Summary
Xenoinjertos de tumores humanos son vascularizado y infiltrada por células de origen de ratón durante la fase de crecimiento in vivo. Para evitar el sesgo causado por estas células contaminantes durante el análisis de aguas abajo, hemos desarrollado un método que permite el agotamiento completo de todas las células de ratón mediante clasificación celular magnética.
Abstract
El uso de modelos de líneas celulares in vitro para la investigación del cáncer ha sido una herramienta útil. Sin embargo, se ha demostrado que estos modelos no para imitar de forma fiable los tumores de pacientes en diferentes ensayos 1. Xenoinjertos de tumores humanos representan el estándar de oro en relación con la biología del tumor, el descubrimiento de fármacos, y la investigación de metástasis 2-4. Xenoinjertos de tumores se pueden derivar de diferentes tipos de material como líneas de células tumorales, tejido tumoral de tumores de pacientes primarios de 4 o tumores en serie trasplantados. Cuando se propagan in vivo, el tejido xenoinjertado se infiltra y vascularizada por las células de origen murino. Múltiples factores tales como la entidad tumor, el origen del material xenoinjertado, tasa de crecimiento y la región de trasplante influyen en la composición y la cantidad de células de ratón presentes en xenoinjertos tumorales. Sin embargo, incluso cuando estos factores se mantienen constantes, el grado de contaminación de células de ratón es muy variable.
Contaminating células de ratón deterioran significativamente análisis aguas abajo de xenoinjertos de tumores humanos. Como fibroblastos de ratón muestran eficacias de alta chapado y las tasas de proliferación, tienden a crecer demasiado cultivos de células tumorales humanas, especialmente la proliferación de las subpoblaciones lentamente. De células de ratón deriva de ADN, ARNm y proteínas componentes pueden sesgar el análisis de la expresión génica aguas abajo, la secuenciación de próxima generación, así como el análisis del proteoma 5. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un método rápido y fácil de aislar las células tumorales humanas vírgenes de tejido tumoral xenoinjertado. Este procedimiento se basa en el agotamiento completo de las células de origen de ratón mediante la combinación de la disociación de tejido automatizado con el disociador tejido benchtop y clasificación de células magnético. Aquí, demostramos que las células diana humanas pueden ser puede ser obtenido con el grado de pureza mayor que 96% en menos de 20 min independiente del tipo de tumor.
Introduction
tumores humanos sólidos consisten en fisiológica múltiple, así como tipos de células neoplásicas. Ellos forman tejidos heterogéneos con estructuras biológicas complejas. Los procesos biológicos como la formación del tumor, la progresión y las respuestas hacia terapias aún no se comprenden totalmente. Modelos in vitro de cultivos celulares in representan una herramienta útil para estudiar y comprender la biología del tumor. Sin embargo, sólo pueden reflejar en parte estructuras y procesos que se encuentran en los tejidos tumorales. Modelos de tumores humanos preclínicos fiables y estables son un requisito previo para el desarrollo de fármacos anti-tumorales y terapias 4,6, así como para la comprensión de la biología del tumor y la interacción de células tumorales y su entorno.
Modelos de xenoinjerto de tumor humano derivadas de tumores primarios de pacientes muestran altas relaciones con el tejido de origen en relación con la arquitectura histológica, las interacciones con las estructuras micro-ambientales, potencial metastásico y las respuestas a los fármacos 7 de cultivo celular in vitro. Estas características los convierten en el estándar de oro de los modelos preclínicos 4 hacen. Además de su aplicación en la investigación del cáncer, el xenotrasplante de células humanas en ratones también se utiliza con frecuencia en la investigación de células madre para determinar el potencial stemness y diferenciación de una población objetivo 8.
Se ha demostrado que la microvasculatura humana y células del sistema inmune humana se sustituyen en la propagación in vivo de tumores humanos 2,9. Factores tales como el subtipo de tumor, la tasa de crecimiento, y la región del trasplante tienen un gran impacto en el nivel global de la infiltración, así como la composición de los tipos de células de ratón encontrado. Sin embargo, incluso cuando estos factores se mantienen constantes, la cantidad y la composición de las células de ratón son muy variables.
