Summary
Menschliche Tumorxenotransplantate sind vaskularisiert und durch Zellen von Maus - Ursprung während der Wachstumsphase in vivo infiltriert. Um die Vorspannung, die durch diese kontaminierenden Zellen während nachgeschalteten Analyse verursacht umgehen, entwickelten wir ein Verfahren erlaubt eine umfassende Depletion aller Mauszellen durch magnetische Zellsortierung.
Abstract
Die Verwendung von in - vitro - Zelllinie Modelle für die Krebsforschung hat ein nützliches Werkzeug gewesen. Es hat sich jedoch gezeigt , dass diese Modelle zuverlässig nicht gezeigten Patiententumoren in verschiedenen Assays 1 nachahmt. Menschliche Tumorxenografte stellen den Goldstandard in Bezug auf Tumorbiologie, Arzneimittelforschung und Metastasierung Forschung 2-4. Tumor - Xenotransplantate können aus verschiedenen Arten von Material , wie Tumorzelllinien, Tumorgewebe von Patienten primären Tumoren 4 oder seriell transplantierten Tumoren ableiten. Wenn in vivo propagiert wird xenografted Gewebe infiltriert und durch Zellen der Maus Herkunft vaskularisiert. Mehrere Faktoren wie die Tumor Einheit, beeinflussen die Entstehung von xenografted Material, Wachstumsrate und der Region der Transplantation, die Zusammensetzung und die Menge an Mauszellen in Tumorxenografte. Allerdings sind, auch wenn diese Faktoren konstant gehalten wird, ist der Grad der Mauszell Kontamination sehr variabel.
Contaminating Mauszellen beeinträchtigen signifikant Downstream-Analysen von menschlichen Tumorfremdtransplantaten. Als Maus-Fibroblasten hohe Plattierung Wirksamkeiten und Proliferationsraten zeigen, neigen sie Kulturen von menschlichen Tumorzellen zu überwuchern, besonders langsam Subpopulationen wuchernden. Maus - Zell - DNA, mRNA und Protein - Komponenten können Bias nachgelagerten Genexpressionsanalyse, der nächsten Generation Sequenzierung, sowie Proteomanalyse 5 abgeleitet. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine schnelle und einfache Methode zur Isolierung unberührt menschlichen Tumorzellen aus xenografted Tumorgewebe entwickelt. Dieses Verfahren basiert auf der umfassenden Depletion von Zellen von Maus-Ursprung, indem sie mit dem Gewebe benchtop Dissociator und magnetische Zellsortierung automatisierten Gewebedissoziation kombiniert. Hier zeigen wir, dass die menschliche Zielzellen werden kann, kann mit Reinheiten von mehr als 96% innerhalb von weniger als 20 min unabhängig vom Tumortyp erhalten werden.
Introduction
Feste menschlichen Tumoren bestehen aus mehreren physiologischen sowie neoplastischen Zelltypen. Sie bilden heterogene Gewebe mit komplexen biologischen Strukturen. Biologische Prozesse wie Tumorbildung, Progression und Reaktionen auf Therapien sind noch nicht vollständig verstanden. In - vitro - Zellkultur - Modellen ein nützliches Instrument darstellen , zu studieren und Tumorbiologie zu verstehen. Jedoch können sie nur teilweise in Tumorgeweben gefunden Strukturen und Prozesse widerspiegeln. Zuverlässige und stabile preclinical humanen Tumormodelle sind eine Voraussetzung für die Entwicklung von Anti-Tumor - Medikamente und Therapien 4,6 sowie für Tumorbiologie zu verstehen und die Wechselwirkung der Tumorzellen und ihrer Umgebung.
Menschliche Tumor Xenotransplantatmodellen von primären Patiententumoren abgeleitet zeigen hohe Beziehungen zum Ursprungsgewebe in Bezug auf histologischen Architektur, die Wechselwirkungen mit Mikro-Umwelt-Strukturen, metastatische Potential und Reaktionen auf Medikamente 7 in vitro Zellkulturmodellen. Diese Eigenschaften machen sie der Goldstandard der präklinischen Modellen 4. Neben der Anwendung in der Krebsforschung, der Xenotransplantation von menschlichen Zellen in Mäuse auch häufig in der Stammzellforschung 8 die stemness und Differenzierungspotential einer Zielpopulation zu bestimmen.
Es hat sich gezeigt , dass die menschliche microvasculature und humanen Immunzellen auf in vivo Vermehrung von menschlichen Tumoren 2,9 ersetzt ist. Faktoren wie die Tumorsubtyp, Wachstumsrate, und in der Region der Transplantation haben erhebliche Auswirkungen auf die globale Ebene der Infiltration sowie die Zusammensetzung der Maus Zelltypen gefunden. Selbst wenn jedoch diese Faktoren konstant gehalten werden, sind die Menge und Zusammensetzung der Mauszellen sehr variabel.
