Summary
Humane tumor-xenotransplantater er vaskulariseret og infiltreret af celler af museoprindelse under vækstfasen in vivo. For at omgå bias forårsaget af disse kontaminerende celler under nedstrøms analyse, udviklede vi en fremgangsmåde muliggør omfattende udtømning af alle museceller ved magnetisk cellesortering.
Abstract
Brugen af in vitro-cellelinje modeller til kræftforskning har været et nyttigt redskab. Det er imidlertid blevet vist, at disse modeller ikke pålideligt efterligne patientens tumorer i forskellige assays 1. Humane tumorxenoplantater repræsenterer den gyldne standard med hensyn til tumor biologi, lægemiddelforskning, og metastase forskning 2-4. Tumorxenografter kan afledes af forskellige typer af materiale som tumorcellelinier, tumorvæv fra primære patientens tumorer 4 eller serielt transplanterede tumorer. Når opformeret in vivo, er xenotransplanteret væv infiltreret og vaskulariseret af celler af museoprindelse. Flere faktorer såsom tumor enhed, oprindelsen af xenotransplanteret materiale, vækstrate og region transplantation påvirke sammensætningen og mængden af museceller stede i tumorxenotransplantater. Men selv når disse faktorer holdes konstante, graden af kontaminering muse celle er meget varierende.
Contaminating museceller væsentligt forringe downstream analyser af humane tumorxenoplantater. Som musefibroblaster viser høj plating effektiviteter og spredning satser, de har tendens til at vokse kulturer af humane tumorceller, især langsomt prolifererende subpopulationer. Muse celleafledt DNA, mRNA og protein komponenter kan forspænding nedstrøms genekspression analyse, næste generation sekventering, samt proteomanalyse 5. For at overvinde disse begrænsninger, har vi udviklet en hurtig og nem metode til at isolere uberørte humane tumorceller fra xenotransplanteret tumorvæv. Denne procedure er baseret på omfattende udtømning af celler af museoprindelse ved at kombinere automatiseret væv dissociation med benchtop væv dissociator og magnetisk cellesortering. Her viser vi, at humane målceller kan være kan opnås med renheder højere end 96% inden for mindre end 20 min uafhængigt af tumortype.
Introduction
Faste humane tumorer består af flere fysiologiske såvel som neoplastiske celletyper. De danner heterogene væv med komplekse biologiske strukturer. Biologiske processer som tumordannelse progression og reaktioner over for behandlinger er endnu ikke fuldt forstået. In vitro cellekultur modeller repræsenterer et nyttigt redskab til at studere og forstå tumor biologi. Men de kan kun delvist spejler strukturer og processer, der findes i tumorvæv. Pålidelige og stabile prækliniske humane tumormodeller er en forudsætning for udviklingen af anti-tumor lægemidler og terapier 4,6 samt for forståelse tumor biologi og interaktionen af tumorceller og deres omgivelser.
Humane tumor xenograftmodeller afledt af primære patient tumorer viser høje relationer til væv oprindelseslandet om histologiske arkitektur, interaktioner med mikro-miljø strukturer, metastatisk potentiale og reaktioner på lægemidler 7 in vitro-cellekultur modeller. Disse funktioner gør dem guldstandarden af prækliniske modeller 4. Udover dens anvendelse i kræftforskning, er xenotransplantation af humane celler i mus også ofte i stamcelleforskningen at bestemme stemness og differentiering potentiale en målgruppe 8.
Det er blevet vist, at human mikrovaskulatur og humane immunceller erstattes ved in vivo opformering af humane tumorer 2,9. Faktorer som tumor undertype, vækstrate, og region transplantation har store konsekvenser for den globale niveau af infiltration samt sammensætningen af mus celletyper fundet. Men selv når disse faktorer holdes konstante, mængden og sammensætningen af museceller er meget varierende.
Downstream analyser af xenotransplanterede væv bliver ofte udfordret af celler af murin oprindelse. Primære kulturer af humane tumorceller fra xenotransplantater ofte overgroet med fibroblaster. Udover at hæmme dannelsen af tumorcellelinier in vitro, er downstream assays, såsom narkotika cytotoksicitetstestning eller farmakokinetik forspændt siden i silico korrektion for virkninger, der er umulig i de fleste tilfælde kontaminerende museceller. Ud over dette, at kun delvist belyst krydstale mellem musefibroblaster og humane tumorceller har en direkte indvirkning på eksperimentelle resultater af undersøgelser 10. Øvrigt er den mest udbredte uforudsigelige variation af infiltrerende museceller forværrer præcise molekylære downstream analyser. I NGS eller proteomanalyse hver mus-afledte signal målt i stedet for en human tumor signal direkte formindsker sekventering følsomhed. Også microarray baseret udtryk analyser udfordret af murine nucLeic syrer eventuelt cross hybridiserende til humane prober.