Los análisis de aguas abajo de los tejidos xenoinjertados a menudo son desafiados por las células de origen murino. Los cultivos primarios de células tumorales humanas de xenoinjertos son frecuentemente cubiertas por los fibroblastos. Además dificulta la generación de líneas de células tumorales in vitro, ensayos de aguas abajo como las pruebas de citotoxicidad de drogas o farmacocinética están sesgados ya que en la corrección silico para los efectos procedentes de la contaminación de las células de ratón no es posible en la mayoría de los casos. Más allá de eso, la diafonía sólo se ha dilucidado en parte entre los fibroblastos de ratón y células tumorales humanas tiene un impacto directo en los resultados experimentales de estudios 10. Por otra parte, la variación más ampliamente impredecible de la infiltración de células de ratón agrava los análisis moleculares precisos aguas abajo. En NGS o proteoma analiza cada señal derivada de ratón medido en lugar de una señal de tumor humano disminuye directamente la sensibilidad de secuenciación. También los análisis de microarrays de expresión basados son desafiados por nuc murinoácidos transoleicos de hibridación posiblemente cruz para sondas humanos.
Con el fin de eludir los obstáculos de la contaminación de las células de ratón en los análisis posteriores de las células tumorales humanas a partir de modelos de xenoinjertos se han propuesto diferentes enfoques. En muchos estudios de células diana deseadas para el análisis de aguas abajo están aisladas mediante la utilización de marcadores o combinaciones de marcadores expresados exclusivamente en células tumorales humanas. Sin embargo, la falta de marcadores fiables para la identificación positiva de las células tumorales humanas con frecuencia representa un gran obstáculo. Incluso marcadores expresados en términos generales, como EpCAM en carcinomas humanos, con frecuencia muestran diferencias de expresión intrínseca del tumor 11. Esto aumenta el riesgo de que las subpoblaciones que expresan bajos, por ejemplo, células tumorales sufrido epitelial a mesenquimal transición, se pierden durante el aislamiento. Además, la unión directa de un agente de selección a la célula diana podría influir en los resultados de análisis subsiguientes. Los intentos de ozono células de ratónusando una combinación de anticuerpos específicos para CD45 murino y de clase epítopos del MHC I también se han hecho 12. Sin embargo, esta combinación de marcadores sólo detecta un subconjunto de células de ratón. Otro enfoque consiste en mejorar los procesos de análisis por software. Sin embargo, todos estos enfoques no son ya sea adecuado para cualquier tipo de configuración experimental o para cualquier entidad tumoral y el método de trasplante.
En este estudio se presenta un método novedoso y rápido para el ozono exhaustivamente las células de ratón a partir de tejidos xenoinjertados independientes de la cepa y tejido de origen de ratón. En exámenes en varios órganos diana y tejidos para trasplante de xenoinjertos (incluyendo la piel, pulmón, cerebro, riñón y músculo esquelético) hemos sido capaces de identificar una combinación de anticuerpos que permiten para la detección de células de ratón exhaustivamente. Estos anticuerpos se acoplaron a partículas superparamagnéticas, se titularon y optimizados para el agotamiento mediante el uso de clasificación de células magnético. Ya que sólo de ratón concretose utilizan los anticuerpos, las células diana humanas permanecen "sin tocar" y el método no se limita a tejido tumoral xenotransplantado. Demostramos que las células de ratón exhaustivamente la eliminación de las muestras tumorales xenoinjertados estandariza y facilita cultivos de células tumorales humanas. Además, se muestra que el análisis de xenoinjertos de tumores humanos por secuenciación de próxima generación se mejora significativamente. Como se observó este efecto a pesar de una selección específica de secuencia humana se ha llevado a cabo durante el enriquecimiento del exoma, se espera que la influencia sobre todo el genoma y la secuenciación del transcriptoma todo para ser aún más prominente. Tomados en conjunto, la eliminación de las células de ratón que utilizan este nuevo método facilita el cultivo de células tumorales humanas y mejora significativamente los análisis de aguas abajo de xenoinjertos de tumores humanos.
Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices éticas y legales locales de Regierungspräsidium Freiburg Referat 35.
1. Preparación de los reactivos
NOTA: Antes de comenzar el experimento, se preparan los siguientes reactivos del kit de disociación:
- Para preparar la enzima H disolver cada vial del polvo liofilizado en 3 ml de RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) o medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Con el fin de evitar los ciclos de congelación y descongelación preparar alícuotas adecuadas (por ejemplo, 200 l) y almacenar a - 20 ° C durante un máximo de 6 meses.
- Para preparar la enzima R disolver el vial del polvo liofilizado en 2,7 ml de RPMI o DMEM medio. Con el fin de evitar los ciclos de congelación y descongelación preparar alícuotas adecuadas (por ejemplo, 100 l) y almacenar a - 20 ° C durante un máximo de 6 meses.
- Para preparar enzima A disolver el vial del polvo liofilizado en 1 ml de Tampón A suministrado con el kit sin agitación. Con el fin de evitar los ciclos de congelación y descongelación preparan alícuotas adecuadas y almacenar a (por ejemplo, 25 l.) - 20 ° C durante un máximo de 6 meses. Asegúrese de mezclar bien esta suspensión inmediatamente antes de retirar el volumen de reacción requerida.
- Preparar 250 ml de tampón (1x PBS con 0,5% de BSA) para el procedimiento de separación de células y la tinción de anticuerpos.
NOTA: Cuando el cultivo de células después de la eliminación de las células de ratón filtran todos los tampones y soluciones de enzimas a través de un filtro de 0,22 micras.
2. Tumor Protocolo de disociación
NOTA: En este estudio xenoinjertos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) derivados del paciente, se utilizaron cáncer renal y la vejiga. Los tumores se generaron mediante la implantación de xenoinjertos de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer renal vejiga en 4 - 6 semanas de edad nu / nu ratones NMRI como se describió anteriormente 13 NOTA: Como este protocolo es completamente independiente del tipo de tumor, que puede ser utilizado para cualquier tipo de paciente o tumor derivado de la línea celular, así como otros tipos de tejido xenotransplantado humano sin modificación del protocolo.
- Preparar 5 ml de la mezcla de digestión por muestra de tejido (hasta 1 g) recién mediante la adición de 4,7 ml de RPMI 1640 o DMEM, 200 l de enzima H, 100 l de enzima R, y 25 l de enzima A en un tubo de disociación celular ( C tubo). Asegúrese de mezclar bien la suspensión de la enzima R antes de retirar el volumen requerido.
- Sacrificar los animales por dislocación cervical bajo anestesia. Desinfectar ratón por pulverización con una pequeña cantidad de 80% v / v de etanol.
- tumor subcutáneo de la cosecha desde el flanco del ratón usando pinzas y tijeras en una campana de cultivo de tejidos. Cortar la piel abierta en lugar del tumor utilizando tijeras y luego separar el tumor del tejido sano adyacente uso de fórceps y tijeras.
NOTA: En función de la finalidad deel experimento realizar este y los siguientes pasos en condiciones asépticas. En este estudio, todos los pasos se llevaron a cabo en una campana de cultivo de células en condiciones asépticas con el fin de ser capaz de cultivar las células. - Preparar la muestra de tumor para digestiones mediante la eliminación de la grasa (ya que esto hará que el flotador de la muestra) y áreas de necrosis (ya que esto dará lugar a disminución de la viabilidad) cortando a la basura usando fórceps y un bisturí. Picar el tejido en trozos de 2 - 4 mm utilizando bisturís y pinzas.
- Transferir las piezas de tejido en el tubo C que contiene la mezcla de digestión.