Downstream Analysen xenografted Geweben werden oft von Zellen murinen Ursprungs in Frage gestellt. Primärkulturen von menschlichen Tumorzellen aus Xenotransplantate werden durch Fibroblasten häufig überwuchert. Neben behindert die Bildung von Tumorzelllinien in vitro, stromabwärts Assays wie Arzneimittel Zytotoxizität Tests oder Pharmakokinetik da für Effekte in silico - Korrektur vorgespannt sind , aus dem Ursprungs kontaminierenden Mauszellen in den meisten Fällen nicht möglich ist. Darüber hinaus hat das nur teilweise aufgeklärt Übersprechen zwischen Maus - Fibroblasten und humanen Tumorzellen einen direkten Einfluss auf experimentelle Ergebnisse der Studien 10. Darüber hinaus verschärft die am weitesten unberechenbar Variation infiltrieren Mauszellen genaue molekulare Downstream-Analysen. In NGS oder Proteom analysiert jede Maus stammenden Signal anstelle eines menschlichen Tumors gemessenen Signalsequenzierungs Empfindlichkeit direkt abnimmt. Auch Microarray-basierten Expressionsanalysen werden von murinen Nuk herausgefordertleic Säuren möglicherweise Kreuz hybridisiert menschlichen Sonden.
Um die Hindernisse von kontaminierenden Mauszellen in Downstream-Analysen von humanen Tumorzellen von Xenograft-Modellen verschiedene Ansätze vorgeschlagen worden, zu umgehen. In vielen Studien Downstream-Analyse gewünschten Zielzellen für isoliert werden durch Markierungen oder Kombinationen von Markern unter Verwendung ausgedrückt ausschließlich auf menschlichen Tumorzellen. Allerdings stellt das Fehlen zuverlässiger Marker für eine positive Identifizierung von humanen Tumorzellen häufig eine große Hürde. Auch im Großen und Ganzen ausgedrückt Marker, wie EpCAM auf humanen Karzinomen, zeigen häufig Tumor intrinsische Expressionsunterschiede 11. Dies erhöht das Risiko , die niedrig exprimierenden Subpopulationen, beispielsweise Tumorzellen epithelialen-to-mesenchymale Transition erfahren, sind bei der Isolierung verloren. Darüber hinaus könnte die direkte Bindung eines Selektionsmittels an die Zielzelle die nachfolgenden Analyseergebnisse beeinflussen. Versuche von abbauenden Zellen der Maus durchverwenden , haben eine Kombination von Antikörpern , die spezifisch für murine CD45 und MHC - Klasse - I - Epitope auch 12 gemacht worden. Jedoch nur diese Markerkombination detektiert eine Teilmenge von Mauszellen. Ein weiterer Ansatz ist die Analyse von Prozessen durch Software zu verbessern. Doch alle diese Ansätze sind entweder nicht geeignet für jede Art von Versuchsaufbau oder für jede Tumorart und Transplantationsmethode.
In dieser Studie stellen wir eine neue und schnelle Methode zur Mauszellen aus xenografted Gewebe unabhängig von der Mausstamm und Ursprungsgewebe umfassend erschöpfen. In Vorführungen auf mehreren Zielorganen und Geweben zur Transplantation von Xenotransplantaten (einschließlich Haut, Lunge, Gehirn, Niere und Skelettmuskel) konnten wir eine Kombination von Antikörpern zu ermöglichen, dass Zellen umfassend Erkennung Maus zu identifizieren. Diese Antikörper wurden an superparamagnetische Partikel gekoppelt, titriert und zur Abreicherung optimiert durch magnetische Zellsortierung verwendet wird. Da nur Maus spezifischeAntikörper werden verwendet, menschliche Zielzellen bleiben "unberührt" und das Verfahren ist nicht auf xenotransplantierten Tumorgewebe beschränkt. Wir zeigen, dass umfassend Entfernen von Mauszellen aus xenografted Tumorproben standardisiert und erleichtert Kulturen von humanen Tumorzellen. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Analyse von menschlichen Tumorfremdtransplantaten durch Sequenzierung der nächsten Generation deutlich verbessert. Da dieser Effekt wurde beobachtet, wenn auch ein menschlicher sequenzspezifische Selektion während Exoms Anreicherung durchgeführt wurde, werden der Einfluss auf die gesamte Genom und ganze Transkriptom Sequenzierung erwartet noch deutlicher werden. Zusammengenommen Entfernung von Mauszellen Dieses neuartige Verfahren unter Verwendung erleichtert Kultivierung von menschlichen Tumorzellen und verbessert signifikant die Downstream-Analysen von humanen Tumor-Xenotransplantaten.
Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen ethischen und rechtlichen Vorgaben des Regierungspräsidium Freiburg Referat 35 durchgeführt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
HINWEIS: Vor dem Versuch, die folgenden Reagenzien aus der Dissoziation Kit vorbereiten:
- Zur Herstellung von Enzym H RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) oder Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) lösen jedes Fläschchen des gefriergetrocknetes Pulver in 3 ml. Um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen vorbereiten geeignete Aliquots zu vermeiden (zB 200 & mgr; l) und speichert sie bei - 20 ° C bis zu 6 Monaten.
- Zur Herstellung von Enzym-R das Fläschchen des gefriergetrocknetes Pulver in 2,7 ml RPMI oder DMEM-Medium aufzulösen. Um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen vorbereiten geeignete Aliquots zu vermeiden (zB 100 & mgr; l) und speichert sie bei - 20 ° C bis zu 6 Monaten.
- Zur Herstellung von Enzym A lösen die vial des gefriergetrocknetes Pulver in 1 ml Puffer A mit dem Kit geliefert, ohne Verwirbelung. Um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen vorbereiten geeignete Aliquots zu vermeiden und lagern Sie sie an (zB 25 & mgr; l.) - 20 ° C bis zu 6 Monaten. Achten Sie darauf, diese Suspension gründlich zu mischen, unmittelbar bevor die erforderliche Reaktionsvolumen zurückziehen.
- Bereiten 250 ml Puffer (1x PBS mit 0,5% BSA) für Zelltrennungsverfahren und Antikörperfärbung.
HINWEIS: Bei der Kultivierung von Zellen nach der Entfernung von Mauszellen auswählen, alle Puffer und Enzymlösungen durch ein 0,22 um-Filter.
2. Tumor Distanzierung Protokoll
HINWEIS: In dieser Studie Patienten stamm Xenotransplantate von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), wurden Nierenkrebs und Blasen verwendet. Die Tumoren wurden erzeugt , indem Xenotransplantate von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Nierenkrebs und Blasen in 4 Implantieren - 6 Wochen alten weiblichen NMRI nu / nu - Mäusen , wie zuvor beschrieben 13 Hinweis: Da dieses Protokoll vollständig unabhängig von dem Tumortyp ist, kann es für jede Art von Patient oder Zelllinie abstammenden Tumoren sowie andere Arten von menschlichen xenotransplantierten Gewebe ohne Modifikation des Protokolls verwendet werden.
- Bereiten 5 ml Verdauungsmischung pro Gewebeprobe (bis zu 1 g) frisch durch Zugabe von 4,7 ml RPMI 1640 oder DMEM, 200 ul Enzym H, 100 ul Enzym R, und 25 & mgr; l Enzym A in ein zelluläres Dissoziation Rohr ( C-Schlauch). Stellen Sie sicher, Enzym R Suspension gründlich zu mischen, bevor das erforderliche Volumen abzuziehen.
- Opfern, um die Tiere durch Genickbruch unter Narkose. Desinfizieren Maus durch mit kleinen Menge von 80% v / v Ethanol Aufsprühen.
- Ernte subkutanen Tumor aus der Maus Flanke mit einer Pinzette und Schere in einer Gewebekultur Kapuze. Schneiden Sie die Haut offen anstelle der Tumor Schere und trennen sich dann den Tumor von benachbarten gesunden Gewebe mit einer Pinzette und Schere.
HINWEIS: In Abhängigkeit von dem Zweckdas Experiment dieser und den folgenden Schritten unter aseptischen Bedingungen durchzuführen. In dieser Studie wurden alle Schritte in einem Zellkulturhaube unter aseptischen Bedingungen, um in der Lage, die Zellen zu kultivieren, durchgeführt wird. - Bereiten Sie die Tumorprobe für Aufschlüsse durch Fett zu entfernen und Nekrosen (da dies die Probe Schwimmer machen) (da dies zu einer verminderten Rentabilität führen wird) durch Wegschneiden Zange und mit einem Skalpell. Zerkleinern das Gewebe in Stücke von 2 bis 4 mm durch Skalpelle und Pinzetten verwendet wird.
- Übertragen Sie die Gewebestücke in die C-Tube mit der Verdauung Mix.