For at omgå forhindringer kontaminerende museceller på de efterfølgende analyser af humane tumorceller fra xenograftmodeller er blevet foreslået forskellige tilgange. I mange undersøgelser ønskede target celler til nedstrøms analyse isoleres ved at udnytte markører eller kombinationer af markører udelukkende udtrykt på humane tumorceller. Men manglen på pålidelige markører for positiv identifikation af humane tumorceller udgør ofte en stor forhindring. Selv bredt udtrykte markører, såsom EpCAM på menneskelige carcinomer, viser ofte tumor iboende udtryk forskelle 11. Det øger risikoen for, at lave udtrykker delpopulationer, fx tumorceller gennemgået epitelial-til-mesenkymale overgang, går tabt under isolation. Desuden kan den direkte binding af et selektionsmiddel til målcellen påvirke de efterfølgende analyseresultater. Forsøg på depletterende museceller vedved anvendelse af en kombination af antistoffer specifikke for murint CD45 og MHC klasse I epitoper er også blevet gjort 12. Men denne markør kombination detekterer kun en delmængde af museceller. En anden fremgangsmåde er at forbedre analysere processer ved software. Ikke desto mindre er alle disse tilgange er enten ikke egnet til enhver form for eksperimentel opstilling eller for enhver tumor enhed og transplantation metode.
I denne undersøgelse præsenterer vi en hidtil ukendt og hurtig metode til omfattende nedbrydende museceller fra xenotransplanterede væv uafhængige af muse stamme og væv af oprindelse. I screeninger på flere målorganer og væv til transplantation af xenotransplantater (herunder hud, lunge, hjerne, nyre og skeletmuskulatur) var vi i stand til at identificere en kombination af antistoffer muliggør omfattende detektering museceller. Disse antistoffer blev koblet til superparamagnetiske partikler, titreret og optimeret til depletering ved anvendelse af magnetisk cellesortering. Da kun musespecifikanvendes antistoffer, humane målceller bo "uberørt" og fremgangsmåden er ikke begrænset til xenotransplanted tumorvæv. Vi demonstrerer, at omfattende fjernelse museceller fra xenotransplanterede tumorprøver standardiserer og letter kulturer af humane tumorceller. Desuden viser vi, at analysen af menneskelige tumorxenografter ved næste generation sekventering er væsentligt forbedret. Som det blev observeret denne effekt, selv om en human sekvens specifik udvælgelse er foretaget under exome berigelse, er den indflydelse på hele genomet og hele transkriptom sekventering forventes at blive endnu mere fremtrædende. Tilsammen fjernelse af museceller ved anvendelse af denne nye fremgangsmåde letter dyrkning af humane tumorceller og forbedrer downstream analyser af humane tumor-xenotransplantater.
Protocol
Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de lokale etiske og juridiske retningslinjer Regierungspräsidium Freiburg Referat 35.
1. Klargøring af reagens
BEMÆRK: Før du starter eksperimentet, forberede følgende reagenser fra dissociation kit:
- Til fremstilling enzymet H opløse hvert hætteglas af det lyofiliserede pulver i 3 ml RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) eller Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM). For at undgå gentagen frysning og optøning fremstille egnede prøver (f.eks 200 pi) og opbevares ved - 20 ° C i op til 6 måneder.
- Til fremstilling enzym R opløse hætteglasset med det lyofiliserede pulver i 2,7 ml RPMI eller DMEM-medium. For at undgå gentagen frysning og optøning fremstille egnede prøver (f.eks 100 pi) og opbevares ved - 20 ° C i op til 6 måneder.
- Til fremstilling enzym A opløse vIAL af det lyofiliserede pulver i 1 ml puffer A leveres med kittet uden hvirvelbehandling. For at undgå gentagen frysning og optøning fremstille egnede alikvoter og opbevares ved (f.eks 25 pi.) - 20 ° C i op til 6 måneder. Sørg for grundigt at blande denne suspension umiddelbart før tilbagetrækning den ønskede reaktion volumen.
- Forbered 250 ml puffer (1x PBS med 0,5% BSA) i celleseparation procedure og antistoffarvning.
