Summary
मानव ट्यूमर xenografts vascularized और vivo में विकास के चरण के दौरान माउस मूल की कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ कर रहे हैं। बहाव के विश्लेषण के दौरान इन contaminating कोशिकाओं की वजह से पूर्वाग्रह को नाकाम करने के लिए, हम एक विधि चुंबकीय सेल छँटाई द्वारा सभी माउस कोशिकाओं की व्यापक कमी की अनुमति के लिए विकसित की है।
Abstract
कैंसर अनुसंधान के लिए इन विट्रो सेल लाइन मॉडल के उपयोग के लिए एक उपयोगी उपकरण किया गया है। हालांकि, यह दिखाया गया है कि इन मॉडलों को मज़बूती से अलग assays 1 में मरीज के ट्यूमर की नकल करने में विफल। मानव ट्यूमर xenografts ट्यूमर जीव विज्ञान, दवाओं की खोज, और मेटास्टेसिस अनुसंधान 2-4 के संबंध में सोने के मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं। ट्यूमर xenografts ट्यूमर सेल लाइनों, प्राथमिक रोगी ट्यूमर 4 या क्रमानुसार प्रत्यारोपित ट्यूमर से ट्यूमर के ऊतक की तरह सामग्री के विभिन्न प्रकार से प्राप्त किया जा सकता है। जब इन विवो में प्रचारित, xenografted ऊतक घुसपैठ और माउस मूल की कोशिकाओं द्वारा vascularized है। इस तरह के ट्यूमर इकाई के रूप में कई कारकों xenografted सामग्री, विकास दर और प्रत्यारोपण के क्षेत्र की मूल संरचना और ट्यूमर xenografts में मौजूद माउस कोशिकाओं की मात्रा को प्रभावित करती है। हालांकि, यहां तक कि जब इन कारकों स्थिर रखा जाता है, माउस सेल संदूषण की डिग्री अत्यधिक चर रहा है।
सहntaminating माउस कोशिकाओं में काफी मानव ट्यूमर xenografts के बहाव के विश्लेषण के ख़राब। माउस fibroblasts उच्च चढ़ाना efficacies और प्रसार दरों शो के रूप में, वे मानव ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृतियों ऊंचा हो जाना, विशेष रूप से धीरे धीरे उप-जनसंख्या proliferating करते हैं। माउस सेल व्युत्पन्न डीएनए, mRNA, और प्रोटीन घटकों कर सकते हैं पूर्वाग्रह बहाव के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, साथ ही proteome विश्लेषण 5। इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम xenografted ट्यूमर के ऊतक से अछूता मानव ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक तेज और आसान तरीका विकसित किया है। यह प्रक्रिया माउस मूल की कोशिकाओं की व्यापक कमी पर benchtop ऊतक dissociator और चुंबकीय सेल छँटाई के साथ स्वचालित ऊतक हदबंदी के संयोजन के द्वारा आधारित है। यहाँ, हम मानव लक्ष्य कोशिकाओं हो सकता है कि कम से कम 20 मिनट के ट्यूमर के प्रकार के स्वतंत्र भीतर के साथ purities अधिक से अधिक 96% प्राप्त किया जा सकता प्रदर्शित करता है।
Introduction
ठोस मानव ट्यूमर कई शारीरिक के साथ-साथ नवोत्पादित प्रकार की कोशिकाओं से मिलकर बनता है। वे जटिल जैविक संरचनाओं के साथ विषम ऊतकों के रूप में। ट्यूमर गठन, प्रगति की तरह जैविक प्रक्रियाओं और उपचार की दिशा में प्रतिक्रियाओं अभी तक पूरी तरह समझ नहीं रहे हैं। इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल का अध्ययन करने और ट्यूमर जीव विज्ञान को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, वे केवल आंशिक रूप ढांचे और प्रक्रियाओं ट्यूमर ऊतकों में पाया दर्पण कर सकते हैं। विश्वसनीय और स्थिर preclinical मानव ट्यूमर मॉडल विरोधी ट्यूमर दवाओं और चिकित्सा 4,6 के विकास के लिए और साथ ही ट्यूमर जीव विज्ञान और ट्यूमर कोशिकाओं और उनके पर्यावरण की बातचीत को समझने के लिए एक शर्त है।
मानव ट्यूमर जेनोग्राफ्ट प्राथमिक मरीज के ट्यूमर से निकाली गई मॉडल उच्च दवाओं से 7 सूक्ष्म पर्यावरण संरचनाओं, मेटास्टेटिक क्षमता और प्रतिक्रियाओं के साथ ऊतकीय वास्तुकला के बारे में मूल के ऊतकों को संबंधों, बातचीत दिखाने इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल की तुलना में दिखा सबसे assays में उच्च वैधता। इन सुविधाओं के लिए उन्हें preclinical मॉडल 4 के सोने के मानक हैं। कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में अपने आवेदन इसके अलावा, चूहों में मानव कोशिकाओं की xenotransplantation भी बार बार स्टेम सेल अनुसंधान के क्षेत्र में एक लक्षित जनसंख्या 8 की stemness और भेदभाव क्षमता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
