Summary
Nous démontrons un système stockable, transportable lipidique formation bicouche. Une membrane lipidique à deux couches peut être formée à l'intérieur de 1 heure avec un taux de succès supérieur à 80% lors d'un précurseur de membrane congelée est ramené à température ambiante. Ce système permettra de réduire les processus laborieux et expertise associés aux canaux ioniques.
Abstract
Une bicouche lipidique artificielle, ou d'une membrane lipidique noire (BLM), est un outil puissant pour étudier les canaux ioniques et les interactions entre protéines, ainsi que pour les applications de biocapteurs. Cependant, les techniques classiques de formation BLM présentent plusieurs inconvénients et ils nécessitent souvent une expertise spécifique et des processus laborieux. En particulier, BLM classiques souffrent de faibles taux de réussite de la formation et incohérente temps de formation de la membrane. Ici, nous démontrons un système de formation BLM stockable et transportable avec le temps d'éclaircissage contrôlé et amélioré le taux de formation BLM en remplaçant les films classiquement utilisés (polytétrafluoroéthylène, polyoxyméthylène, polystyrène) polydiméthylsiloxane (PDMS). Dans cette expérience, un polymère poreux structuré tel que le PDMS film mince est utilisé. En outre, par opposition aux solvants classiquement utilisés avec une faible viscosité, l'utilisation du squalène a permis un temps d'éclaircissage contrôlée par absorption par un solvant lent PDMS, ce qui prolonge la durée de vie de la membrane. En additioncondition, à l'aide d'un mélange de squalène et de l'hexadécane, du point de la solution lipidique de congélation est augmentée (~ 16 ° C), en outre, des précurseurs membranaires ont été produits qui peuvent être stockés indéfiniment et facilement transportable. Ces précurseurs membranaires ont réduit BLM temps de formation de <1 h et atteint un taux de formation BLM de ~ 80%. Par ailleurs, des expériences de canaux ioniques avec la gramicidine A ont démontré la faisabilité du système membranaire.
Introduction
Membrane artificielle bicouche lipidique ou membrane lipidique noire (BLM), est un outil important pour les mécanismes des membranes cellulaires et des canaux ioniques, élucidant ainsi que pour la compréhension des interactions entre les canaux ioniques et des ions / molécules 1-7 Bien que la méthode patch-clamp. est souvent considéré comme l'étalon-or pour les études de la membrane cellulaire, il est laborieux et exige des opérateurs hautement qualifiés pour des mesures de canaux ioniques. 8 Alors reconstituées artificiellement des membranes bicouches lipidiques ont émergé comme des outils alternatifs pour les études des canaux ioniques, 9,10 ils sont également associés à laborieuse des processus et des compétences spécifiques. Par ailleurs, les membranes sont sensibles aux perturbations mécaniques. Applications pratiques Ainsi, les technologies de bicouches lipidiques introduites à ce jour ont limité. 11
Afin d'améliorer la robustesse et la longévité des membranes de bicouche lipidique, Costello et al. , 12, et Ide et Yanagida
Le développement d'une plate-forme bicouche lipidique a principalement tourné autour de plus en plus de robustesse et de longévité de BLM. Bien que la longévité de BLM a été substantially améliorée récemment, leurs applications ont été limitées en raison d'un manque de transportabilité et conservabilité. Pour surmonter ces problèmes, Jeon et al. A créé un système de membrane stockable et introduit un précurseur de membrane (MP). 16 Pour construire un député, ils ont préparé un mélange de décane n- et hexadécane contenant 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn - glycéro-3-phosphatidylcholine) pour contrôler le point de la solution lipidique telle qu'elle gèle à ~ 14 ° C ( en dessous de la température ambiante, supérieure à la température typique du réfrigérateur) congélation. Dans cette expérience, le député a été étalée sur une petite ouverture sur un polytétrafluoroéthylène (PTFE) Film et ensuite congelé dans un réfrigérateur à 4 ° C. Lorsque le MP est ramené à température ambiante, le MP décongelé et une bicouche lipidique est formée automatiquement, ce qui élimine l'expertise typiquement associée à la formation de la membrane. Cependant, le taux de succès de BLM fait de la MP était aussi bas que ~ 27%, et la membrane formation temps était incompatible (30 min à 24 h), ce qui limite ses applications pratiques.