BEMÆRK: Når dyrkning af celler efter fjernelse af museceller filtrere alle buffere og enzymløsninger gennem et 0,22 um filter.
2. Tumor Dissociation Protocol
BEMÆRK: I dette studie patient-afledte xenotransplantater af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), blev nyrecancer og blære anvendes. Tumorerne blev genereret ved at implantere xenotransplantater af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) nyrekræft og blære i 4 - 6 uger gammel kvindelig NMRI nu / nu mus som beskrevet tidligere 13 BEMÆRK: Da denne protokol er helt uafhængig af tumor type, kan det bruges til nogen form for patient eller cellelinje-afledt tumor samt andre former for menneskelig xenotransplanted væv uden ændring af protokollen.
- Forbered 5 ml fordøjelse mix pr vævsprøve (op til 1 g) frisk ved tilsætning 4,7 ml RPMI 1640 eller DMEM, 200 pi enzym H, 100 pi enzym R, og 25 pi enzym A i en cellulær dissociation rør ( C Tube). Sørg for grundigt at blande enzym R suspension før tilbagetrækning den nødvendige mængde.
- Sacrifice dyrene ved cervikal dislokation under anæstesi. Desinficere mus ved sprøjtning med lille mængde af 80% v / v ethanol.
- Harvest subkutan tumor fra musen flanke ved hjælp af pincet og saks i en vævskultur hætte. Skære huden åben i stedet for tumoren med en saks og derefter adskille tumor fra tilstødende sunde væv ved hjælp af pincet og saks.
BEMÆRK: Afhængigt af formålet medeksperimentet udføre denne og følgende trin under aseptiske forhold. I denne undersøgelse blev udført alle trin i en cellekultur hætte under aseptiske betingelser for at være i stand til at dyrke cellerne. - Forbered tumorprøven for spaltninger ved at fjerne fedt (da dette vil gøre prøven float) og nekrotiske områder (da dette vil resultere i nedsat levedygtighed) ved at skære det væk med pincet og en skalpel. Hakke vævet i stykker på 2 - 4 mm ved hjælp af skalpeller og pincet.
- Overfør vævsstykkerne i C røret med fordøjelsen mix.
- Luk C Tube og sørg for at det er tæt lukket. Fastgør den på hovedet ned på ærmet af stationære væv dissociator og sørg for, at vævet stykker er placeret i området af rotoren / stator.
- Vælg mode "h_tumor_01" ved at trykke på "op" eller "ned" knappen indtil tilstanden vises på displayet, og derefter trykke på knappen "start".
- Hvis usynge opvarmning funktion af bordplade væv dissociator, så sørg for at også vedhæfte varmeren. Derefter køre tilstand 37C_h_TDK_1 (til bløde tumorer), 37C_h_TDK_2 (for mellemstore tumorer) eller 37C_h_TDK_3 (for hårde tumorer) ved at klikke symbol mappen på den berøringsfølsomme skærm, indtil mappen "Miltenyi" vises.
- For at vælge den tilstand, skal du klikke på pil op eller ned, indtil dissociation tilstand 37C_h_TDK_2 er fremhævet. Ærmerne af stationære væv dissociator er afbildet som positioner på enhedens skærm. Vælg positionerne prøverne kører på ved at klikke på dem på den berøringsfølsomme skærm. Tryk på "start" for at køre mode og fortsætte med trin 2.16.
BEMÆRK: Afhængigt af tumortype anden dissociation program kan være egnede (se trin 2.7.1).
- Overhold en vindue, der viser "Ophør af programmet" på skærmen. Efter afslutning af programmet, løsnes C Tube fra stationære væv dissociator.
- Inkuber prøve i 30 minutter ved 37° C under kontinuerlig rotation, fx ved hjælp af et rør rotator.
- Efter inkubation vedhæfte C Tube hovedet på ærmet af stationære væv dissociator. Igen sørge for, at prøvematerialet er placeret i området af rotoren / statoren.
- Kør dissociation program h_tumor_02 (til bløde og mellemstore tumorer) eller h_tumor_01 (for hårde tumorer) som beskrevet i trin 2.7.1.
- Efter afslutning af programmet, løsnes C Tube fra stationære væv dissociator.
- Inkuber prøve i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotation.
- Vedhæft C Tube hovedet på ærmet af stationære væv dissociator efter inkubation. Igen sørge for, at prøvematerialet er placeret i området af rotoren / statoren.