ऐसा नहीं है कि मानव microvasculature दिखाया गया है और मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं मानव ट्यूमर 2,9 के vivo प्रचार पर प्रतिस्थापित कर रहे हैं। इस तरह के ट्यूमर उप प्रकार, विकास दर, और प्रत्यारोपण के क्षेत्र के रूप में कारक घुसपैठ की वैश्विक स्तर पर प्रमुख प्रभाव के रूप में अच्छी तरह के रूप में पाया माउस प्रकार की कोशिकाओं की संरचना की है। हालांकि, यहां तक कि जब इन कारकों स्थिर रखा जाता है, राशि और माउस कोशिकाओं की संरचना अत्यधिक चर रहे हैं।
xenografted ऊतकों के बहाव के विश्लेषण अक्सर murine मूल की कोशिकाओं द्वारा चुनौती दी है। xenografts से मानव ट्यूमर कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों अक्सर fibroblasts द्वारा ऊंचा हो जाता है। इन विट्रो में ट्यूमर सेल लाइनों की पीढ़ी में बाधा इसके अलावा, ऐसी दवा cytotoxicity परीक्षण या फार्माकोकाइनेटिक्स के रूप में नीचे की ओर assays से माउस कोशिकाओं को दूषित ज्यादातर मामलों में असंभव है होने वाले प्रभाव के लिए सिलिको सुधार के बाद से पक्षपाती हैं। इसके अलावा, केवल आंशिक रूप से elucidated माउस fibroblasts और मानव ट्यूमर कोशिकाओं के बीच परस्पर बात अध्ययनों से 10 की प्रयोगात्मक परिणामों पर सीधा प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, माउस कोशिकाओं में घुसपैठ की सबसे व्यापक रूप से अप्रत्याशित बदलाव सटीक आणविक बहाव के विश्लेषण aggravates। NGS या proteome में प्रत्येक माउस व्युत्पन्न संकेत एक मानव ट्यूमर के संकेत के बजाय मापा विश्लेषण सीधे अनुक्रमण संवेदनशीलता कम हो जाती है। इसके अलावा माइक्रोएरे आधारित अभिव्यक्ति विश्लेषण murine NUC ने चुनौती दी हैleic एसिड मानव जांच करने के लिए संभवतः पार hybridizing।
आदेश में मानव ट्यूमर कोशिकाओं के बहाव के विश्लेषण जेनोग्राफ्ट मॉडल से अलग अलग दृष्टिकोण प्रस्तावित किया गया है में माउस कोशिकाओं contaminating की बाधाओं को दरकिनार करने में। कई अध्ययनों में नीचे की ओर विश्लेषण के लिए वांछित लक्ष्य कोशिकाओं मार्कर या मार्कर के संयोजन विशेष रूप से मानव ट्यूमर कोशिकाओं पर व्यक्त उपयोग के द्वारा अलग कर रहे हैं। बहरहाल, मानव ट्यूमर कोशिकाओं के सकारात्मक पहचान के लिए विश्वसनीय मार्कर की कमी अक्सर एक बड़ी बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। ऐसे मानव कार्सिनोमा पर EpCAM के रूप में भी मोटे तौर पर व्यक्त मार्कर, अक्सर ट्यूमर आंतरिक अभिव्यक्ति मतभेद 11 दिखा। यह जोखिम है कि कम व्यक्त उप-जनसंख्या, जैसे, ट्यूमर कोशिकाओं से गुजरा उपकला करने वाली mesenchymal संक्रमण, अलगाव के दौरान खो रहे हैं बढ़ जाती है। इसके अलावा, लक्ष्य सेल करने के लिए एक चयन एजेंट के प्रत्यक्ष बाध्यकारी बाद के विश्लेषण के परिणामों को प्रभावित कर सकता है। द्वारा माउस कोशिकाओं घट का प्रयासmurine CD45 और MHC वर्ग मैं epitopes के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के संयोजन का उपयोग भी 12 बनाया गया है। हालांकि, इस मार्कर संयोजन केवल माउस कोशिकाओं के एक सबसेट का पता लगाता है। एक और दृष्टिकोण सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण की प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए है। फिर भी, इन सभी दृष्टिकोणों या तो प्रयोगात्मक स्थापना के किसी भी प्रकार के ट्यूमर या किसी भी इकाई और प्रत्यारोपण विधि के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
इस अध्ययन में हम व्यापक माउस तनाव और मूल के ऊतकों की स्वतंत्र xenografted ऊतकों से माउस कोशिकाओं घट के लिए एक उपन्यास और तेज तरीका मौजूद है। एकाधिक लक्ष्य अंगों और xenografts (त्वचा, फेफड़े, मस्तिष्क, गुर्दे और कंकाल की मांसपेशी सहित) के प्रत्यारोपण के लिए ऊतकों पर स्क्रीनिंग में हम व्यापक माउस कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अनुमति एंटीबॉडी का एक संयोजन की पहचान करने में सक्षम थे। ये एंटीबॉडी, superparamagnetic कणों को मिलकर titrated और चुंबकीय सेल छँटाई का उपयोग करके कमी के लिए अनुकूलित किया गया। के रूप में केवल माउस के विशिष्टएंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं, मानव लक्ष्य कोशिकाओं "अछूता" रहने के लिए और विधि xenotransplanted ट्यूमर के ऊतक तक सीमित नहीं है। से xenografted ट्यूमर के नमूनों का मानकीकरण और मानव ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृतियों की सुविधा हम उस व्यापक हटाने माउस कोशिकाओं प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, हम बताते हैं कि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा मानव ट्यूमर xenografts के विश्लेषण में काफी सुधार हुआ है। हालांकि एक मानव अनुक्रम विशिष्ट चयन exome संवर्धन के दौरान बाहर किया गया है जैसा कि इस प्रभाव देखा गया, पूरे जीनोम और पूरे transcriptome अनुक्रमण पर प्रभाव भी अधिक महत्वपूर्ण होने की उम्मीद कर रहे हैं। साथ में ले ली, इस उपन्यास विधि का उपयोग माउस कोशिकाओं को हटाने मानव ट्यूमर कोशिकाओं की खेती की सुविधा और काफी मानव ट्यूमर xenografts के बहाव के विश्लेषण में सुधार।
Protocol
सभी पशु प्रयोगों Regierungspräsidium फ्रीबर्ग Referat 35 के स्थानीय नैतिक और कानूनी दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।
1. अभिकर्मक तैयार
ध्यान दें: प्रयोग शुरू करने से पहले, हदबंदी किट से निम्नलिखित अभिकर्मकों तैयार:
- तैयार करने के लिए एंजाइम एच 1640 RPMI रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान 1640 (1640 RPMI) या Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 3 मिलीलीटर में lyophilized पाउडर के प्रत्येक शीशी भंग। 20 डिग्री सेल्सियस के लिए साइन अप करने के लिए 6 महीने - क्रम दोहराया ठंड से बचने और विगलन उपयुक्त aliquots (जैसे, 200 μl) तैयार करने और उन पर स्टोर करने के लिए।
- तैयार करने के लिए एंजाइम आर RPMI या DMEM माध्यम की 2.7 मिलीलीटर में lyophilized पाउडर की शीशी भंग। 20 डिग्री सेल्सियस के लिए साइन अप करने के लिए 6 महीने - क्रम दोहराया ठंड से बचने और विगलन उपयुक्त aliquots (जैसे, 100 μl) तैयार करने और उन पर स्टोर करने के लिए।
- एंजाइम एक तैयार करने के लिए वी भंगबफर के 1 मिलीलीटर में lyophilized पाउडर के ial vortexing बिना किट के साथ आपूर्ति की। (। उदाहरण के लिए, 25 μl) - अप करने के लिए 6 महीने के लिए 20 डिग्री सेल्सियस के क्रम दोहराया ठंड और विगलन उपयुक्त aliquots तैयार बचने के लिए और कम से उन्हें दुकान में। अच्छी तरह से अपेक्षित प्रतिक्रिया मात्रा वापस लेने से पहले तुरंत इस निलंबन मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें।
- 250 मिलीलीटर बफर (0.5% BSA के साथ 1x पीबीएस) सेल जुदाई प्रक्रिया और एंटीबॉडी धुंधला के लिए तैयार करें।
नोट: माउस कोशिकाओं को हटाने के बाद संवर्धन कोशिकाओं को एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सभी buffers और एंजाइम समाधान फ़िल्टर करते हैं।
2. ट्यूमर हदबंदी प्रोटोकॉल
नोट: इस अध्ययन गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) के रोगी व्युत्पन्न xenografts में, गुर्दे के कैंसर और मूत्राशय इस्तेमाल किया गया। 6 सप्ताह पुराने महिला NMRI परमाणु / परमाणु चूहों के रूप में पहले 13 में वर्णित - ट्यूमर 4 में (NSCLC) गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के xenografts गुर्दे के कैंसर और मूत्राशय दाखिल द्वारा उत्पन्न किया गया नोट: इस प्रोटोकॉल ट्यूमर के प्रकार के लिए पूरी तरह से स्वतंत्र है, यह प्रोटोकॉल के संशोधन के बिना रोगी या सेल लाइन व्युत्पन्न ट्यूमर के रूप में अच्छी तरह से मानव xenotransplanted ऊतक के अन्य प्रकार के किसी भी प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- (हौसले से एक सेलुलर हदबंदी ट्यूब में एंजाइम एच के 4.7 RPMI 1640 या DMEM के मिलीलीटर, 200 μl, एंजाइम आर के 100 μl, और एंजाइम ए के 25 μl जोड़कर (1 ग्राम तक) के ऊतक का नमूना प्रति पाचन मिश्रण के 5 मिलीलीटर की तैयारी सी ट्यूब)। अच्छी तरह से आवश्यक मात्रा वापस लेने से पहले एंजाइम आर निलंबन मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें।
- संज्ञाहरण के तहत ग्रीवा अव्यवस्था से जानवरों के बलिदान। 80% वी / वी इथेनॉल की छोटी राशि के साथ छिड़काव द्वारा माउस कीटाणुरहित।
- एक टिशू कल्चर हुड में संदंश और कैंची का उपयोग माउस ओर से फसल चमड़े के नीचे ट्यूमर। त्वचा ट्यूमर कैंची का उपयोग कर के स्थान पर खुले में कटौती और फिर संदंश और कैंची का उपयोग आसन्न स्वस्थ ऊतकों से ट्यूमर अलग।