- Cerrar el tubo C y asegúrese de que esté bien cerrado. Adjuntarlo al revés sobre el manguito del disociador de tejido de sobremesa y asegúrese de que las piezas de tejido se encuentran en la zona del rotor / estator.
- Elegir el modo "h_tumor_01" pulsando la tecla "arriba" o el botón "abajo" hasta que aparezca el modo en la pantalla y luego pulsando el botón "Inicio".
- Si tucantar la función de calentamiento del tejido disociador de sobremesa, asegúrese de adjuntar también el calentador. A continuación, ejecute el modo 37C_h_TDK_1 (para los tumores blandos), 37C_h_TDK_2 (para tumores medianos) o 37C_h_TDK_3 (para los tumores duros) haciendo clic en el símbolo de la carpeta en la pantalla táctil hasta que aparezca la carpeta "Miltenyi".
- Para elegir el modo, haga clic en la flecha hacia arriba o hacia abajo hasta que el modo de disociación se pone de relieve 37C_h_TDK_2. Las mangas de la disociador tejido de sobremesa se representan como posiciones en la pantalla del dispositivo. Elija las posiciones de las muestras se ejecutan en ellos haciendo clic en la pantalla táctil. Pulse el botón "Inicio" para ejecutar el modo y continúe con el paso 2.16.
NOTA: En función del tipo de tumor otro programa de disociación podría ser adecuado (vea el paso 2.7.1).
- Observar una ventana que muestra "Terminación del programa" en la pantalla. Después de la terminación del programa, separar C de metro del tejido disociador de sobremesa.
- Incubar la muestra durante 30 min a 37° C bajo rotación continua, por ejemplo, mediante el uso de un rotador de tubo.
- Después de la incubación adjuntar C tubo boca abajo en el manguito del disociador de tejido de sobremesa. Una vez más asegurarse de que el material de la muestra se encuentra en la zona del rotor / estator.
- Ejecutar el programa h_tumor_02 disociación (para los tumores blandos y medios) o h_tumor_01 (para los tumores duros) como se describe en el paso 2.7.1.
- Después de la terminación del programa, separar C de metro del tejido disociador de sobremesa.
- Incubar la muestra durante 30 min a 37 ° C bajo rotación continua.
- Adjuntar C tubo boca abajo en el manguito del disociador de tejido de sobremesa después de la incubación. Una vez más asegurarse de que el material de la muestra se encuentra en la zona del rotor / estator.
- Ejecutar el programa h_tumor_03 disociación (para los tumores blandos), h_tumor_02 (para tumores medianos) o h_tumor_01 (para los tumores duros) como se describe en el paso 2.7.
- Para recoger el material de muestra en la parte inferior del tubo realizar un shoetapa de centrifugación rt (a 100 xg durante 10 sec).
- Resuspender las células y se aplican a un filtro de células con 70 micras de tamaño nesh colocado en un tubo de 50 ml. Lavar el filtro de células con 20 ml de RPMI 1640 o DMEM.
- suspensión de células Centrifugar a 300 xg durante 7 min. Aspirar el sobrenadante por completo.
- Resuspender las células en 5 ml de tampón para el recuento. Proceder con el ratón de la célula agotamiento de la separación celular magnética (sección 3).
3. El agotamiento de la célula de ratón por tecnología de separación celular magnética
NOTA: Los volúmenes para el etiquetado magnética dan a continuación son para un máximo de 2 x 10 6 células tumorales o 10 7 células totales incluyendo las células rojas de la sangre. Dependiendo del tamaño del tumor el número de células más altos o más bajos se obtendrá. En el caso de un menor número de células, usar el mismo volumen como se indica. Cuando se utiliza el número de células superiores, ampliar todos los volúmenes de reactivos y volúmenes totales en consecuencia (por ejemplo, para 4 x 10 6 células tumorales o 2 x 10 4. Los análisis intermedios
NOTA: En este punto la suspensión de células consiste en una mezcla heterogénea de células tumorales humanas así como estromales de ratón y las células sanguíneas, incluyendo las células rojas de la sangre. La composición de las células depende en gran medida del tipo de tumor y de la región para el trasplante.