- Schließen Sie den C-Schlauch und stellen Sie sicher, dass es fest geschlossen ist. Bringen Sie ihn auf den Kopf auf die Hülse des Benchtop Gewebe Dissociator und stellen Sie sicher, dass die Gewebestücke im Bereich des Rotor / Stator befinden.
- Wählen Sie den Modus "h_tumor_01" durch die "nach oben" drücken oder "down" -Taste, bis der Modus im Display angezeigt wird und drücken Sie dann die Schaltfläche "Start".
- Wenn dusingen die Heizfunktion des Benchtop Gewebe Dissociator, stellen Sie sicher, auch die Heizung anschließen. Dann führen Sie Modus 37C_h_TDK_1 (für weiche Tumoren), 37C_h_TDK_2 (für mittlere Tumoren) oder 37C_h_TDK_3 (für harte Tumoren), indem Sie den Ordner-Symbol auf dem Touchscreen klicken, bis der Ordner "Miltenyi" erscheint.
- Um den Modus zu wählen, klicken Sie auf den Aufwärts- oder Abwärtspfeil, bis die Dissoziation Modus 37C_h_TDK_2 markiert ist. Die Hülsen des benchtop Gewebe Dissociator werden als Positionen auf der Anzeige der Vorrichtung dargestellt. Wählen Sie die Positionen Proben laufen auf, indem sie auf dem Touchscreen klicken. Drücken Sie auf "Start", um den Modus laufen und fahren Sie mit Schritt 2.16.
HINWEIS: Je nach Art Tumor andere Dissoziation Programm könnte geeignet sein (siehe Schritt 2.7.1).
- Beachten Sie ein Fenster "Beendigung des Programms" auf dem Bildschirm. Nach Beendigung des Programms lösen C-Schlauch vom Benchtop Gewebe Dissociator.
- Inkubieren Probe 30 min bei 37° C unter kontinuierlicher Drehung, beispielsweise durch einen Rohr Rotator verwenden.
- Nach der Inkubation befestigen C Rohr den Kopf auf die Hülse des Benchtop Gewebe Dissociator. sicher wieder, dass das Probenmaterial in dem Bereich des Rotor / Stator befindet.
- Führen Sie das Programm Dissoziation h_tumor_02 (für weiche und mittel Tumoren) oder h_tumor_01 (für harte Tumoren), wie in Schritt 2.7.1 beschrieben.
- Nach Beendigung des Programms lösen C-Schlauch vom Benchtop Gewebe Dissociator.
- Inkubieren Probe 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation.
- Bringen Sie C-Schlauch der Oberseite nach unten auf die Hülse des Benchtop Gewebe Dissociator nach der Inkubation. sicher wieder, dass das Probenmaterial in dem Bereich des Rotor / Stator befindet.
- Führen Sie das Programm Dissoziation h_tumor_03 (für weiche Tumoren), h_tumor_02 (für mittlere Tumoren) oder h_tumor_01 (für harte Tumoren), wie in Schritt 2.7 beschrieben.
- So sammeln Sie führen das Probenmaterial auf dem Rohrboden eine short Zentrifugationsschritt (bei 100 xg für 10 sec).
- Resuspendieren der Zellen und gelten mit 70 & mgr; m nesh Größe einer Zelle Sieb auf einem 50 ml Röhrchen gegeben. Waschen Sie die Zelle Sieb mit 20 ml RPMI 1640 oder DMEM.
- Centrifuge Zellsuspension bei 300 g für 7 min. Überstand entfernen vollständig.
- Die Zellen werden in 5 ml Puffer zum Zählen. Fahren Sie mit dem Maus-Zell-Depletion durch magnetische Zellseparation (Abschnitt 3).
3. Maus-Zell-Depletion durch magnetische Zellseparationstechnik
HINWEIS: Volumes für magnetische Markierung unten angegeben sind für bis zu 2 x 10 6 Tumorzellen oder 10 7 Zellen insgesamt einschließlich der roten Blutkörperchen. In Abhängigkeit von der Größe des Tumors niedrigere oder höhere Zellzahlen erhalten wird. Bei weniger Zellen, verwenden die gleichen Mengen wie angegeben. Wenn höhere Zellzahlen unter Verwendung maßstabs alle Reagenzienvolumina und Gesamtvolumina entsprechend up (beispielsweise 4 x 10 6 Tumorzellen oder 2 x 10 4. Downstream-Analysen
HINWEIS: An diesem Punkt ist die Suspensionszell einer heterogenen Mischung von menschlichen Tumorzellen sowie Maus Stromazellen und Blutzellen besteht, einschließlich der roten Blutkörperchen. Die Zusammensetzung der Zellen hängt stark von Tumortyp und der Region für die Transplantation.
