Summary
Menneske tumorxenotransplantater er vaskularisert og infiltrert av celler i mus opprinnelse i løpet av vekstfasen in vivo. For å omgå den skjevhet forårsaket av disse forurensende cellene under nedstrøms analyse, har vi utviklet en metode som åpner for omfattende nedbryting av alle museceller ved magnetisk cellesortering.
Abstract
Bruk av in vitro cellelinje modeller for kreftforskning har vært et nyttig verktøy. Imidlertid har det vist seg at disse modellene ikke klarer å etterligne en pålitelig måte pasient tumorer i forskjellige analyser 1. Menneske tumorxenotransplantater representerer gullstandarden i forhold til tumorbiologi, medisiner, og metastase forskning 2-4. Tumorxenografter kan være avledet fra forskjellige typer av materiale som tumorcellelinjer, tumorvevet fra primære tumorer pasient 4 eller i serie transplanterte tumorer. Når formert in vivo, blir xenopodet vev infiltrert og vaskularisert av celler av mus opprinnelse. Flere faktorer slik som tumor enhet, opphavet til xenopodet materiale, veksthastighet og området for transplantasjon påvirke sammensetningen og mengden av museceller som er tilstede i tumorxenografter. Men selv når disse faktorer holdes konstante, graden av musecelle forurensning er svært variabel.
Contaminating museceller vesentlig forringe nedstrøms analyser av menneskelige tumorxenotransplantater. Som musefibroblastere viser høy plating efficacies og spredning priser, har de en tendens til å overgrow kulturer av humane tumorceller, spesielt sakte voksende subpopulasjoner. Mus celle-avledet DNA, mRNA og proteinkomponenter kan forspenningen nedstrøms genekspresjonsanalyser, neste generasjons sekvensering, så vel som proteom analyse 5. For å overvinne disse begrensningene, har vi utviklet en rask og enkel metode for å isolere urørt humane tumorceller fra xenopodet svulstvev. Denne fremgangsmåten er basert på omfattende nedbryting av celler av mus opprinnelse ved å kombinere automatiske vev dissosiasjon med den stasjonære maskiner vev dissociator og magnetisk cellesortering. Her viser vi at humane målceller kan være kan oppnås med en renhet høyere enn 96% i løpet av mindre enn 20 min uavhengig av tumortypen.
Introduction
Faste humane tumorer bestå av flere fysiologiske samt neoplastiske celletyper. De danner heterogene vev med komplekse biologiske strukturer. Biologiske prosesser som tumordannelse, progresjon og reaksjoner mot terapi er ennå ikke fullt ut forstått. In vitro cellekultur modeller representerer et nyttig verktøy for å studere og forstå tumorbiologi. De kan imidlertid bare delvis gjenspeile strukturer og prosesser som finnes i tumorvev. Pålitelige og stabile prekliniske humane tumormodeller er en forutsetning for utviklingen av anti-tumor medikamenter og terapier 4,6, så vel som for forståelse av tumorbiologi og interaksjonen mellom tumorceller og deres omgivelser.
Humane tumor xenograft modeller avledet fra primære pasientsvulster viser høye relasjoner til vevet opprinnelses om histologisk arkitektur, interaksjoner med mikro-miljø strukturer, metastatisk potensial og svar på narkotika 7 in vitro-cellekulturmodeller. Disse funksjonene gjør dem gullstandarden for prekliniske modeller 4. Foruten sin søknad i kreftforskning, er xenotransplantasjon av humane celler i mus også hyppig brukt i stamcelleforskning for å bestemme stemness og differensiering potensialet for en målgruppen 8.
Det er blitt vist at human mikrovaskulaturen og humane immunceller blir erstattet ved in vivo-formering av humane tumorer 2,9. Faktorer som svulsten subtype, vekst, og regionen transplantasjon ha store konsekvenser for det globale nivået av infiltrasjon, samt sammensetningen av musecelletyper funnet. Men selv når disse faktorer holdes konstant, er mengden og sammensetningen av museceller er svært variabel.