Dans cette étude, un polydiméthylsiloxane (PDMS) film mince est utilisé à la place d'un des films classiques hydrophobes minces (PTFE, polyoxyméthylène, polystyrène) à (a) le temps de contrôle de la fabrication et (b) augmenter le taux de formation BLM succès comme rapporté précédemment par Ryu et al. 17 Ici, la formation de la membrane a été facilitée par l' extraction de solvants en raison de la nature poreuse de PDMS, et le temps nécessaire à la formation de la membrane a été contrôlée avec succès dans cette étude. Dans ce système, la solution lipidique a été absorbé dans le film mince PDMS, un temps de formation d'une membrane uniforme a été obtenue. De plus, la durée de vie de la membrane a été prolongée en raison de l'absorption lente des solvants dans les PDMS de film mince, un résultat de l'addition de squalène à la solution lipidique. Nous avons effectué des mesures optiques et électriques pour vérifier que les membranes formées en utilisant cette technique sont appropriés pour isur des études canaux.
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Protocol
1. Préparation de la solution
- Préparation de la solution tampon:
- À formuler une solution tampon, on dissout 1 M de KCl (chlorure de potassium), 10 mM de Tris-HCl (Tris-chlorhydrate) et 1 mM d'EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) dans l'eau distillée et ajuster le pH à 8,0.
- Filtrer la solution en utilisant un filtre de 0,20 um. Pour stériliser, autoclave la solution à 121 ° C pendant 15 min.
- Préparation de la solution lipidique pour prélaquage:
- Pour formuler la solution lipidique pour prélaquage, on dissout 3% DPhPC (1,2-sn - glycéro diphytanoyl--3-phosphatidylcholine) lipide (p: v) dans un mélange de 2: 8 et n décane hexadécane (v: v). Agiter pendant une nuit en utilisant un dispositif de rotation.
- Préparation de la solution lipidique pour la formation de la membrane:
- Pour formuler la solution lipidique pour la formation de la membrane, dissoudre 0,1% DPhPC (1, 2-sn - glycéro diphytanoyl--3-phosphatidylcholine) lipide (p: v) dans un mélange de 2: 8 plet ualene hexadécane (v: v). Agiter pendant une nuit en utilisant un dispositif de rotation.
2. Formation d'un Thin Film PDMS
- Mélanger PDMS et d'agent de durcissement dans un rapport de 9 à 1 (p / p) dans un récipient de mélange pour former le prépolymère PDMS. Ajouter 5 g de PDMS prépolymère dans une boîte de Pétri pour former le PDMS film mince (épaisseur 200-250 um). Étaler PDMS de pré-polymère à l'aide d'une tournette à 800 tours par minute pendant 10 secondes pour former un film mince.
- Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur sous vide à une pression de 100 mTorr pendant 2 heures pour éliminer les bulles d'air. Pour polymériser le film mince pré-polymère, cuire au four pendant 5 heures à 70 ° C.
- Afin de rendre un PDMS carrés de film mince, couper le PDMS polymérisés film mince en 2 x 2 cm 2 carrés. Utilisez un micro poinçon 500 um pour faire une ouverture dans le centre du PDMS à film mince. Des ouvertures pré-peinture avec une solution à 3% DPhPC lipidique mélangé 2: 8 et le décane n- hexadécane.
3. Chambre Fabrication et Assembly
- Pour fabriquer la chambre BLM, la conception de deux blocs symétriques de la chambre en utilisant un logiciel de dessin 3D avec des dimensions extérieures de 4 cm x 1,5 cm x 1 cm et des dimensions intérieures puits de 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm 17.
- Craft la chambre en utilisant un bloc de PTFE avec une machine CNC et suivez les instructions du fabricant.
4. Assemblée Chambre
- Pour assembler la chambre, placer le film mince pré-peint-PDMS entre les deux blocs de PTFE tel que l'ouverture sur le PDMS film mince est aligné avec le trou dans la chambre.
- Sceller les bords extérieurs de la chambre en utilisant un couvercle en verre avec de la graisse (ce qui facilite l'observation optique). Immobiliser la chambre assemblés à l'aide des écrous et des boulons.
REMARQUE: Assurez-vous que la chambre est bien scellé de sorte qu'il n'y ait pas de fuite de liquide.