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HINWEIS: Wenn mit höheren Zellzahlen arbeiten bis zu 2,5 ml der Zellsuspension, die je 3,5 bis eine Spalte angewendet werden kann, zu Schritt hergestellt.
HINWEIS: Die Durchfluss enthält gereinigter menschlicher Tumorzellen.
HINWEIS: Vor der weiteren Downstream - Analysen durchgeführt wird , ein Teil der Zellen aus der Maus - Zell - Depletion Verfahren erhalten werden , können analysiert werden (zB beurteilen Reinheit und Ausbeute) in der Durchflusszytometrie.
HINWEIS: EpCAM ist als Tumorzellmarker jeder Tumortyp nicht geeignet. Für die Tumoren in dieser Studie EpCAM-Expression verwendet wurde, bekannt.
HINWEIS: Zusätzlich Zytometrie zu fließen, aus dem Trennverfahren erhaltenen Zellen können für weitere Tests in vitro kultiviert und verwendet werden.
HINWEIS: Je nach Tumorart Beschichtung, geeignet Aussaatdichte und Kultivierungsbedingungen unterscheiden können.
HINWEIS: Optimale Kulturbedingungen sind abhängig vom Tumortyp verwendet. Daher Kulturbedingungen geeignet für die Tumortyp gelten verwendet.
Anmerkung: Die verwendeten Antikörper für jeden Tumortyp nicht geeignet sind, wie EpCAM nicht auf Tumorzellen exprimiert werden könnte und / oder Vimentin auch durch die Tumorzellen exprimiert wird. Stellen Sie sicher, dass die verwendeten Antikörper für die Xenograft mo geeignet sinddel.
Representative Results
Unterschiedliche Ansätze wurden vorgeschlagen, Mauszellen von xenotransplantierten menschlichen Tumoren zu identifizieren oder zu führen, beispielsweise eine Kombination von Maus-spezifische Antikörper gegen CD45 und MHC Klasse I. jedoch nur Subpopulationen von Mauszellen nachgewiesen wurden diese Kombinationen verwendet, während die vorgeschlagene Kombination CD45 nachgewiesen und MHC - Klasse - I - Maus - Zellen, sowie den Rest der Mauszellen in Zielgeweben für die Transplantation gefunden (Abbildung 1). Unter Verwendung dieser neuartigen Kombination von Antikörpern für die magnetische Zellsortierung, könnte menschlichen Tumorzellen isoliert von Tumortyp unabhängigen werden (Abbildung 2).
Zellen aus magnetischen Zelltrennverfahren Basis erhalten Mauszellentfernung kann kultiviert werden, um reine Kulturen von humanen Tumorzellen (Abbildung 4) führt. Zusätzlich könnte lebensfähigen Zellen der Maus aus dem erhaltenen und kultiviert werden,gleiche Probe. Neben der Entfernung von Mauszellen wurde auch Ablagerungen auf Maus - Zell - Depletion (MCD) (Abbildung 3) entfernt wird .
Die umfassende Abreicherung von Mauszellen sowie Schmutzentfernung führen zu einer verbesserten molekularen Downstream-Analysen. Dies zeigte erhaltenen Ergebnisse aus ganzen Exoms Sequenzierung (WES) durchgeführt auf Bulk - Tumorstücke und Maus - Zell - Depletion - Proben von drei verschiedenen Patienten stamm Xenograft Tumormodellen (Figuren 5 bis 9) zu vergleichen. Unsere Daten zeigen , dass die Entfernung von Mauszellen vor WES auf Xenograft Tumorproben durchführt , nicht nur signifikant die Gesamtmenge von Lesevorgängen erhöht (Abbildung 5) , sondern verringert auch erheblich die Anzahl der Host für das menschliche Bezugsgenom liest kartiert abgeleitet (6B). Da diese fälschlicherweise abgebildet Maus häufig mit SNP Berufung stören liest, beobachteten wir eine starke Reduktion von falsch vorhergesagtSNPs nach MCD (Figuren 7 - 8). Schließlich haben wir gezeigt, dass die in silico Entfernung von der Maus stamm liest durch Bioinformatik Methoden konnte nicht vollständig das experimentelle Verfahren ersetzen, da eine eindeutige sequenzbasierte Zuordnung zu der Ursprungsarten nicht möglich war, alle liest. Ferner ist die in - silico - Verfahren könnte nicht korrekt für die verbesserte Qualität und gleichzeitige höhere Lese Bedeckung der in vitro abgereicherten Proben (Abbildung 9).