नोट: के प्रयोजन के आधार परप्रयोग मम्मियाँ शर्तों के तहत इस और निम्न चरणों का प्रदर्शन। इस अध्ययन में सभी चरणों कोशिकाओं खेती करने के लिए सक्षम होने के लिए आदेश में सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में एक सेल संस्कृति हुड में किए गए। - वसा को हटाने (के रूप में यह कमी आई है व्यवहार्यता में परिणाम होगा) संदंश और एक छुरी का उपयोग कर इसे दूर काटने से और परिगलित क्षेत्रों (के रूप में इस नमूने नाव कर देगा) द्वारा digestions के लिए ट्यूमर नमूना तैयार करें। नलियां और संदंश का उपयोग करके 4 मिमी - 2 के टुकड़ों में ऊतक कीमा।
- में सी पाचन मिश्रण युक्त ट्यूब ऊतक टुकड़े स्थानांतरण।
- बंद सी ट्यूब और यकीन है कि यह कसकर बंद कर दिया जाता है। यह उल्टा benchtop ऊतक dissociator की आस्तीन पर देते हैं और सुनिश्चित करें कि ऊतक टुकड़े रोटर / स्टेटर के क्षेत्र में स्थित कर रहे हैं।
- "ऊपर" दबाने या "नीचे" बटन जब तक मोड प्रदर्शन में प्रकट होता है और उसके बाद "शुरू" बटन दबाकर मोड "h_tumor_01" चुनें।
- अगर आपbenchtop ऊतक dissociator की हीटिंग समारोह गाते हैं, यह भी हीटर संलग्न करने के लिए सुनिश्चित करें। तब तक फ़ोल्डर "Miltenyi" दिखाई देता है टचस्क्रीन पर फ़ोल्डर प्रतीक पर क्लिक करके मोड 37C_h_TDK_1 (मुलायम ट्यूमर के लिए), 37C_h_TDK_2 (मध्यम ट्यूमर के लिए) या 37C_h_TDK_3 (हार्ड ट्यूमर के लिए) चलाते हैं।
- मोड का चयन करने के लिए, ऊपर या नीचे तीर हदबंदी मोड 37C_h_TDK_2 प्रकाश डाला है जब तक क्लिक करें। benchtop ऊतक dissociator की आस्तीन डिवाइस के प्रदर्शन पर पदों के रूप में चित्रित कर रहे हैं। पदों के नमूने टचस्क्रीन पर क्लिक कर उन्हें पर चलाए जा रहे हैं चुनें। प्रेस मोड चलाने के लिए और कदम 2.16 के साथ जारी रखने के लिए "शुरू"।
नोट: ट्यूमर के प्रकार पर निर्भर करता है एक और हदबंदी कार्यक्रम उपयुक्त हो सकता है (कदम 2.7.1 देखें)।
- दिखा स्क्रीन पर "कार्यक्रम की समाप्ति" एक खिड़की का निरीक्षण करें। कार्यक्रम की समाप्ति के बाद, अलग benchtop ऊतक dissociator से सी ट्यूब।
- 37 पर 30 मिनट के लिए नमूना सेतेनिरंतर रोटेशन, जैसे तहत सी °, एक ट्यूब रोटेटर का उपयोग करके।
- ऊष्मायन के बाद benchtop ऊतक dissociator की आस्तीन पर संलग्न सी ट्यूब उल्टा। फिर यकीन है कि नमूना सामग्री रोटर / स्टेटर के क्षेत्र में स्थित है बनाते हैं।
- हदबंदी कार्यक्रम h_tumor_02 (मुलायम और मध्यम ट्यूमर के लिए) या h_tumor_01 (हार्ड ट्यूमर के लिए) चलाने के लिए कदम 2.7.1 में वर्णित है।
- कार्यक्रम की समाप्ति के बाद, अलग benchtop ऊतक dissociator से सी ट्यूब।
- निरंतर रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
- ऊष्मायन के बाद benchtop ऊतक dissociator की आस्तीन पर संलग्न सी ट्यूब उल्टा। फिर यकीन है कि नमूना सामग्री रोटर / स्टेटर के क्षेत्र में स्थित है बनाते हैं।
- हदबंदी कार्यक्रम h_tumor_03 (मुलायम ट्यूमर के लिए), h_tumor_02 (मध्यम ट्यूमर के लिए) या h_tumor_01 (हार्ड ट्यूमर के लिए) चलाने के लिए कदम 2.7 में वर्णित है।
- ट्यूब तल पर नमूना सामग्री इकट्ठा करने के लिए एक थानेदार प्रदर्शन(10 सेकंड के लिए 100 XG पर) आर टी centrifugation कदम।
- कोशिकाओं resuspend और 70 माइक्रोन Nesh आकार एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर रखा के साथ एक सेल झरनी के लिए लागू होते हैं। RPMI 1640 या DMEM के 20 मिलीलीटर के साथ सेल झरनी धो लें।
- 7 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन। महाप्राण पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला।
- गिनती के लिए बफर के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend। चुंबकीय सेल जुदाई (धारा 3) द्वारा माउस सेल कमी के साथ आगे बढ़ें।
चुंबकीय सेल जुदाई प्रौद्योगिकी द्वारा 3. माउस सेल कमी
नोट: चुंबकीय लेबलिंग के लिए नीचे दिए गए वॉल्यूम अप करने के लिए 2 एक्स 10 6 ट्यूमर कोशिकाओं या 10 7 लाल रक्त कोशिकाओं सहित कुल कोशिकाओं के लिए कर रहे हैं। ट्यूमर के आकार पर निर्भर करता है कम या अधिक सेल नंबर प्राप्त किया जाएगा। कम कोशिकाओं के मामले में, संकेत के रूप में एक ही मात्रा में उपयोग करें। उच्च सेल नंबर का उपयोग करते हैं, उसके अनुसार (सभी अभिकर्मक मात्रा और कुल मात्रा के लिए पैमाने पर जैसे, 4 x 10 6 ट्यूमर कोशिकाओं या 2 एक्स 10 के लिए 4. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण
नोट: इस बिंदु सेल निलंबन मानव ट्यूमर कोशिकाओं के एक विषम मिश्रण के होते हैं और साथ ही लाल रक्त कोशिकाओं सहित माउस stromal और रक्त कोशिकाओं, पर। कोशिकाओं की संरचना जोरदार प्रत्यारोपण के लिए ट्यूमर के प्रकार और इस क्षेत्र पर निर्भर करता है।
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नोट: जब सेल निलंबन के 2.5 मिलीलीटर कि अनुसार तैयार किया गया था कदम करने के लिए 3.5 एक स्तंभ के लिए लागू किया जा सकता करने के लिए उच्च सेल नंबर के साथ काम कर रहे हैं।
नोट: प्रवाह के माध्यम से शुद्ध मानव ट्यूमर सेल शामिल हैं।
नोट: आगे बहाव के विश्लेषण से बाहर ले जाने से पहले, माउस सेल कमी प्रक्रिया से प्राप्त कोशिकाओं का एक हिस्सा विश्लेषण किया जा सकता प्रवाह में cytometry (जैसे, पवित्रता और उपज का आकलन)।
नोट: EpCAM किसी भी ट्यूमर के प्रकार के ट्यूमर सेल मार्कर के रूप में उपयुक्त नहीं है। इस अध्ययन EpCAM अभिव्यक्ति में इस्तेमाल ट्यूमर के लिए जाना जाता था।
नोट: प्रवाह cytometry के अलावा, जुदाई प्रक्रिया से प्राप्त कोशिकाओं सुसंस्कृत और इन विट्रो में आगे assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
ध्यान दें: ट्यूमर के प्रकार कोटिंग, उपयुक्त बोने घनत्व पर निर्भर करता है, और खेती की स्थिति अलग कर सकते हैं।
नोट: इष्टतम संस्कृति की स्थिति ट्यूमर का इस्तेमाल किया प्रकार पर निर्भर करते हैं। इसलिए, ट्यूमर इस्तेमाल किया प्रकार के लिए उपयुक्त संस्कृति शर्तें लागू होती हैं।
नोट: के रूप में EpCAM ट्यूमर कोशिकाओं और / या vimentin पर व्यक्त नहीं किया जा सकता है भी ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की है इस्तेमाल किया एंटीबॉडी किसी भी ट्यूमर के प्रकार के लिए उपयुक्त नहीं हैं। सुनिश्चित करें कि इस्तेमाल किया एंटीबॉडी जेनोग्राफ्ट मो के लिए उपयुक्त हैं बनाओडेल।
Representative Results
अलग अलग दृष्टिकोण CD45 और MHC वर्ग मैं हालांकि, माउस कोशिकाओं के ही उप-जनसंख्या इन संयोजनों का उपयोग जबकि प्रस्तावित संयोजन CD45 का पता चला पाया गया खिलाफ माउस विशिष्ट एंटीबॉडी का एक संयोजन उदाहरण के लिए, xenografted मानव ट्यूमर से माउस कोशिकाओं की पहचान या व्यय करना प्रस्तावित किया गया है और MHC वर्ग मैं माउस कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में माउस प्रत्यारोपण के लिए लक्ष्य ऊतकों में पाया कोशिकाओं के बाकी व्यक्त (चित्रा 1)। चुंबकीय सेल छँटाई के लिए एंटीबॉडी के इस उपन्यास संयोजन का उपयोग, मानव ट्यूमर कोशिकाओं को ट्यूमर के प्रकार (चित्रा 2) के स्वतंत्र अलग किया जा सकता है।
चुंबकीय सेल जुदाई प्रक्रिया के आधार पर माउस सेल हटाने से प्राप्त कोशिकाओं संवर्धित किया जा सकता है, मानव ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 4) का शुद्ध संस्कृतियों के लिए अग्रणी। इसके अलावा, व्यवहार्य माउस कोशिकाओं प्राप्त की और से संवर्धित किया जा सकता हैएक ही नमूना। माउस कोशिकाओं को हटाने इसके अलावा, यह भी मलबे माउस सेल कमी (एमसीडी) (चित्रा 3) पर हटा दिया गया था।
माउस कोशिकाओं की व्यापक कमी के साथ ही आणविक बहाव के विश्लेषण में सुधार करने के लिए मलबे को हटाने का नेतृत्व। इस पूरे exome अनुक्रमण (वेस) से प्राप्त परिणामों के तीन अलग-अलग रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट ट्यूमर मॉडल (- 9 आंकड़े 5) से थोक ट्यूमर के टुकड़े और माउस सेल समाप्त नमूनों पर किए गए तुलना द्वारा प्रदर्शन किया गया। हमारे आंकड़ों से संकेत मिलता है कि जेनोग्राफ्ट ट्यूमर के नमूनों पर वेस प्रदर्शन से पहले माउस कोशिकाओं को हटाने की न केवल काफी (चित्रा 5) पढ़ता है की कुल राशि बढ़ जाती है, लेकिन यह भी काफी कम कर देता मेजबान की संख्या निकाली गई मानव जीनोम संदर्भ (चित्रा 6B) के लिए मैप पढ़ता है। के रूप में इन ग़लती से मैप किया माउस अक्सर एसएनपी फोन के साथ हस्तक्षेप पढ़ता है, हम झूठा भविष्यवाणी की एक मजबूत कमी मनायाSNPs एमसीडी के बाद (आंकड़े 7 - 8)। अंत में, हम पता चला है कि माउस व्युत्पन्न की सिलिको में हटाने, जैव सूचना विज्ञान तरीकों से पढ़ता पूरी तरह से प्रयोगात्मक प्रक्रिया की जगह नहीं कर सकता है के रूप में मूल के प्रजातियों के लिए एक स्पष्ट अनुक्रम आधारित काम संभव नहीं था सब पढ़ता के लिए। इसके अलावा, सिलिको प्रक्रिया में कर सकते थे बढ़ाया गुणवत्ता और इन विट्रो समाप्त नमूनों की सहवर्ती उच्च पढ़ें कवरेज (9 चित्रा) के लिए सही नहीं है।