Nedstrøms analyser av xenopodet vev er ofte utfordret av celler av murine opprinnelse. Primære kulturer av humane tumorceller fra xenografts er ofte overgrodd av fibroblaster. Dessuten hindrer dannelsen av tumorcellelinjer in vitro, er nedstrøms assays slik som legemiddel cytotoksisitetstesting eller farmakokinetikk forspent siden i silico korreksjon for virkningene som stammer fra forurensende museceller er umulig i de fleste tilfeller. Utover det, bare delvis belyst krysstale mellom mus fibroblaster og humane tumorceller har en direkte innvirkning på eksperimentelle resultater av studier 10. Videre er den mest uforutsigbare variasjoner av infiltrerende museceller forverrer nøyaktige molekylære nedstrøms analyser. I NGS eller proteom- analyserer hver mus-avledet signalet som måles i stedet for en human svulst signal direkte sekvensering minsker følsomheten. Også microarray baserte uttrykk analyser blir utfordret av murine NUCLeic syrer muligens krysshybridiserende menneskelige sonder.
For å omgå hindringer av forurensende museceller i nedstrøms analyser av humane tumorceller fra xenograft-modeller forskjellige tilnærminger har vært foreslått. I mange studier ønskede målceller for nedstrøms analyse er isolert ved å bruke markører eller kombinasjoner av markører utelukkende uttrykt på humane tumorceller. Men mangelen på pålitelige markører for positiv identifikasjon av humane tumorceller ofte representerer et stort hinder. Selv grovt uttrykt markører, for eksempel EpCAM på menneskelige karsinom, ofte viser tumor iboende uttrykks forskjeller 11. Dette øker risikoen for at lav som uttrykker subpopulasjoner, for eksempel tumorceller gått epitelial-til-mesenchymale overgang, går tapt under isolering. I tillegg kan den direkte binding av et seleksjonsmiddel til målcellen påvirke de etterfølgende analyseresultater. Forsøk på å tappe museceller vedved hjelp av en kombinasjon av antistoffer som er spesifikke for muse-CD45 og MHC-klasse I-epitoper er også gjort 12. Men denne markøren kombinasjonen registrerer bare en undergruppe av museceller. En annen tilnærming er å forbedre analyseprosessene ved bruk av programvare. Likevel, alle disse metodene er enten ikke er egnet for alle typer eksperimentelle oppsettet eller for noen svulst enhet og transplantasjon metode.
I denne studien presenterer vi en ny og rask metode for omfattende tappe museceller fra xenopodet vev uavhengig av musestamme og vev av opprinnelse. I screenings på flere mål organer og vev for transplantasjon av xenografter (inkludert hud, lunge, hjerne, nyre og skjelettmuskulatur) var vi i stand til å identifisere en kombinasjon av antistoffer som åpner for omfattende å påvise museceller. Disse antistoffene ble koblet til superparamagnetiske partikler, titrert og optimalisert for tømming ved hjelp av magnetisk cellesortering. Som eneste muse spesifikkantistoffer blir brukt, humane målceller bo "urørt", og fremgangsmåten er ikke begrenset til xenotransplanted tumorvev. Vi viser at omfattende fjerne museceller fra xenopodet tumorprøver standardiserer og forenkler kulturer av humane tumorceller. Videre viser vi at analysen av humane tumorxenografter av neste generasjon sekvensering er betydelig forbedret. Slik det ble observert denne virkning selv om en human sekvens bestemt valg er blitt utført i løpet av exome berikelse, blir innvirkningen på hele genomet, og hele transkriptomet sekvensering forventes å være enda mer fremtredende. Tatt sammen, fjerning av museceller ved hjelp av denne nye fremgangsmåte muliggjør dyrking av humane tumorceller, og i vesentlig grad forbedrer nedstrøms analyser av humane tumorxenografter.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til lokale etiske og juridiske retningslinjer Regierungspräsidium Freiburg Referat 35.
1. Reagensforberedelse
MERK: Før du starter forsøket, forberede følgende reagenser fra dissosiasjon kit:
- For å fremstille enzymet H oppløse hver ampulle av lyofilisert pulver i 3 ml RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) eller Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM). For å unngå gjentatt frysing og tining fremstille egnede alikvoter (f.eks, 200 mL) og lagre dem ved - 20 ° C i opptil 6 måneder.
- For å fremstille enzymet R oppløse ampullen av lyofilisert pulver i 2,7 ml RPMI eller DMEM-medium. For å unngå gjentatt frysing og tining fremstille egnede alikvoter (f.eks, 100 ul) og lagres ved - 20 ° C i opptil 6 måneder.