Abbildung 1. ein Antikörper - Cocktail -Einsatzes aller Zellen der Maus über mehrere Organe 14. Screenings in mehreren Organen, einschließlich der Haut, Lunge, Gehirn, Niere und Skelettmuskulatur erkennen, durchgeführt wurden. Diese Organe stellen eine große Zielgewebe für die Xenotransplantation. Kombinationen wie diese Erkennung mouse CD45 und MHC-Klasse-I-Epitope wurden bereits verwendet, um Maus-Zellen nach der Xenotransplantation zu verarmen. Allerdings sind diese Marker-Kombinationen nur eine Untergruppe von Zellen der Maus in allen untersuchten Geweben erkannt. In früheren Screenings eine Kombination von fünf Antikörper wurde für die umfassende Detektion aller Zellen aus Maus-Herkunft identifiziert ermöglicht. Dieses beinhaltet auch den roten Blutkörperchen und ist unabhängig von dem Ursprungsgewebe (A, B, und Daten nicht gezeigt). Geändert von 14. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Zuverlässige und schnelle Depletion von Mauszellen 15. Konjugate des Antikörpers Kombination mit superpara nanoparticles wurden ein optimiertes Protokoll für die Depletion von Mauszellen aus menschlichen Tumorxenotransplantaten durch magnetische Zellsortierung ( - Magnetzellseparation) (A) zu entwickeln , verwendet. Dieses neuartige Protokoll zur Eliminierung von> 99% an kontaminierenden Zellen der Maus in weniger als 20 min, unabhängig von der Tumorart erlaubt. Zellfraktionen aus magnetischen Zelltrennverfahren erhalten wurden , wurden mit der pan-Maus - Antikörper - Cocktail und ein menschliches spezifischen Antikörper gegen CD326 (EpCAM) (B) bezeichnet. Geändert von 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Isolierung von humanen Glioblastomzellen. Maus - Zell - Depletion Kit wurde verwendet , um menschliche Glioblastomzellen aus adulten mous isolierene Gehirn. Während Dissoziation von neuralem Gewebe große Mengen an Ablagerungen wird gewöhnlich erzielt. MCDK depletes effizient toten Zellen und Trümmer, wie durch die graphische Darstellung der Zellgröße im Vergleich zu Zell Granularität gesehen. Mit diesem Konjugat - Cocktail, war es möglich , > 99% der verunreinigenden Mauszellen zu eliminieren und> 60% der Trümmer. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Depletion von Mauszellen Erleichtert Downstream Kulturen von menschlichen Tumorzellen 14. Maus - Fibroblasten häufig die Kultivierung von humanen Tumorzellen nach der Dissoziation von transplantierten Gewebe behindern oder zu heterogenen Kulturen führen. Fibroblasten attach und erweitern effizienter, wodurch Ziel c zuwachs ells. Dies stört in vitro Zellkultur - Assays (beispielsweise Arzneimittel Zytotoxizität Tests), da mathematische Korrektur für die Wirkung von kontaminierenden Mauszellen entsteht , ist unmöglich , in den meisten Fällen. Die negative (B) und positive Fraktionen (C) , nachdem die Maus - Zell - Depletion wurden für drei Tage fixiert und für eine Maus - Fibroblasten-spezifischen Marker (Vimentin) und die human-spezifischen Tumormarker CD326 (EpCAM) gefärbt. Als Kontrolle wurde der ursprüngliche Anteil ungetrennten Zellen (A) enthält , kultiviert und auch gefärbt. Selbst nach drei Tagen der Kultur, eine nahezu reine Population von humanen Tumorzellen wurde in der negativen Fraktion (B) beobachtet, während die unsortierten Fraktion (A) durch Fibroblasten fast bewachsen war. Nur ein geringer Teil der Zielzellen wurde auf die positive Fraktion (C) verloren. Geändert von 14.ge.