चित्रा 1. एक एंटीबॉडी कॉकटेल त्वचा, फेफड़े, मस्तिष्क, गुर्दे और कंकाल की मांसपेशी सहित कई अंगों में कई अंगों 14। चोकर भर में सभी माउस कोशिकाओं को स्वीकार स्थापना, प्रदर्शन किया गया है। इन अंगों xenotransplantation के लिए प्रमुख लक्ष्य ऊतकों प्रतिनिधित्व करते हैं। ऐसे लोगों को पहचानने समझौता ज्ञापन के रूप में युग्मएसई CD45 और MHC वर्ग मैं epitopes पहले ही आदेश xenotransplantation के बाद माउस कोशिकाओं ख़ाली में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन मार्कर संयोजन सभी का विश्लेषण ऊतकों में माउस कोशिकाओं का केवल एक सबसेट को मान्यता दी। पिछले स्क्रीनिंग में पांच एंटीबॉडी का एक संयोजन माउस मूल से सभी कोशिकाओं के व्यापक पता लगाने के लिए अनुमति पहचान की गई है। इस पैनल में लाल रक्त कोशिकाओं में शामिल हैं और मूल के ऊतक से स्वतंत्र है (ए, बी, और नहीं दिखाया डेटा)। 14 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. माउस कोशिकाओं के विश्वसनीय और तेजी से कमी 15। Superparamagnetic एन के साथ एंटीबॉडी संयोजन के conjugatesanoparticles चुंबकीय सेल छँटाई (चुंबकीय सेल जुदाई) (ए) द्वारा मानव ट्यूमर xenografts से माउस कोशिकाओं की कमी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इस उपन्यास प्रोटोकॉल कम से कम 20 मिनट में माउस कोशिकाओं contaminating के> 99% के उन्मूलन के लिए अनुमति दी है, ट्यूमर के प्रकार की परवाह किए बगैर। चुंबकीय सेल जुदाई प्रक्रिया से प्राप्त सेल अंशों अखिल माउस एंटीबॉडी कॉकटेल और CD326 (EpCAM) के खिलाफ एक मानव विशिष्ट एंटीबॉडी (बी) के साथ लेबल रहे थे। 15 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. मानव ग्लयोब्लास्टोमा कोशिकाओं के अलगाव। माउस सेल कमी किट वयस्क समझौता ज्ञापनों से मानव glioblastoma कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाई मस्तिष्क। मलबे के तंत्रिका ऊतक उच्च मात्रा की हदबंदी के दौरान आमतौर पर उत्पन्न होता है। MCDK कुशलता से मृत कोशिकाओं और मलबे के रूप में सेल विघटन बनाम सेल आकार दिखा साजिश के द्वारा देखा depletes। इस साधना कॉकटेल के साथ, इसे खत्म करने के दूषित माउस कोशिकाओं के> 99% और मलबे के> 60% संभव था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. माउस कोशिकाओं की कमी मानव ट्यूमर कोशिकाओं 14 के डाउनस्ट्रीम संस्कृतियों की सुविधा। माउस fibroblasts अक्सर प्रत्यारोपित ऊतकों की हदबंदी के बाद मानव ट्यूमर कोशिकाओं की खेती में बाधा या विषम संस्कृतियों के लिए सीसा। Fibroblasts देते हैं और अधिक कुशलता का विस्तार है, जिससे overgrowing लक्ष्य ग एल। यह इन विट्रो सेल संस्कृति assays (जैसे, दवा cytotoxicity परीक्षण) में perturbs, क्योंकि माउस कोशिकाओं को दूषित ज्यादातर मामलों में असंभव है से उत्पन्न होने वाले प्रभाव के लिए गणितीय सुधार। नकारात्मक (बी) और सकारात्मक भिन्न (सी) माउस सेल कमी के बाद तीन दिन तय हो गई है और एक माउस-विशिष्ट fibroblast मार्कर (vimentin) और मानव विशिष्ट ट्यूमर मार्कर CD326 (EpCAM) के लिए दाग के लिए सुसंस्कृत थे। एक नियंत्रण के रूप में, मूल अंश unseparated कोशिकाओं से युक्त (ए) सुसंस्कृत था और साथ ही दाग। यहाँ तक कि संस्कृति के तीन दिनों के बाद, मानव ट्यूमर कोशिकाओं के एक लगभग शुद्ध आबादी, नकारात्मक अंश (बी) में मनाया जबकि अवर्गीकृत अंश (ए) fibroblasts द्वारा लगभग ऊंचा हो गया था। केवल लक्ष्य कोशिकाओं की एक नाबालिग भाग सकारात्मक अंश (सी) के लिए खो गया था। 14 से संशोधित।ge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. पूरे exome अनुक्रमण ट्यूमर के नमूनों की (वेस) पहले और माउस सेल कमी (एमसीडी) के बाद 15। हम आदेश पर दिल्ली नगर निगम के प्रभाव का आकलन करने के लिए तीन अलग-अलग जेनोग्राफ्ट मानव गुर्दे, फेफड़े और मूत्राशय के कैंसर से निकाली गई मॉडल पर वेस आयोजित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता। थोक ट्यूमर से और माउस सेल कमी के बाद अलग-थलग ट्यूमर कोशिकाओं से डीएनए exome कब्जा कर लिया अनुक्रमण एक exome कब्जा किट लागू करने के पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक डेस्कटॉप sequencer साधन, एक डेस्कटॉप sequencer अभिकर्मक किट 150 चक्र पर अनुक्रमण के लिए, उत्पन्न करने के लिए 75-बीपी बनती अंत पढ़ता उपयोग किया गया था। एक उल्लेखनीय वृद्धि (पी <0.05) क्लस्टर घनत्व में (ए) के रूप में अच्छी तरह से एक एवेन्यू33% (बी) के पढ़ने मायने में क्रोध वृद्धि नमूने माउस कोशिकाओं के समाप्त के लिए मनाया गया, नमूना गुणवत्ता में सुधार का संकेत है। तदनुसार, एमसीडी पर मलबे और मृत कोशिकाओं की एक मजबूत कमी भी प्रवाह cytometry विश्लेषण के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है (चित्रा 3 देखें)। 