- Kør dissociation program h_tumor_03 (til bløde tumorer), h_tumor_02 (for mellemstore tumorer) eller h_tumor_01 (for hårde tumorer) som beskrevet i trin 2.7.
- At indsamle prøvematerialet på røret bunden udføre en short centrifugeringstrin (ved 100 xg i 10 sek).
- Resuspender cellerne og gælder for en cellesigte med 70 um nesh størrelse placeret på et 50 ml rør. Vask cellesigte med 20 ml RPMI 1640 eller DMEM.
- Centrifuge celle suspension ved 300 xg i 7 min. Aspirer supernatanten fuldstændigt.
- Resuspender celler i 5 ml buffer til tælling. Fortsæt med musen Cell tømt af magnetisk celleseparation (afsnit 3).
3. Mus celledepletering ved magnetisk Cell Separation Technology
BEMÆRK: Volumener til magnetisk mærkning nedenfor er for op til 2 x 10 6 tumorceller eller 10 7 totale celler, herunder røde blodlegemer. Afhængigt af tumorstørrelsen lavere eller højere tal celle vil blive opnået. I tilfælde af færre celler, bruge de samme mængder som angivet. Ved brug af højere celletal, skalere op alle reagens mængder og samlede mængder i overensstemmelse hermed (f.eks, til 4 x 10 6 tumorceller eller 2 x 10 4. Downstream Analyser
BEMÆRK: På dette tidspunkt cellesuspensionen består af en heterogen blanding af humane tumorceller samt muse stromale og blodceller, herunder røde blodlegemer. Sammensætningen af cellerne afhænger stærkt af tumortype og region til transplantation.
</ Li>
BEMÆRK: Når der arbejdes med højere celletal op til 2,5 ml cellesuspension, der blev fremstillet ifølge trin 3.5 kan anvendes på en kolonne.
BEMÆRK: Gennemløbet indeholder oprensede humane tumorceller.
BEMÆRK: Før udførelse af yderligere downstream analyser, en del af celler opnået fra mus cellereduktion procedure kan analyseres (fx vurdere renhed og udbytte) i flowcytometri.
BEMÆRK: EpCAM er ikke egnet som tumorcellemarkøren af enhver tumortype. For tumorerne i denne undersøgelse anvendte EpCAM ekspression blev kendt.
BEMÆRK: Ud over flowcytometri kan celler opnået ved separationen procedure dyrkes og anvendes til yderligere assays in vitro.
BEMÆRK: Afhængigt af tumortype belægning, egnet såning tæthed, og dyrkningsforhold kan variere.
BEMÆRK: Optimale dyrkningsbetingelser afhænger af tumoren anvendte type. Derfor gælder dyrkningsbetingelser egnede til tumoren anvendte type.
Bemærk: De anvendte antistoffer er ikke egnede til enhver tumortype som EpCAM ikke kan udtrykkes på tumorceller og / eller vimentin også udtrykkes af tumorcellerne. Sørg for, at anvendte antistoffer er egnede til xenograft model.
Representative Results
Der er blevet foreslået forskellige metoder til at identificere eller depletere museceller fra xenotransplanterede humane tumorer, for eksempel en kombination af muse-specifikke antistoffer mod CD45 og MHC klasse I. Der blev imidlertid kun afsløret subpopulationer af museceller under anvendelse af disse kombinationer hvorimod den foreslåede kombination detekterede CD45 og MHC klasse i udtrykkende muse celler såvel som resten af museceller fundet i målvæv til transplantation (figur 1). Udnytter denne hidtil ukendte kombination af antistoffer til magnetiske cellesortering, kan humane tumorceller isoleres uafhængigt af tumortype (figur 2).
Celler opnået fra magnetisk celleseparation procedure baseret muse fjernelse celle kunne være dyrket, fører til rene kulturer af humane tumorceller (figur 4). Desuden kunne levedygtige museceller opnås og dyrkes frasamme prøve. Udover fjernelse af museceller blev også nedbrudt materiale fjernedes ved muse-celle depletion (MCD) (figur 3).