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Ganze Exome Sequencing (WES) von Tumorproben Vor und nach der Maus - Zell - Depletion (MCD) 15. Wir haben WES auf drei verschiedenen Xenotransplantatmodellen aus menschlichen Niere, Lunge und Blasenkrebs , um die Auswirkungen von MCD auf zu bewerten die Qualität der Sequenzierungsdaten der nächsten Generation. DNA von Bulk-Tumor und von isolierten Tumorzellen nach Maus-Zell-Depletion wurde verwendet, um ein Exoms Capture Kit Exoms-Capture-Sequenzierungsbibliotheken zu erzeugen Anwendung. Für die Sequenzierung auf einem Desktop-Sequenzer Instrument, einem Desktop-Sequenzer Reagenzienkit 150 Zyklen wurde verwendet 75-bp zu erzeugen, gepaart-Ende liest. Ein signifikanter Anstieg (p <0,05) in Cluster-Dichte (A) sowie eine aveWut Anstieg der Lesezählungen von 33% (B) wurde für die Proben beobachtet von Mauszellen aufgebraucht, was auf eine verbesserte Probenqualität. Entsprechend ist eine starke Verminderung der Ablagerungen und toten Zellen auf MCD auch durch Durchflusszytometrie - Analyse nachgewiesen werden konnte (siehe Abbildung 3). Geändert von 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Maus - Zell - Depletion (MCD) Stark Reduziert die Anzahl der Irrtümlich Mapped Maus Liest nach Whole Exome Sequencing (WES) 15. Als Fänger - Oligonukleotide für die gezielte Anreicherung von Protein-kodierenden Sequenzen wurden verwendet , um auf das menschliche Genom auf Basis entworfen, eine erste Pre- Anreicherung von DNA-Fragmenten menschlichen Ursprungs from die Mischung von Maus- und menschlichen Zellen erwartet wurde. Um die Anzahl der Fänger-Oligonukleotide zu bewerten, die mit Maus-Genom-DNA-Kreuz hybridisieren könnten, führten wir BLAST-Suchen der einzelnen schnellen Erfassung Exoms Sonde gegen Maus-Genom. Die resultierenden wurden Ausrichtungsparameter verwendet, um mögliche Kreuzhybridisierung zu ermitteln. (.. Ausrichtung Länge, keine Mismatches, keine Lücken) In Abhängigkeit von den Auswahlschwellen, sagten wir voraus, eine Kreuzreaktivität von 5 - 10% der Fangsonden mit Maus-Transkripte (Daten nicht gezeigt). Nach dem Adapter Ausschnitt (trimmomatic V0.32 16), kartiert wir die liest aller Proben gegen Mensch und Maus - Genome (BWA v0.7.12 17) und bestimmt ihre vermeintlichen Herkunft auf der Grundlage der jeweiligen Ausrichtungsparameter (Linux - Shell, Kommandozeilen - Perl) (A). Ein Durchschnitt von 12% der aus bulk Tumorproben abgeleitet liest wurde auf Mauszellen zugeschrieben. Dieser Betrag könnte durch vorherige Erschöpfung der Mauszellen auf 0,3% reduziert werden (B 6B veranschaulicht die detaillierte Lesezuweisung aus der Xenotransplantat Blasenkrebs abgeleitet für bulk Tumor und isolierten menschlichen Tumorzellen. Geändert von 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. MCD stark reduziert die Anzahl der fälschlich Prognostizierte SNPs 15. Um die Auswirkungen der Maus zu bestimmen , liest das menschliche Genom kartiert, stellten wir fest , die Anzahl der predicted SNPs für die Xenotransplantat-Proben vor und nach der MCD. Da kein gesundes Gewebe zum Vergleich zur Verfügung stand, wurde ein SNP als eine Differenz zwischen der sequenzierten Probe und dem Referenzgenom (hg19) definiert. Nach dem Entfernen von doppelten liest, SNP und INDEL Berufung wurde 18 durchgeführt und in die Regionen von einem Exoms Capture Kit gezielt eingeschränkt. 63 ± 10% aller SNPs vorhergesagt für den Großtumorproben wurden nicht mehr erkannt , nachdem die Maus - Zell - Depletion, 18 ± 1% waren für die isolierten menschlichen Tumorzellen (A) spezifisch. Während erstere vor allem durch irrtümlich zugeordnet Maus verursacht wurden, liest die letztere schien aufgrund der höheren Lesezählungen erkannt werden und entsprechend höhere Abdeckung innerhalb der isolierten humanen Tumorzellproben. Dieser Effekt war auch sichtbar vorhergesagt INDELs (B). Geändert von 15. Bitte hier klicken um eine größere Version davon zu sehenZahl.