- For å forberede enzym A oppløse vial av lyofilisert pulver i 1 ml av buffer A som leveres med settet uten virvling. For å unngå gjentatt frysing og tining tilberede egnede porsjoner og lagre dem ved (f.eks, 25 ul.) - 20 ° C i opptil 6 måneder. Sørg for grundig blande denne suspensjonen umiddelbart før uttak av den nødvendige reaksjonsvolumet.
- Fremstille 250 ml buffer (1 x PBS med 0,5% BSA) for celleseparasjon fremgangsmåte og antistoff-farging.
MERK: Når dyrking celler etter fjerning av museceller filtrere alle buffere og enzymløsninger gjennom et 0,22 mikrometer filter.
2. Tumor Dissosiasjon Protocol
MERK: I denne studien pasient avledet xenografter av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), ble nedsatt kreft og blære brukes. Svulstene ble generert ved å implantere xenografter av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) nyrekreft og blære i 4 - 6 uker gammel kvinnelig NMRI nu / nu mus som beskrevet tidligere 13 MERK: Siden denne protokollen er helt uavhengig av tumortype, kan den brukes for alle typer av pasienter eller cellelinje-avledet tumor, så vel som andre typer av humant xenotransplanted vev uten modifisering av protokollen.
- Fremstille 5 ml fordøyelse blanding pr vevsprøven (opp til 1 g) ferskt ved tilsetning av 4,7 ml RPMI 1640 eller DMEM, 200 ul enzym H, 100 ul av enzym R, og 25 pl av enzym A inn i et cellulært dissosiasjon rør ( C Tube). Sørg for grundig blande enzymet R suspensjon før uttak ønsket volum.
- Offer dyrene ved halshugging under narkose. Desinfisere mus ved spraying med en liten mengde av 80% volum / volum etanol.
- Høste subkutan svulst fra mus kanten med tang og saks i en vev kultur hette. Kutt i huden åpen på plass av tumoren ved hjelp av en saks, og deretter skille tumoren fra tilstøtende friskt vev ved hjelp av tenger og sakser.
MERK: Avhengig av formålet medeksperimentet utføre denne og neste trinnene under aseptiske forhold. I denne studien ble alle trinn ble utført i en cellekultur hette under aseptiske forhold for å være i stand til å dyrke cellene. - Forbered tumorprøve for oppslutning ved å fjerne fett (da dette vil gjøre prøven flyte) og nekrotiske områder (som dette vil resultere i redusert levedyktighet) ved å klippe den bort ved hjelp av pinsett og skalpell. Finhakk vev i biter på 2 - 4 mm ved hjelp av skalpeller og tang.
- Overfør vevet brikker inn i C Tube inneholder fordøyelsen mix.
- Lukk C Tube og sørge for at det er tett lukket. Fest den opp ned på hylsen i Borstemmaskin vev dissociator og sørge for at vevet brikkene er plassert i området av rotoren / stator.
- Velg den modusen "h_tumor_01" ved å trykke "opp" eller "ned" knappen til modus vises i displayet, og deretter trykke på "Start" -knappen.
- Hvis dusynge oppvarming funksjon av Borstemmaskin vev dissociator, sørg for å også feste varmeapparatet. Deretter kjører modus 37C_h_TDK_1 (for myke svulster), 37C_h_TDK_2 (for middels svulster) eller 37C_h_TDK_3 (for harde svulster) ved å klikke på mappesymbolet på berøringsskjermen til mappen "Miltenyi" vises.
- For å velge modus, klikker du på pil opp eller ned til dissosiasjon modus 37C_h_TDK_2 er uthevet. Ermene på stasjonære maskiner vev dissociator er avbildet som posisjoner på displayet på enheten. Velg stillingene prøvene kjøres på ved å klikke dem på berøringsskjermen. Trykk på "start" for å kjøre modus og fortsette med trinn 2.16.
MERK: Avhengig av tumortype annen dissosiasjon program kan være egnet (se trinn 2.7.1).
- Observer et vindu som viser "Opphør av programmet" på skjermen. Etter avslutning av programmet, koble C Tube fra Borstemmaskin vev dissociator.
- Inkubere prøven i 30 minutter ved 37° C under kontinuerlig rotasjon, for eksempel ved hjelp av et rør rotator.
- Etter inkubasjon feste C Tube opp ned på hylsen i Borstemmaskin vev dissociator. Igjen sørge for at prøvematerialet er lokalisert i området av rotor / stator.