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NOTA: Cuando se trabaja con el número de células más altas de hasta 2,5 ml de suspensión celular que se preparó de acuerdo con el paso 3.5 se puede aplicar a una columna.
NOTA: El flujo a través contiene células tumorales humanas purificadas.
NOTA: Antes de llevar a cabo análisis adicionales aguas abajo, una parte de las células obtenidas de procedimiento de reducción de células de ratón se puede analizar (por ejemplo, evaluar la pureza y de rendimiento) en citometría de flujo.
NOTA: EpCAM no es adecuado como marcador de células del tumor de cualquier tipo de tumor. Para los tumores utilizadas en este estudio expresión EpCAM se conocía.
NOTA: Además de la citometría de flujo, las células obtenidas a partir del procedimiento de separación pueden ser cultivadas y se utiliza para más ensayos in vitro.
NOTA: En función del tipo de tumor recubrimiento, densidad de siembra adecuada, y las condiciones de cultivo pueden ser diferentes.
NOTA: condiciones de cultivo óptimas dependen del tipo de tumor usado. Por lo tanto, se aplican condiciones de cultivo adecuadas para el tipo de tumor usado.
Nota: Los anticuerpos utilizados no son adecuados para cualquier tipo de tumor como EpCAM no podría expresarse en las células tumorales y / o vimentina también se expresa por las células tumorales. Asegúrese de que los anticuerpos utilizados son adecuados para el mes de xenoinjertosdel.
Representative Results
Se han propuesto diferentes enfoques para identificar o agotar las células de ratón a partir de xenotransplantes de tumores humanos, por ejemplo, una combinación de anticuerpos específicos de ratón contra CD45 y MHC de clase I. Sin embargo, sólo se detectaron las subpoblaciones de células de ratón usando estas combinaciones, mientras que la combinación propuesta detectado CD45 y MHC de clase I que expresan las células de ratón, así como el resto de las células de ratón que se encuentran en los tejidos diana para el trasplante (Figura 1). Utilizando esta nueva combinación de anticuerpos para la clasificación de células magnético, las células tumorales humanas se podían aislar independiente del tipo de tumor (Figura 2).
Las células obtenidas a partir de la eliminación de células magnético de separación de células basada en el procedimiento de ratón podrían ser cultivadas, dando lugar a cultivos puros de células tumorales humanas (Figura 4). Además, las células de ratón viables se podrían obtener y cultivadas a partir de lamisma muestra. Además de la eliminación de las células de ratón, también los desechos se eliminó en el agotamiento de células de ratón (MCD) (Figura 3).
El agotamiento completo de las células de ratón, así como los desechos de plomo retirada a la mejora de los análisis moleculares aguas abajo. Esto se demostró mediante la comparación de los resultados obtenidos a partir de la secuenciación del exoma (WES) realizados sobre piezas de tumor a granel y muestras de células de ratón empobrecido a partir de tres diferentes modelos de xenoinjertos tumorales derivadas del paciente (Figuras 5 - 9). Nuestros datos indican que la eliminación de las células de ratón antes de realizar WES en muestras de tumores de xenoinjertos aumenta no sólo significativamente la cantidad total de lecturas (Figura 5) sino que también reduce considerablemente el número de anfitrión deriva lee mapeado en el genoma de referencia humana (Figura 6B). A medida que estos ratón erróneamente asignada lee con frecuencia interfiere con llamadas SNP, se observó una fuerte reducción del valor teórico falsamenteSNPs después de MCD (Figuras 7-8). Por último, hemos demostrado que la eliminación in silico del derivado de ratón lee por métodos bioinformáticos no podría reemplazar totalmente el procedimiento experimental, como una inequívoca asignación basada en la secuencia de la especie de origen no era posible que todas las lecturas. Además, el procedimiento en silico no pudo corregir por la calidad mejorada y una mayor cobertura de lectura concomitante de la in vitro muestras empobrecido (Figura 9).