5. La formation de membrane Precursor avec Expedited auto-assemblage Formation (MPES)
- En utilisant une pipette, déposer 0,5pi de 0,1% DPhPC lipide mélangé 2: 8 n décane: hexadécane sur l'ouverture du PDMS film mince assemblé avec la chambre.
- Avant d'utiliser, stocker la chambre dans un congélateur ou un réfrigérateur en dessous de 10 ° C.
6. Membrane Formation et vérification
- Pour former un BLM avec MPES, retirer la chambre du réfrigérateur et de suspendre 2 ml d'une solution tampon de chaque côté de la chambre. Réglez la chambre de côté pour <10 min jusqu'à ce que le précurseur de membrane congelée dégèle.
- Placer la chambre sur un micromanipulateur pour contrôler avec précision la hauteur par rapport à la source lumineuse et le microscope. Illuminer un côté de la chambre comme une source de lumière en utilisant un halogène fibres optiques illuminateur pour illuminer l'ouverture du PDMS à couche mince pour l'observation optique du processus de formation BLM.
- De l'autre côté, placez un microscope numérique verticalement par rapport à la source lumineuse pour observer la formation BLM (magnifier par 200X).
- Pour confirmer la formation BLM, observer le centre de l'ouverture où la couleur devient plus lumineux que l'anneau.
7. Enregistrement électrique
- Pour la mesure électrique, préparer des électrodes Ag / Cl en utilisant un fil d'argent 208 um d'épaisseur et de l'eau de Javel dans l'hypochlorite de sodium pendant> 1 min. Placer les électrodes Ag / Cl dans chaque côté de la chambre suffisamment profond pour être plongé dans la solution tampon.
- Connecter les électrodes à l'amplificateur de microélectrodes. En utilisant le logiciel d'électrophysiologie, appliquer une forme d'onde triangulaire mV ± 10 à travers la membrane pour acquérir une onde carrée. Régler application d'une tension en cliquant sur les flèches indiquées sur V_clamp (mV).
- Enregistrer les propriétés électriques de la membrane en cliquant sur le bouton d'enregistrement (rouge icône de point). Procéder à l'enregistrement jusqu'à ce qu'une onde carrée uniforme est observée. Quittez l'enregistrement en cliquant sur l'icône carré noir.
8. Ion Canal Incorporation
NE PASE: gramicidine A (gA) l'incorporation se fait spontanément lors de la formation de BLM, comme gA est ajouté directement à la solution lipidique.
- Pour observer les activités de canal gA, appliquer 100 mV à travers la membrane à un taux de 5 kHz échantillon pour mesurer le potentiel de la membrane de maintien. Régler application d'une tension en cliquant sur les flèches indiquées sur V_clamp (mV).
- Enregistrer les propriétés électriques de l'incorporation gA en cliquant sur le bouton d'enregistrement (rouge icône de point). Continuez l'enregistrement jusqu'à ce que les sauts en cours est observée. Quittez l'enregistrement en cliquant sur l'icône carré noir.
- Après l'acquisition de données électriques, filtrer les données avec un filtre passe-bas de Bessel à 100 Hz en utilisant un logiciel d'électrophysiologie.
- Observer les sauts de courant dans la détention de données potentiels filtré (chaque saut courant, ~ 0,15 nS, représente dimérisation d'un canal ionique gA) pour vérifier gA incorporation.
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Representative Results
Optimisation de la composition de solution MPES
Différentes compositions de lipides et les solvants ont été testés pour reconstituer avec succès des membranes bicouches lipidiques de MPES. Le système MP avec un mélange de décane n- et hexadécane contenant 3% DPhPC 14 présentait un faible taux de réussite de la formation de membrane (~ 27%). De plus, comme le film de PDMS extrait en continu la solution lipidique, il a été nécessaire d'optimiser la composition du solvant pour maintenir une double membrane lipidique intactes. Par conséquent, le squalène, qui a une viscosité de 12 cP à 20 ° C 18 a été utilisé au lieu de décane n-, qui a une viscosité de 0,92 cP à 20 ° C. 19 Lorsque le squalène a été utilisé, à la fois la stabilité et la longévité accrue en raison d'une taux diminué d'absorption de solvant par PDMS. le tableau 1 compare le temps de éclaircissage, durée de vie, et le taux de membranes avec différentes compositions de solvants de succès.