Abbildung 8. MCD verbessert die Prognose von High-impact SNPs 15. (A) Auswirkung der MCD auf SNP Vorhersage innerhalb eines Protein-kodierenden Exons des POLA1 Gen 19 veranschaulicht wird. Während fälschlicherweise abgebildet Maus eine Anzahl von fälschlicherweise vorausgesagt SNPs in der Masse Nierenkrebs Xenotransplantat verursacht liest, fehlten diese SNPs nach MCD. Darüber hinaus verbessert MCD auch die Vorhersage der high-impact SNPs. Zum Beispiel liest der Maus mit dem menschlichen Referenzgenom in der Tumorprobe bulk kartiert ergab die falsch vorhergesagte Zerstörung des Startcodons des GRIA3 Gen (B). Geändert von 15. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 9. In Silico Depletion von der Maus stamm Liest nicht vollständig I n - vitro - MCD 15 ersetzen. Die vorhergesagte liest der Maus Ursprungs zu sein wurden rechnerisch aus der Sequenzierungsdaten entfernt und SNP Berufung wurde wiederholt. Durch diesen Ansatz vorhergesagte Anzahl von SNPs für die Bulk - Tumorproben wurde von 63% auf 8,5% der Gesamtzahl der SNPs erheblich reduziert (vergleiche Figur 8). Dies könnte jedoch in silico - Ansatz nicht vollständig in vitro MCD ersetzen, insbesondere , wenn die verbesserte Probenqualität und die damit einhergehende Erhöhung der Lesezählungen und Abdeckung betrachtet. Geändert von 15."_blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Wir haben eine schnelle und einfache Methode entwickelt, um unberührte menschliche Tumorzellen aus xenografted Tumorgewebe isolieren. Dieses Verfahren basiert auf der umfassenden Depletion von Zellen von Maus-Ursprung durch automatisierte Gewebedissoziation Vereinigen und magnetische Zellsortierung. Neben Erschöpfung aller Mauszellen auch die Menge an toten Zellen und Trümmer in der Zielzellfraktion deutlich reduziert. Zusammengenommen, ist dieses Verfahren wesentlich verbessert Molekular Downstream-Analysen und Kultivierung von humanen Tumorzellen.
Im Gegensatz zu alternativen Verfahren ist es nicht erforderlich, nach Wissen der Tumorzellen-spezifischen Markern, die Anpassung an Zusammensetzungen Mauszellen oder Schaffung von Algorithmen variiert. Die vorgestellte Methode ist unabhängig von der Mausstamm und Tumorart. Daher wird eine Vorspannung durch Isolierung von humanen Tumor - Subpopulationen auf der Grundlage von einzelnen menschlichen spezifischen Markern , die in der Expression kann variieren, wie für EpCAM 11 gezeigt ist avoided. Darüber hinaus ist es nicht auf Tumormaterial beschränkt, sondern kann für jede Art von xenotransplantierten Gewebe verwendet werden, wie Mauszellen anstelle von spezifischen menschlichen Tumor Subpopulationen ausgerichtet sind (Daten nicht gezeigt).
Comprehensive Entfernung von Mauszellen wird durch gezielte Oberflächen Epitope erleichtert ausschließlich auf Zellen von Maus-Ursprung exprimiert wird. Neben dem etablierten Verfahren zur Tumor Dissoziation wie in dieser Studie präsentierten, gibt es viele Verfahren unter Verwendung verschiedener Arten von Enzymen. Erhaltung der Zelloberflächen-Epitope ist eine Voraussetzung für dieses neue Verfahren, sondern auch für die genaue Analyse von humanen Tumorzellpopulationen. Daher ist es entscheidend, dass die schonende Enzyme für die Verdauung von Tumorgewebe verwendet werden. Somit kann Maus-Zell-Depletion nur in Kombination mit enzymatischen Verdau Verfahren verwendet werden, die offenbar nicht Epitope während Maus-Zell-Depletion Verfahren gezielt beeinflussen. Im Zweifelsfall kann dies nur durch den jeweiligen Hersteller überprüft werden.
Entfernen von Mauszellen verbessert signifikant die Kultur von menschlichen Tumorzellen durch die Kultur überwuchern von Maus-Fibroblasten zu vermeiden. Darüber hinaus ist die Analyse der menschlichen Tumorxenografte von Next-Generation-Sequenzierung deutlich verbessert und standardisiert. Da dieser Effekt beobachtet wurde, obwohl eine gezielte menschliche sequenzspezifische Auswahl wurde bei Exoms Anreicherung durchgeführt worden, der Einfluss auf die gesamte Genom und ganze Transkriptom-Sequenzierung wird erwartet, dass noch mehr im Vordergrund.
Darüber hinaus erleichtert das vorgestellte Verfahren accurate molekulare Untersuchungen von Tumor Subpopulationen innerhalb xenotransplantiert menschlichen Tumoren. Entfernen von Mauszellen aus einer entsprechenden Probe in dem ersten Schritt und anschließend Zellen menschlichen Tumor in zwei verschiedenen Subpopulationen ermöglicht den direkten Vergleich molekularer des Tumors Subpopulation von Interesse für menschlichen bulk Tumorzellen 20 zu sortieren. Differentielle Genexpression zwischen Tumorzellsubtypen kann mehr zuverlässig beurteilt, da sie nicht durch Kreuzhybridisierung von Maus-abgeleitete Moleküle beeinflusst wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
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