Figura 1. El establecimiento de un cóctel de anticuerpos Reconociendo Todas las células de ratón a través de múltiples órganos 14. Proyecciones en múltiples órganos, incluyendo la piel, pulmón, cerebro, riñón y músculo esquelético, se han realizado. Estos órganos representan los principales tejidos diana para xenotrasplantes. Combinaciones tales como aquellos que reconocen mouSE CD45 y de clase epítopos del MHC I ya se han utilizado con el fin de agotar las células de ratón después de los xenotrasplantes. Sin embargo, estas combinaciones de marcadores reconocen sólo un subconjunto de células de ratón en todos los tejidos analizados. En exámenes anteriores una combinación de cinco anticuerpos ha sido identificado lo que permite la detección integral de todas las células de origen de ratón. Este panel incluye células rojas de la sangre y es independiente del tejido de origen (A, B, y los datos no se muestra). Modificado de 14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El agotamiento confiable y rápido de las células de ratón 15. Los conjugados de la combinación anticuerpo con superparamagnético nanoparticles se utilizaron para desarrollar un protocolo optimizado para el agotamiento de células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos por clasificación celular magnética (separación celular magnética) (A). Este nuevo protocolo permitió la eliminación de> 99% de contaminación de células de ratón en menos de 20 min, independientemente del tipo de tumor. Fracciones de células obtenidas a partir de procedimiento de separación celular magnética se marcaron con el cóctel de pan-anticuerpo de ratón y un anticuerpo específico humano contra CD326 (EpCAM) (B). Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Aislamiento de células de glioblastoma humano. Ratón Kit depleción de células se utilizó para aislar células de glioblastoma humano de adulto mouse cerebro. Durante la disociación de grandes cantidades de tejido neural de los desechos se genera habitualmente. RDPQ reduce eficazmente las células muertas y los desechos, como se ve por el gráfico que muestra el tamaño de células frente a la granularidad celular. Con este cóctel conjugado, que era posible eliminar> 99% de las células de ratón contaminantes y> 60% de los escombros. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. El agotamiento de células de ratón Facilita culturas aguas abajo de células tumorales humanas 14. Fibroblastos de ratón con frecuencia obstaculizan el cultivo de células tumorales humanas después de la disociación de tejidos trasplantados o conducen a cultivos heterogéneos. Fibroblastos se adhieren y se expanden de manera más eficiente, por lo tanto overgrowing objetivo c ells. Esto perturba en ensayos de cultivo celular in vitro (por ejemplo, pruebas de citotoxicidad de drogas), ya que la corrección matemática de los efectos derivados de la contaminación de las células de ratón es imposible en la mayoría de los casos. El negativo (B) y las fracciones positivas (C) después de la depleción de células de ratón se cultivaron durante tres días, fijadas y teñidas de un marcador de ratón específicos de fibroblastos (vimentina) y el marcador de tumor humanos específicos de CD326 (EpCAM). Como control, la fracción original que contiene las células no separadas (A) se cultivó y se tiñó también. Incluso después de tres días de cultivo, se observó una población casi pura de células tumorales humanas en la fracción negativa (B), mientras que la fracción no seleccionados (A) era casi cubierto por los fibroblastos. Sólo una pequeña parte de las células diana se perdió a la fracción positiva (C). Modificado de 14.ge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Todo el exoma secuenciación (WES) de las muestras del tumor antes de y después de la depleción de células de ratón (MCD) 15. Se realizó WES en tres diferentes modelos de xenoinjertos derivados