Den omfattende udtømning af museceller samt vragrester fjernelse føre til forbedrede molekylære downstream analyser. Dette blev demonstreret ved at sammenligne resultaterne opnået fra hele exome sekventering (WES) udført på bulk-tumorstykker og mus celle reducerede prøver fra tre forskellige patient-afledt xenograft tumormodeller (figur 5 - 9). Vores data indikerer, at fjernelsen af museceller før udførelse WES på xenograft tumorprøver ikke kun øger den totale mængde af læser (figur 5), men også reducerer antallet af værten afledt læser kortlægges til det humane henvisning genom (figur 6B). Da disse fejlagtigt kortlagt mus læser ofte forstyrre SNP calling, observerede vi en kraftig reduktion af falsk forudsagtSNP'er efter MCD (figur 7 - 8). Endelig viste vi, at i silico fjernelse af mus afledt læser ved bioinformatiske metoder kunne ikke helt erstatte den eksperimentelle procedure, som en entydig sekvens-baserede opgave til arten oprindelsesbetegnelser ikke var muligt for alle læser. Endvidere i silico procedure kunne ikke korrekte for den forbedrede kvalitet og samtidig højere read dækning af in vitro-udtømte prøver (figur 9).
Figur 1. Etablering af en Antibody Cocktail erkendelse Alle Mouse Celler på tværs af flere organer 14. Screenings i flere organer, herunder hud, lunge, hjerne, nyre og skeletmuskulatur, er blevet udført. Disse organer repræsenterer store målvæv til xenotransplantation. Kombinationer såsom de genkender mouSE CD45 og MHC klasse I epitoper er allerede blevet anvendt til at depletere museceller efter xenotransplantation. Men disse markørkombinationer anerkendt kun en delmængde af museceller i alle analyserede væv. I tidligere screeninger en kombination af fem antistoffer er blevet identificeret giver mulighed for omfattende påvisning af alle celler fra mus oprindelse. Dette panel omfatter røde blodlegemer og er uafhængig af vævet af oprindelse (A, B, og data ikke vist). Modificeret fra 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. pålidelig og hurtig Udtømning af museceller 15. Konjugater af antistoffet kombination med superparamagnetisk nanoparticles blev anvendt til at udvikle en optimeret protokol til udtømning af museceller fra humane tumor-xenotransplantater ved magnetisk cellesortering (magnetisk celleseparation) (A). Denne hidtil ukendte protokol tillod fjernelse af> 99% af kontaminerende museceller på mindre end 20 min, uanset tumortype. Cellefraktioner opnået fra magnetisk celleseparation procedure blev mærket med pan-mus antistof cocktail og et humant antistof mod CD326 (EpCAM) (B). Modificeret fra 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Isolering af humane glioblastom celler. Mus celledepletering Kit blev anvendt til at isolere humane glioblastom-celler fra voksne muse hjerne. Under dissociation af neuralt væv høje mængder af affald er almindeligt genereres. MCDK effektivt udtømmer døde celler og snavs som set af plottet viser celle størrelse versus celle granularitet. Med denne konjugat cocktail, var det muligt at fjerne> 99% af de kontaminerende museceller og> 60% af resterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Udtømning af Mouse Cells Muliggør Downstream Kulturer af humane tumorceller 14. Musefibroblaster ofte hæmmer dyrkning af humane tumorceller efter dissociation af transplanterede væv eller fører til heterogene kulturer. Fibroblaster vedhæfte og udvide mere effektivt og dermed tilgroning mål c alen. Dette forstyrrer in vitro cellekultur-assays (fx lægemiddel cytotoksicitet afprøvning), idet matematisk korrektion for virkninger som følge af kontaminerende museceller er umuligt i de fleste tilfælde. Den negative (B) og positive fraktioner (C) efter muse celledepletering blev dyrket i tre dage, fikseret og farvet for en muse-specifik fibroblast markør (vimentin) og humanspecifikke tumormarkør CD326 (EpCAM). Som en kontrol, den oprindelige fraktion indeholdende adskilte celler (A) blev dyrket og farves samt. Selv efter tre dages dyrkning blev en næsten ren population af humane tumorceller observeret i den negative fraktion (B), mens usorteret fraktion (A) var næsten overgroet af fibroblaster. Kun en mindre del af målceller blev tabt til den positive fraktion (C). Modificeret fra 14.