- Kjør dissosiasjon program h_tumor_02 (for myke og middels tumorer) eller h_tumor_01 (for harde tumorer) som beskrevet i trinn 2.7.1.
- Etter avslutning av programmet, koble C Tube fra Borstemmaskin vev dissociator.
- Inkubere prøven i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotasjon.
- Fest C Tube opp ned på hylsen i Borstemmaskin vev dissociator etter inkubasjon. Igjen sørge for at prøvematerialet er lokalisert i området av rotor / stator.
- Kjør dissosiasjon program h_tumor_03 (for myke tumorer), h_tumor_02 (for middels tumorer) eller h_tumor_01 (for harde tumorer) som beskrevet i trinn 2.7.
- For å samle prøvematerialet ved rørets nederste utføre en short sentrifugeringstrinn (ved 100 xg i 10 sek).
- Resuspender cellene og gjelder for et cellefilter med 70 um nesh størrelse er plassert på et 50 ml rør. Vask cellefilter med 20 ml RPMI 1640 eller DMEM.
- Sentrifuger cellesuspensjon ved 300 x g i 7 min. Aspirer supernatanten helt.
- Resuspender celler i 5 ml buffer for telling. Fortsett med Mouse Cell Nedbryting av magnetisk celleseparasjon (§ 3).
3. Mouse Cell Nedbryting av Magnetic Cell Separation Technology
MERK: Volumene for magnetisk merking gitt nedenfor er for opptil 2 x 10 6 tumorceller eller 10 7 celler totalt inkludert røde blodlegemer. Avhengig av tumorstørrelse lavere eller høyere celletall vil bli oppnådd. Ved færre celler, bruker de samme volumene som angitt. Ved bruk av høyere celletall, skalere opp alle reagensvolumene og totale volumer tilsvarende (f.eks for 4 x 10 6 tumorceller eller 2 x 10 4. Nedstrøms Analyser
MERK: På dette tidspunkt cellesuspensjonen består av en heterogen blanding av humane tumorceller så vel som mus stromale og blodceller, inkludert røde blodlegemer. Sammensetningen av cellene avhenger sterkt av tumortype og region for transplantasjon.
</ Li>
MERK: Når det arbeides med høyere celletall opp til 2,5 ml cellesuspensjon som var fremstilt i henhold til trinn 3.5 kan påføres på en kolonne.
MERK: gjennomstrømning inneholder rensede humane tumorceller.
MERK: Før gjennomføring av ytterligere nedstrøms analyser, en del av celler oppnådd fra mus celleutarming prosedyre kan analyseres (f.eks vurdere renhet og utbytte) i flowcytometri.
MERK: EpCAM er ikke egnet som tumorcellemarkør i alle tumortypen. For svulstene brukt i denne studien EpCAM-ekspresjon ble kjent.
MERK: I tillegg til flowcytometri, kan celler oppnådd fra separasjonsprosedyren bli dyrket og anvendt for videre analyser in vitro.
MERK: Avhengig av tumor type belegg, egnet seeding tetthet, og dyrkningsforhold kan variere.
MERK: Optimale dyrkningsbetingelser avhenge av tumortype som brukes. Derfor gjelder dyrkningsbetingelser som er egnet for tumortype som brukes.
Merk: De antistoffer som brukes er ikke egnet for en hvilken som helst tumor type som EpCAM ikke kan bli uttrykt på tumorceller og / eller vimentin er også uttrykt ved tumorcellene. Kontroller at antistoffer som brukes er egnet for xenograft model.
Representative Results
Forskjellige fremgangsmåter har vært foreslått for å identifisere eller utarme museceller fra xenopodet humane tumorer, for eksempel en kombinasjon av muse-spesifikke antistoffer mot CD45 og MHC klasse I. Imidlertid ble bare subpopulasjoner av museceller påvises ved hjelp av disse kombinasjoner, mens den foreslåtte kombinasjonen detektert CD45 og MHC klasse i uttrykkende museceller, så vel som resten av museceller som finnes i målvev for transplantasjon (figur 1). Ved å benytte denne nye kombinasjonen av antistoffer for magnetisk cellesortering, kan humane tumorceller isoleres uavhengig av tumortype (figur 2).