de riñón humano, pulmón y cáncer de vejiga con el fin de evaluar el impacto de MCD en la calidad de los datos de secuenciación de próxima generación. Se utilizó el ADN de tumor a granel y de las células tumorales aisladas después de la depleción de células de ratón para generar bibliotecas de secuenciación del exoma-capturado aplicando una unidad de captura exoma. Para la secuenciación en un secuenciador instrumento de escritorio, un kit de reactivos secuenciador de escritorio 150 ciclos, se utilizó para generar 75 pb de extremo emparejado lee. Un aumento significativo (p <0,05) en la densidad del clúster (A), así como un aveSe observó un aumento en el recuento de la rabia de lectura de 33% (B) para las muestras agotados de células de ratón, lo que indica una mejor calidad de la muestra. En consecuencia, una fuerte reducción de los desechos y células muertas sobre MCD también se pudo demostrar por citometría de flujo análisis (véase la Figura 3). Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. El agotamiento de la célula de ratón (MCD) reduce mucho Número de ratón erróneamente asignada Lee después de que todo Exoma Secuenciación (WES) 15. Como oligonucleótidos de captura utilizados para el enriquecimiento selectivo de secuencias codificadoras de proteínas se diseñaron basándose en el genoma humano, un pre-inicial enriquecimiento de fragmentos de ADN de origen humano from se esperaba que la mezcla de células de ratón y humanas. Con el fin de evaluar el número de oligonucleótidos de captura que podrían hibridación cruzada con el ADN genómico de ratón, se realizó búsquedas BLAST de cada sonda de captura exoma rápida solo contra genoma del ratón. Se utilizaron los parámetros de alineación resultantes para determinar la posible hibridación cruzada. (.. Alineación de longitud, ninguno de los desajustes, ninguna de las lagunas) en función de los umbrales de selección, que predijo una reactividad cruzada sobre 5 - 10% de las sondas de captura con transcripciones de ratón (datos no mostrados). Tras el recorte adaptador (v0.32 trimmomatic 16), estudiamos las lecturas de todas las muestras contra los genomas humanos y de ratón (BWA v0.7.12 17) y se determina su origen putativo basa en los respectivos parámetros de alineación (shell de Linux, la línea de comandos Perl) (A). Un promedio de 12% de lecturas derivadas de muestras de tumores a granel se atribuyó a las células de ratón. Esta cantidad podría reducirse a 0,3% en el agotamiento previo de células de ratón (B la Figura 6B es un ejemplo de la asignación de lectura detallada de tumor a granel y las células tumorales humanas aisladas derivadas del xenoinjerto de cáncer de vejiga. Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. MCD reduce mucho el número de SNPs falsamente predichos 15. Con el fin de determinar el impacto de ratón lee mapeado en el genoma humano, se determinó el número de predicteD SNPs para las muestras de xenoinjerto antes y después de la MCD. Como estaba disponible para la comparación no tejido sano, un SNP se define como una diferencia entre la muestra y secuenciado el genoma de referencia (hg19). Después de la eliminación de lecturas duplicadas, SNP y INDEL llamada se llevó a cabo el 18 y estaba restringida a las regiones seleccionadas por una unidad de captura exoma. 63 ± 10% de todos los SNPs predicho para las muestras tumorales a granel ya no se detectaron después de la depleción de células de ratón, 18 ± 1% eran específicos para las células tumorales humanas aisladas (A). Mientras que los primeros fueron causadas principalmente por el ratón erróneamente asignada lee este último parecía ser detectados debido a los mayores recuentos de lectura y en consecuencia la cobertura más alta dentro de las muestras aisladas de células tumorales humanas. Este efecto también era visible para los INDEL predichos (B). Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.