Quand on a utilisé le n - décane, la formation de la membrane était irrégulière et souvent rompue membranes dans un court laps de temps, en raison de l' absorption rapide du solvant par PDMS couches minces. D'autre part, quand on a utilisé le squalène, le temps de rupture de la membrane a été retardée. En outre, le temps de formation de la membrane devient plus uniforme, la vitesse de formation de la membrane est améliorée et la longévité des membranes succès augmente.
Membrane Formation de Membrane Precursor (MP)
Un MP est la forme congelée de la solution lipidique qui devient facilement utilisable lors de la décongélation à température ambiante. La solution de lipide contenant un mélange de décane n- et hexadécane dans une petite ouverture dans un PDMS film mince gèle en dessous de 16 ° C, et est indéfiniment stockable et transportable sous forme congelée. La figure 1 illustre l'assemblage d'un PDMS film mince avec un PTFE chambre pour produire un MP. Avant utilisation, la chambre de PTFE a été retirée du réfrigérateur pour la formation de la membrane. Ici, le PDMS film mince contenant la solution lipidique congelé a été placé entre deux moitiés de chambres de PTFE. Lorsque la solution tampon a ensuite été ajouté à la fois latérale de la chambre à la température ambiante, la membrane bicouche lipidique formée spontanément lors de la décongélation du précurseur de membrane congelée (MP).
Lors de la décongélation, la solution lipidique diluée comme décrit dans la figure 2. Lorsque le précurseur de membrane congelée décongelée, deux monocouches le long de l'interface entre le tampon et la solution de lipide ont été mis en 20 contact. Après la formation de la membrane, les monomères gA qui ont été pré-mélangés dans le lipide solution a montré des activités de canal.
Observation optique Membranes
Afin de vérifier la formation d'une membrane optique, nousla lumière transmise utilisée pour visualiser la membrane. Lors de la formation de la membrane, la membrane est apparue plus brillante que l'environnement en raison du processus d'éclaircissage, et le centre de l'ouverture (l'emplacement de formation de la membrane) était plus clair que l'espace annulaire. La figure 3 montre la formation des membranes observée par microscopie numérique. La membrane amincie avec succès lors de la décongélation.
Mesure électrique d'une bicouche lipidique
Nous avons mesuré des courants électriques à travers la membrane en utilisant un amplificateur pour calculer l'épaisseur de la membrane. électrodes Ag / AgCl ont été submergées dans les deux chambres de mesure électrique. Lorsque 10 mV onde triangulaire crête à crête a été appliquée à travers la membrane, la vague de triangle a été converti en une onde carrée du courant en raison de la caractéristique de la membrane bicouche lipidique (agissant comme un condensateur). 21 En conséquence, nous étions capable d'estimer l'épaisseur de la membrane,en utilisant l'équation suivante:
où I (t) représente le courant électrique et C représente la capacité à travers la membrane. V représente la tension appliquée de crête à crête (20 mV pour 0,0625 sec). Ici, C peut être exprimé par la permittivité de l' espace libre (8,85 x 10 12 F / m 2), la constante diélectrique des lipides (2.1), 22 A, la surface de la membrane (~ 1,29 x 10 -7 m 2), et d, l'épaisseur de la double couche. Les données optiques de la Figure 3 et les caractéristiques électriques, on a calculé l'épaisseur de la membrane à ~ 4 nm. En outre, la membrane reconstituée satisfait à un joint d' étanchéité au niveau du gigaohm (> 1 GQ), qui est généralement requis pour des études de canaux ioniques 23.