Celler erholdt fra magnetisk celleseparasjonsprosedyre basert på mus celle fjerning kan være dyrket, som fører til rene kulturer av humane tumorceller (figur 4). I tillegg kunne levedyktige museceller bli oppnådd og dyrket frasamme prøve. I tillegg til fjernelse av museceller, ble også rusk fjernet ved mus-celleutarming (MCD) (figur 3).
Den omfattende uttømming av museceller samt rusk fjerning føre til bedre molekylære nedstrøms analyser. Dette ble demonstrert ved å sammenligne resultatene fra hele exome sekvensering (WES) utført på bulk kreft stykker og musecelle utarmet prøver fra tre ulike pasient-avledet xenograft tumormodeller (figur 5 - 9). Våre data indikerer at fjerningen av museceller før det utføres WES på xenograft tumorprøver ikke bare øker signifikant den totale mengden av lyder (figur 5), men også i betydelig grad reduserer antallet verts avledet leser kartlagt til humant referanse genom (figur 6B). Som disse feilaktig kartlagt mus leser ofte i konflikt med SNP kall, observerte vi en sterk reduksjon av feilaktig spåddSNPs etter MCD (figur 7-8). Til slutt viste vi at i silico fjerning av mus-avledet leser av bioinformatikk metoder kunne ikke fullt ut erstatte den eksperimentelle prosedyren, som en entydig sekvens basert oppgave å arter av opprinnelse var ikke mulig for alle leser. Videre er det i silico fremgangsmåte kunne ikke er riktig for den forbedrede kvalitet og ledsagende høyere lese dekning av in vitro utarmet prøver (figur 9).
Figur 1. Etablering av et antistoff Cocktail Erkjennelsen Alle museceller over flere organer 14. Sikting i flere organer, inkludert hud, lunge, hjerne, nyre og skjelettmuskulatur, er blitt utført. Disse organene representerer store målet vev for xenotransplantasjon. Kombinasjoner som de anerkjenner mouse CD45 og MHC-klasse I-epitoper har allerede blitt brukt for å utarme museceller etter xenotransplantasjon. Men disse kombinasjonene markør gjenkjent bare et delsett av museceller i alle analyserte vev. I tidligere screenings en kombinasjon av fem antistoffer har blitt identifisert som åpner for omfattende testing av alle celler fra mus opprinnelse. Dette panel omfatter røde blodceller og er uavhengig av vevet sted (A, B, og data ikke vist). Modifisert fra 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. pålitelig og rask Nedbryting av museceller 15. Konjugater av antistoffet kombinasjon med superpara nanoparticles ble brukt til å utvikle en optimal protokoll for uttømming av museceller fra humane tumorxenografter ved magnetisk cellesortering (magnetisk celleseparasjons) (A). Denne nye protokoll er tillatt for eliminering av> 99% av forurensende museceller i løpet av mindre enn 20 minutter, uavhengig av tumortypen. Celle fraksjoner oppnådd fra magnetisk celleseparasjonsprosedyre ble merket med pan-mus-antistoff cocktail og en human spesifikt antistoff mot CD326 (EpCAM) (B). Modifisert fra 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Isolering av human glioblastom celler. Mouse Cell Nedbryting Kit ble brukt til å isolere mennesker glioblastom celler fra voksne mouse hjernen. Under dissosiasjon av neuralt vev høye mengder av avfall er ofte generert. MCDK utarmer effektivt døde hudceller og rusk som sett av tomten som viser cellestørrelse versus celle detalj. Med denne konjugat cocktail, var det mulig å eliminere> 99% av forurensende museceller og> 60% av vrakrestene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Nedbryting av museceller Forenkler Nedstrøms Kulturer av humane tumorceller 14. Muse fibroblaster ofte hemme dyrking av humane tumorceller etter dissosiasjon av transplanterte vevet eller føre til heterogene kulturer. Fibroblaster feste og utvide mer effektivt, og dermed gjengroing mål c alen. Dette perturbs in vitro cellekulturanalyser (f.eks narkotika cytotoksisitet testing), siden matematisk korreksjon for effekter som følge av forurensende museceller er umulig i de fleste tilfeller. Den negative (B) og positive fraksjoner (C) etter mus celle uttømming ble dyrket i tre dager, faste og farget