Figura 8. MCD mejora la predicción de alto impacto SNPs 15. (A) Impacto de la MCD en la predicción SNP dentro de un exón codificante de la proteína del gen POLA1 19 se ejemplifica. Mientras ratón erróneamente asignada lee causó un número de SNPs falsamente predichos en el xenotrasplante de cáncer de riñón a granel, estos SNP estaban desaparecidas después de MCD. Además, MCD también mejoró la predicción de alto impacto SNPs. Por ejemplo, ratón lee asigna al genoma de referencia humana en la muestra de tumor a granel como resultado la destrucción predicho erróneamente del codón de inicio del gen GRIA3 (B). Modificado de 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 9. En silico El agotamiento de ratón derivada de las lecturas no puede reemplazar completamente E n Vitro MCD 15. El lee prevé que sea de origen de ratón fueron retirados computacional de los datos de secuenciación, y se repitió la llamada SNP. Por este método, el número de SNPs predicho para las muestras tumorales a granel se redujo considerablemente de 63% a 8,5% del número total de SNPs (comparar con la Figura 8). Sin embargo, este enfoque en silico no puede sustituir completamente en MCD vitro, especialmente si la calidad de la muestra mejorada y el aumento concomitante en recuentos de lectura y la cobertura se consideran. Modificado de 15."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Hemos desarrollado un método rápido y fácil de aislar las células tumorales humanas vírgenes de tejido tumoral xenoinjertado. Este procedimiento se basa en el agotamiento completo de las células de origen de ratón mediante la combinación de la disociación de tejido automatizado y la clasificación de células magnético. Además de agotamiento de todas las células de ratón también la cantidad de células muertas y los desechos se reduce significativamente en la fracción de células diana. En conjunto, este método mejora significativamente análisis aguas abajo moleculares y cultivo de células tumorales humanas.
En contraste con los métodos alternativos, no hay necesidad de conocimiento de marcadores específicos de células tumorales, el ajuste a las diversas composiciones de células de ratón o establecimiento de algoritmos. El método presentado es independiente de la cepa de ratón y el tipo de tumor. Por lo tanto, un sesgo a través del aislamiento de subpoblaciones de tumores humanos sobre la base de marcadores específicos humanos individuales que pueden variar en la expresión, como se muestra para EpCAM 11, es evitared. Además, no está limitado a material de tumor pero se puede utilizar para cualquier tipo de tejido xenotransplantado como células de ratón están dirigidos en lugar de subpoblaciones específicas de tumores humanos (datos no mostrados).
la eliminación completa de las células de ratón se ve facilitada por la orientación epítopos de superficie expresados exclusivamente en células de origen murino. Aparte del método bien establecido para la disociación tumor tal como se presenta en este estudio, hay muchos procedimientos que utilizan diferentes tipos de enzimas. La preservación de epítopos de la superficie celular es un requisito previo para este nuevo método, sino también para análisis precisos de las poblaciones de células tumorales humanas. Por lo tanto, es crucial que las enzimas suaves se utilizan para la digestión del tejido tumoral. Por lo tanto, el agotamiento de células de ratón se puede utilizar solamente en combinación con procedimientos de digestión enzimáticos que, evidentemente, no afectan a epítopos específicos durante el procedimiento de reducción de células de ratón. En caso de duda, esto sólo puede ser verificada por el fabricante respectivo.
La eliminación de las células de ratón mejora significativamente el cultivo de células tumorales humanas, evitando overgrow cultivo de fibroblastos de ratón. Además, el análisis de xenoinjertos de tumores humanos por secuenciación de próxima generación se ha mejorado y estandarizado de manera significativa. Como se observó este efecto a pesar de una selección específica de secuencia humana específica se ha llevado a cabo durante el enriquecimiento del exoma, se espera que la influencia sobre todo el genoma y la secuenciación del transcriptoma todo para ser aún más prominente.
Por otra parte, el método presentado facilita AccuraLos estudios moleculares del te de subpoblaciones tumorales en tumores humanos xwnotransplantado. La eliminación de las células de ratón a partir de una muestra respectiva en la primera etapa y, posteriormente, la clasificación células tumorales humanas en dos subpoblaciones diferentes permite la comparación molecular directo de la subpoblación tumor de interés a las células tumorales a granel humano 20. La expresión génica diferencial entre los subtipos de células tumorales se puede evaluar de forma más fiable, ya que no se ve afectada por la hibridación cruzada de moléculas derivadas de ratón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
References
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494 (2013).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
- Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
- Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
- Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
- Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
- Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , AACR. (2014).
- Agorku, D., et al. Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , AACR. (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
- Robinson, J. T., et al.
- Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).