Ion Chaîne Activités de gramicidine A (gA)
Pour vérifier la faisabilité du dépistage du canal ionique avec la bicouche lipidique formée à partir de la MP, nous avons intégré gA, l'un des canaux d'ions les plus fréquemment utilisés pour la vérification de la formation de la membrane. Gramicidin A incorpore dans la membrane en deux sous - unités distinctes qui dimériser ultérieurement. 7 Ion canaux forme sur dimérisation de gA et ions perméat à travers le canal ionique gA. La figure 4 illustre l' incorporation et la dimérisation de gA. Sur gA dimérisation, gA niveaux de conductance de canal étaient 28 pS, en accord avec les résultats des rapports précédents. 3
| La concentration de lipides | Solvant | Dilution-out (min) | Durée de vie (min) | Taux de réussite |
| 0,1% | 2: 8 squalène: hexadécane | 50,6 (± 30,9) | 52,4 (± 30,9) | 77,8% |
| 0,1% | 2: 8 n décane: hexadécane | 13.2 (± 12.3) | 10.8 (± 7.8) | 75,2% |
| 1% | 2: 8 n décane: hexadécane | 15,8 (± 8,8) | 26,2 (± 25,3) | 69,3% |
| 1% | 2: 8 n décane: hexadécane | 13,8 (± 13,3) | 23,6 (± 30,1) | 55,6% |
| 1% | 2: 8 n décane: hexadécane | 13,6 (± 10,3) | 8,9 (± 3,0) | 50,0% |
Tableau 1. Optimisation de la composition de la solution MPES. 0,5 pi de solution de lipide a été suspendue sur une ouverture à film mince PDMS (500 um de diamètre). Ici, nous avons fait varier la concentration de lipides, la composition de solvant, et pré-peinture. 17. Adapté avec la permission de Ryu, H. et al. 7
Figure 1. Représentation schématique du système de formation de la membrane. La dimension extérieure de chacune des moitiés de la chambre était de 4 cm x 1,5 cm x 1 cm, et la taille du puits interne est de 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm. Le puits intérieur était assez grande pour accueillir 2 ml de solution tampon. Sur chaque bloc de PTFE, il y avait des trous pour avoir le PDMS mince de contact du film avec une solution tampon. L'autre côté a été scellé avec un couvercle en verre pour l'observation optique du BLM. Enfin, les blocs de chambres ont été renforcées avec des boulons et des écrous pour éviter les fuites de liquide.4258 / 54258fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma de Frozen Membrane Precursor avec Expedited auto-assemblage (MPES) formation. Solution de Lipid sur les PDMS ouverture à film mince peut être congelé pour une durée indéterminée. Lorsque le précurseur de membrane congelée a été mise en température ambiante pour dégeler, la formation de bicouches lipidiques est facilitée en raison de l'extraction du solvant hydrophobe dans le PDMS à film mince. Comme monomères gA ont été ajoutés directement dans la solution lipidique, les canaux ioniques gA formés immédiatement après la formation de la membrane. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Diagramme microscopique du processus d'éclaircissage. Après décongélation du MPES et l' absorption ultérieure des solvants hydrophobes, le procédé d'éclaircissage est facilitée sur l'ouverture du PDMS de film mince, et la membrane a été formée dans les deux minutes qui suivent la décongélation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Les mesures électriques sur l' incorporation de gramicidine A. actuel des sauts lors de la constitution et de la dimérisation de gA dans la membrane est représentée. Une amplitude de ~ 28 pS a été observée lors de la dimérisation de monomères gA (100 mV potentiel de maintien; 100 Hz Bessel filtre passe-bas).rget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For buffer solution |
| Tris-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | For buffer solution |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | For buffer solution |
| n-decane | Sigma-Aldrich | 44074-U | For lipid solution |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | For lipid solution |
| Squalene | Sigma-Aldrich | S3626 | For lipid solution |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membrane protein |
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | For membrae formation |
| Sylgard 184a and 184b elastromer kit | Dow Corning Asia | To produce PDMS thin film | |
| 0.2 μm filter | Satorius stedim | 16534----------K | To filter buffer solution |
| Rotator | FinePCR | AG | To dissolve lipid homogeneously |
| Autoclave | Biofree | BF-60AC | To sterilize buffer solution |
| Spin coater | Shinu Mst | SP-60P | To spread PDMS prepolymer |
| Vaccum dessiccator | Welch | 2042-22 | To remove air bubble in PDMS prepolymer |
| 500 μm punch | Harris Uni-Core | 0.5 | To create an aperture on the PDMS thin film |
| CNC machine | SME trading | SME 2518 | To fabricate membrane formation chamber |
| Halogen fiber optic illuminator | Motic | MLC-150C | To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation |
| Digital microscope | Digital blue | QX-5 | To optically observe lipid bilayer membrane formation |
| Electrode | A-M Systems | To electrically observe membrane formation | |
| Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript) |
References
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