15 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6 माउस सेल कमी (एमसीडी) जोरदार कम कर देता है ग़लती से मैप माउस की संख्या पूरे exome अनुक्रमण (वेस) के बाद 15 पढ़ता है। के रूप में कब्जा प्रोटीन कोडिंग दृश्यों के लक्षित संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स मानव जीनोम, एक प्रारंभिक पूर्व के आधार पर डिजाइन किए गए थे मानव मूल fr के डीएनए टुकड़े के संवर्धनओम माउस और मानव कोशिकाओं के मिश्रण की उम्मीद थी। आदेश पर कब्जा ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स है कि हो सकता है माउस जीनोमिक डीएनए के साथ पार संकरण की संख्या का आकलन करने के लिए, हम माउस जीनोम के खिलाफ प्रत्येक एकल तेजी से कब्जा exome जांच के विस्फोट तलाशी ली। जिसके परिणामस्वरूप संरेखण पैरामीटर संभव पार संकरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। (।। संरेखण लंबाई, कोई बेमेल है, कोई अंतराल के) चयन थ्रेसहोल्ड के आधार पर हम 5 का एक पार जेट भविष्यवाणी - माउस टेप के साथ कब्जा जांच का 10% (डेटा) नहीं दिखाया। एडाप्टर कतरन (trimmomatic v0.32 16) के बाद, हम मानव जीनोम और माउस के खिलाफ सभी नमूनों (बीडब्ल्यूए v0.7.12 17) की पढ़ता मैप किया और उनके ख्यात मूल संबंधित संरेखण मापदंडों के आधार पर चुना गया (लिनक्स खोल, कमांड लाइन पर्ल) (ए)। के थोक ट्यूमर के नमूनों से निकाली गई पढ़ता 12% की एक औसत माउस कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। यह राशि बी माउस कोशिकाओं की पूर्व कमी से 0.3% तक कम किया जा सकता है ( चित्रा 6B थोक ट्यूमर और पृथक मानव ट्यूमर कोशिकाओं मूत्राशय कैंसर जेनोग्राफ्ट से निकाली गई लिए विस्तृत पढ़ें काम एक मिसाल है। 15 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7. एमसीडी जोरदार झूठा अनुमानित SNPs 15 की संख्या कम कर देता। क्रम में माउस के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए मानव जीनोम के लिए मैप पढ़ता है, हम predicte की संख्या निर्धारित कीपहले और बाद एमसीडी जेनोग्राफ्ट नमूने के लिए डी SNPs। जैसा कि कोई स्वस्थ ऊतकों की तुलना के लिए उपलब्ध था, एक एसएनपी अनुक्रम नमूना और संदर्भ जीनोम (hg19) के बीच एक अंतर के रूप में परिभाषित किया गया था। डुप्लिकेट को हटाने के बाद पढ़ता है, एसएनपी और INDEL बुला 18 का आयोजन किया गया था और क्षेत्रों के एक exome कब्जा किट द्वारा लक्षित करने के लिए प्रतिबंधित किया गया था। सभी SNPs के 63 ± 10% थोक ट्यूमर के नमूनों नहीं रह माउस सेल कमी के बाद पता चला रहे थे, 18 ± 1% पृथक मानव ट्यूमर कोशिकाओं (ए) के लिए विशिष्ट थे के लिए भविष्यवाणी की। पूर्व मुख्य रूप से ग़लती से मैप किया माउस के कारण किया गया जबकि पढ़ता उत्तरार्द्ध में अधिक पढ़ें मायने रखता है और उसी के अनुसार उच्च कवरेज पृथक मानव ट्यूमर सेल के नमूने के भीतर के कारण का पता लगाया जा रहा था। इस आशय की भी भविष्यवाणी की indels (बी) के लिए दिखाई दे रहा था। 15 से संशोधित। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंचित्रा।
8 चित्रा एमसीडी उच्च प्रभाव की भविष्यवाणी SNPs 15 बढ़ाता है। (ए) एसएनपी भविष्यवाणी पर एमसीडी का प्रभाव POLA1 जीन 19 उदाहरण है की एक प्रोटीन कोडिंग एक्सॉन के भीतर। जबकि ग़लती से मैप किया माउस थोक गुर्दे के कैंसर जेनोग्राफ्ट में झूठा भविष्यवाणी SNPs की एक संख्या की वजह से पढ़ता है, इन SNPs एमसीडी के बाद याद कर रहे थे। इसके अलावा, एमसीडी भी की उच्च प्रभाव SNPs भविष्यवाणी में सुधार हुआ। उदाहरण के लिए, माउस थोक ट्यूमर नमूने में मानव जीनोम संदर्भ के लिए मैप पढ़ता GRIA3 जीन (बी) के शुरू होने से कोडोन का गलत तरीके से भविष्यवाणी की विनाश में हुई। 