Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. A robust gel-bilayer channel biosensor. Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).
- Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. Hydrogel-encapsulated lipid membranes. J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).
- Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel. Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).
- Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).
- Ryu, H., et al. Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements. Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).
- Yaws, C. Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).
- Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs. , Merck & Co. (1976).
- Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer Science & Business Media. (1986).
- Miller, C. Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).
- Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).
- Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording. Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).