for en mus-spesifikke fibroblast markør (vimentin) og den menneskelige spesifikke svulst markør CD326 (EpCAM). Som en kontroll ble den opprinnelige fraksjon inneholdende useparerte celler (A) ble dyrket og farget som i tillegg. Selv etter tre dagers dyrking, ble en nesten ren populasjon av humane tumorceller ble observert i den negative fraksjon (B), mens den usorterte fraksjon (A) var nesten overgrodd av fibroblaster. Bare en mindre del av målceller ble tapt til den positive fraksjon (C). Modifisert fra 14.ge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Hele Exome Sequencing (WES) av tumorprøver før og etter Mouse Cell Nedbryting (MCD) 15. Vi har utført WES på tre forskjellige xenograft modeller som stammer fra menneskelig nyre, lunge og blærekreft for å vurdere effekten av MCD på kvaliteten på neste generasjons sekvensering av data. DNA fra bulk tumor og fra isolerte kreftceller etter mus celle uttømming ble brukt til å generere exome-fanget sekvense bibliotekene søker en exome fangst kit. For sekvensering på en stasjonær sequencer instrument, en stasjonær sequencer reagenssett 150 sykluser, ble brukt til å generere 75-bp parvise end leser. En betydelig økning (p <0,05) i klynge tetthet (A) samt en average økning i lese tellinger av 33% (B) ble observert for prøvene utarmet på museceller, hvilket indikerer forbedret prøvekvalitet. Tilsvarende er en sterk reduksjon av avfall og døde celler ved MCD kan også bli demonstrert ved strømningscytometri-analyse (se figur 3). Modifisert fra 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Mouse Cell Nedbryting (MCD) Sterkt Reduserer Antall Feilaktig Kartlagt Mouse Leser etter Whole Exome Sequencing (WES) 15. Som fange oligonukleotider som brukes for målrettet anrikning av protein-kodende sekvenser ble utformet basert på det menneskelige genom, en innledende pre- berikelse av DNA-fragmenter av human opprinnelse from blandingen av mus og humane celler var forventet. For å vurdere antall fange oligonukleotider som kan kryss hybridiserer med musen genomisk DNA, gjennomførte vi BLAST søk til hver enkelt rask fangst exome probe mot musegenomet. De resulterende justeringsparametre ble anvendt for å bestemme mulig kryss-hybridisering. (.. Justering lengde, ingen av uoverensstemmelser, ingen hull) Avhengig av valg terskler, spådde vi en kryssreaksjon på 5 - 10% av fangst prober med muse transkripsjoner (data ikke vist). Etter adapter klipping (trimmomatic v0.32 16), kartlagt vi leser av alle prøvene mot menneskelige og mus genomer (BWA v0.7.12 17) og bestemt deres antatte opprinnelse basert på de respektive justeringsparametere (Linux shell, kommandolinje Perl) (A). Et gjennomsnitt på 12% av lesninger hentet fra bulk tumorprøver ble tilskrevet museceller. Dette beløpet kan bli redusert til 0,3% etter forhånds uttømming av museceller (B Figur 6B er et eksempel på detaljerte lese oppdraget for bulk tumor og isolerte humane tumorceller avledet fra blærekreft xenograft. Modifisert fra 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. MCD sterkt reduserer antall Feilaktig Forut SNPs 15. For å fastslå effekten av musen leser kartlagt til det menneskelige genom, bestemt vi antall predicted SNPs for xenograft prøver før og etter MCD. Da ingen friskt vev var tilgjengelig for sammenligning, ble en SNP definert som en forskjell mellom den sekvensert prøven og referansen genomet (hg19). Etter fjerning av duplikat leser, ble SNP og Indel kall gjennomført 18 og var begrenset til regionene målrettet av en exome fangst kit. 63 ± 10% av alle SNP forutsagt for bulktumorprøver ble ikke lenger detekteres etter mus celleutarming, 18 ± 1% var spesifikke for de isolerte humane tumorceller (A). Mens det tidligere var i hovedsak forårsaket av feilaktig kartlagt musen leser sistnevnte så ut til å bli oppdaget på grunn av høyere lesetall og følgelig høyere dekning innenfor de isolerte humane tumorcelleprøver. Denne effekten var også synlig for spådd INDELs (B). Modifisert fra 15. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.