15 से संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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9 चित्रा के माउस व्युत्पन्न सिलिको रिक्तीकरण में पढ़ता है पूरी तरह से मैं n इन विट्रो एमसीडी 15 जगह नहीं कर सकते। The computationally अनुक्रमण डेटा से हटा दिया गया माउस मूल के होने की भविष्यवाणी पढ़ता है, और एसएनपी बुला दोहराया गया था। इस दृष्टिकोण से, SNPs की संख्या थोक ट्यूमर के नमूनों के लिए भविष्यवाणी की काफी SNPs की कुल संख्या के 8.5% से 63% से कम हो गया था (8 चित्रा के साथ तुलना)। हालांकि, सिलिको दृष्टिकोण में यह पूरी तरह से, इन विट्रो एमसीडी में जगह नहीं कर सकता है, खासकर अगर सुधार नमूना गुणवत्ता और पढ़ें मायने में सहवर्ती वृद्धि और कवरेज माना जाता है। 15 से संशोधित।"_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
हम xenografted ट्यूमर के ऊतक से अछूता मानव ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक तेज और आसान तरीका विकसित किया है। यह प्रक्रिया माउस मूल की कोशिकाओं की व्यापक कमी पर स्वचालित ऊतक हदबंदी और चुंबकीय सेल छँटाई के संयोजन से आधारित है। यह भी सभी माउस कोशिकाओं मृत कोशिकाओं और मलबे की राशि की कमी के अलावा काफी लक्ष्य सेल अंश में कम हो जाता है। साथ में ले ली, इस विधि काफी आणविक बहाव के विश्लेषण और मानव ट्यूमर कोशिकाओं की खेती में सुधार।
वैकल्पिक तरीकों के विपरीत, ट्यूमर सेल विशिष्ट मार्करों, माउस कोशिकाओं या एल्गोरिदम की स्थापना की रचनाओं अलग-अलग करने के लिए समायोजन के ज्ञान के लिए कोई जरूरत नहीं है। प्रस्तुत विधि माउस तनाव और ट्यूमर के प्रकार के स्वतंत्र है। इसलिए, एक मानव विशिष्ट मार्करों के आधार के रूप में EpCAM 11 के लिए दिखाया गया है जो अभिव्यक्ति में भिन्न हो सकते हैं, पर मानव ट्यूमर उप-जनसंख्या के अलगाव के माध्यम से एक पूर्वाग्रह, से बचनेईडी। इसके अलावा, यह ट्यूमर सामग्री तक ही सीमित नहीं है, बल्कि xenotransplanted ऊतक के किसी भी प्रकार के रूप में माउस कोशिकाओं विशिष्ट मानव ट्यूमर उप-जनसंख्या के बजाय लक्षित कर रहे हैं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया।
माउस कोशिकाओं के व्यापक हटाने सतह epitopes विशेष रूप से माउस मूल की कोशिकाओं पर व्यक्त लक्षित करने से मदद की है। इसके अलावा इस अध्ययन में प्रस्तुत के रूप में ट्यूमर हदबंदी के लिए अच्छी तरह से स्थापित विधि से, वहाँ कई प्रक्रियाओं एंजाइमों के विभिन्न प्रकार के प्रयोग कर रहे हैं। कोशिका की सतह epitopes के संरक्षण के इस उपन्यास विधि के लिए, लेकिन यह भी मानव ट्यूमर सेल आबादी का सटीक विश्लेषण के लिए एक शर्त है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि कोमल एंजाइमों ट्यूमर के ऊतक के पाचन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस प्रकार, माउस सेल कमी केवल enzymatic पाचन प्रक्रिया है कि जाहिर माउस सेल कमी प्रक्रिया के दौरान लक्षित epitopes को प्रभावित नहीं करते के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है। संदेह की स्थिति में यह केवल संबंधित निर्माता द्वारा सत्यापित किया जा सकता है।
माउस कोशिकाओं को हटाने में काफी माउस fibroblasts की संस्कृति ऊंचा हो जाना बचने के द्वारा मानव ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृति में सुधार। इसके अलावा, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा मानव ट्यूमर xenografts के विश्लेषण में काफी सुधार हुआ है और मानकीकृत है। हालांकि एक लक्षित मानव अनुक्रम विशिष्ट चयन exome संवर्धन के दौरान बाहर किया गया है जैसा कि इस प्रभाव देखा गया, पूरे जीनोम और पूरे transcriptome अनुक्रमण पर प्रभाव भी अधिक महत्वपूर्ण होने की उम्मीद कर रहे हैं।
इसके अलावा, प्रस्तुत विधि ACCURA की सुविधाxenotransplanted मानव ट्यूमर के भीतर ट्यूमर उप-जनसंख्या के ते आणविक अध्ययन करता है। पहले चरण में एक संबंधित नमूना से माउस कोशिकाओं को हटाने और बाद में दो अलग-अलग उप-जनसंख्या में मानव ट्यूमर कोशिकाओं छँटाई मानव थोक ट्यूमर कोशिकाओं को 20 के हित के ट्यूमर उप-जनसंख्या का सीधा आणविक तुलना में सक्षम बनाता है। ट्यूमर सेल उपप्रकार के बीच अंतर जीन अभिव्यक्ति अधिक मज़बूती से मूल्यांकन किया जा सकता है क्योंकि यह माउस व्युत्पन्न अणुओं के पार संकरण से प्रभावित नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
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