Figur 8. MCD Forbedrer Prediksjon av High impact SNPs 15. (A) Effekt av MCD på SNP prediksjon innenfor en proteinkodende exon av POLA1 gen 19 er eksemplifisert. Mens feilaktig kartlagt mus leser forårsaket en rekke feilaktig spådd SNPs i bulk nyrekreft xenograft ble disse SNPs savnet etter MCD. I tillegg MCD også forbedret prediksjon av høy effekt SNPs. For eksempel, leser mus kartlagt til det humane genom referanse i bulk tumorprøven resulterte i urette forutsagte ødeleggelse av startkodonet av GRIA3 gen (B). Modifisert fra 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
s = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figur 9. I Silico Nedbryting av mus-avledet Leser Kan ikke fullt ut erstatte jeg n Vitro MCD 15. Den leser spådd å være av mus opprinnelse ble beregnings fjernet fra sekvensering av data, og SNP kall ble gjentatt. Med denne løsning antall SNP forutsagt for bulktumorprøver ble vesentlig redusert fra 63% til 8,5% av det totale antall SNP (sammenlign med figur 8). Men dette i silico tilnærmingen kan ikke helt erstatte in vitro MCD, særlig hvis den forbedrede prøvekvalitet og den medfølgende økning i lese tellinger og dekningen er vurdert. Modifisert fra 15."_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Vi har utviklet en rask og enkel metode for å isolere urørt humane tumorceller fra xenopodet tumorvev. Denne fremgangsmåten er basert på omfattende nedbryting av celler av mus opprinnelse ved å kombinere automatiske vev dissosiasjon og magnetisk cellesortering. Foruten uttømming av alle museceller også mengden av døde celler og rusk er betydelig redusert i målcellen fraksjon. Til sammen denne metoden forbedrer molekylære nedstrøms analyser og dyrking av humane tumorceller.
I motsetning til andre metoder, er det ikke behov for kjennskap til tumorcelle spesifikke markører, tilpasning til varierende sammensetninger av museceller eller etablering av algoritmer. Den presenterte fremgangsmåten er uavhengig av musestamme og tumortype. Derfor er en skjevhet ved isolering av humane tumor subpopulasjoner på grunnlag av enkle humane spesifikke markører som kan variere i uttrykk, slik som vist for EpCAM 11, er å unngåed. Videre er det ikke begrenset til tumor materiale, men kan brukes for alle slags xenotransplanted vev som museceller er rettet i stedet for spesifikke humane tumor subpopulasjoner (data ikke vist).
Omfattende fjerning av museceller lettes ved å målrette overflate epitoper utelukkende uttrykt på celler av mus opprinnelse. Bortsett fra den veletablert metode for tumor dissosiasjon som vist i denne studien, er det mange prosedyrer ved anvendelse av forskjellige typer enzymer. Bevaring av celleoverflate-epitoper er en forutsetning for denne nye fremgangsmåte, men også for nøyaktige analyser av humane tumorcellepopulasjoner. Derfor er det viktig at milde enzymer benyttes for fordøyelsen av tumorvev. Således kan mus celleutarming bare brukes i kombinasjon med enzymatiske fordøyelse prosedyrer som tydeligvis ikke påvirker epitoper rettet i løpet av mus-celleutarming prosedyre. I tvilstilfeller kan dette bare være bekreftet av den respektive produsenten.
Fjerning av museceller forbedrer kulturen i humane tumorceller ved å unngå kultur overgrow muse fibroblaster. I tillegg er analysen av humane tumorxenografter etter neste generasjons sekvense betydelig forbedret og standardisert. Slik det ble observert denne virkning selv om en målrettet human sekvens-spesifikke valg er blitt utført i løpet av exome berikelse, blir innvirkningen på hele genomet, og hele transkriptomet sekvensering forventes å være enda mer fremtredende.
Dessuten letter det presenteres metoden Accurate molekylære studier av svulst subpopulasjoner innenfor xenotransplanted humane tumorer. Fjerning av museceller fra en respektiv prøve i det første trinn og deretter sortering av humane tumorceller i to forskjellige subpopulasjoner muliggjør direkte molekylær sammenligning av tumor subpopulasjon av interesse for humane tumorceller bulk 20. Differential gene expression mellom tumorcelle subtyper kan mer pålitelig måte bedømmes som det ikke er påvirket av kryss-hybridisering av muse-avledede molekyler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
References
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494 (2013).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
- Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
- Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
- Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
- Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
- Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , AACR. (2014).
- Agorku, D., et al. Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , AACR. (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
- Robinson, J. T., et al.
- Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).