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Hele Exome Sequencing (WES) af tumorprøver Før og efter Mouse Cell Depletion (MCD) 15. Vi har udført WES på tre forskellige xenograftmodeller fra humant nyre, lunge og blærekræft for at vurdere virkningen af MCD på kvaliteten af næste generation sekventering data. DNA fra bulk-tumor og fra isolerede tumorceller efter muse celledepletering blev anvendt til at generere exome-fanget sekventering biblioteker anvender en exome capture kit. Til sekventering på en stationær sequencer instrument, en desktop sequencer reagenskit 150 cyklusser blev anvendt til at generere 75-bp parret ende læser. En signifikant stigning (p <0,05) i klynge tæthed (A) samt en average forøgelse læste tællinger af 33% (B) blev observeret for prøverne depleteret for museceller, hvilket indikerer forbedret prøve kvalitet. Tilsvarende kunne en stærk reduktion af snavs og døde celler ved MCD også dokumenteres ved flowcytometrianalyse (se figur 3). Modificeret fra 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Mus Cell Depletion (MCD) Reducerer kraftigste Antal Fejlagtigt kortlagt Mouse Læser efter Whole Exome Sequencing (WES) 15. Som capture oligonukleotider anvendt til målrettet berigelse af protein-kodende sekvenser blev designet baseret på den menneskelige genom, en indledende præ- berigelse af DNA-fragmenter af human oprindelse from blandingen af muse og humane celler var forventet. For at vurdere antallet af capture oligonukleotider, der kunne krydse-hybridiserer med musen genomisk DNA, vi gennemførte BLAST søgninger af hver enkelt hurtig capture exome sonde mod mus genom. De resulterende alignment parametre blev anvendt til at bestemme mulig krydshybridisering. (.. Justering længde, ingen af uoverensstemmelser, ingen huller) Afhængigt af tærskler udvælgelseskriterierne, vi forudsagde en krydsreaktivitet af 5 - 10% af indfangningsprober med mus udskrifter (data ikke vist). Efter adapter klipning (trimmomatic v0.32 16), vi kortlagt læser af alle prøver mod humane og murine genomer (BWA v0.7.12 17) og bestemt deres formodede oprindelse baseret på de respektive alignment parametre (LINUX shell, kommando-linje Perl) (A). Et gennemsnit på 12% af læser afledt fra bulk tumorprøver blev tilskrevet museceller. Dette beløb kunne reduceres til 0,3% ved forudgående udtømning af museceller (B Figur 6B eksemplificerer den detaljerede læse opgaven for bulk tumor og isolerede humane tumorceller afledt af blærecancer xenotransplantat. Modificeret fra 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. MCD stærkt reducerer antallet af usande Forventede SNP'er 15. For at fastslå virkningen af musen læser kortlagt til det menneskelige genom, vi bestemt antal predicted SNP'er for xenograft prøverne før og efter MCD. Da ingen sundt væv var tilgængelig for sammenligning blev en SNP defineret som en forskel mellem det sekventerede prøven og referencen genom (hg19). Efter fjernelse af to eksemplarer læser, blev SNP og INDEL kald foretaget 18 og var begrænset til de regioner, er omfattet af en exome capture kit. 63 ± 10% af alle SNP'er forudsagt for størstedelen tumorprøver blev ikke længere detekteres efter muse cellereduktion, 18 ± 1% var specifikke for de isolerede humane tumorceller (A). Mens det tidligere primært blev forårsaget af fejlagtigt kortlagt mus læser sidstnævnte syntes at blive detekteret på grund af højere læste tæller og følgelig større dækning inden for de isolerede humane tumor celleprøver. Denne effekt var også synlig for forudsagte indels (B). Modificeret fra 15. Klik her for at se en større version af dennefigur.
Figur 8. MCD Forbedrer Forudsigelse af Slagfast SNP'er 15. (A) Virkning af MCD på SNP forudsigelse inden et protein-kodende exon af POLA1 gen 19 er eksemplificeret. Mens fejlagtigt kortlagt mus læser forårsaget en række falsk forudsagte SNP'er i bulk nyrekræft xenograft, blev disse SNPs mangler efter MCD. Desuden MCD også forbedret forudsigelse af slagfast SNPs. For eksempel læser mus kortlagt til det humane henvisning genom i bulk tumorprøven resulterede i den uberettiget forudsagte ødelæggelse af startkodonen af GRIA3 genet (B). Modificeret fra 15. Klik her for at se en større version af dette tal.
s = "jove_content" fo: holde-together.within-side = "1"> 
Figur 9. I Silico Nedbrydning af Mouse-afledt Læser kan ikke helt Udskift I n Vitro MCD 15. Det læser forventes at være af mus oprindelse blev beregningsmæssigt fjernet fra sekventering data, og SNP kald blev gentaget. Ved denne fremgangsmåde er antallet af SNP'er forudsagt for bulk tumorprøver blev betydeligt reduceret fra 63% til 8,5% af det samlede antal SNP'er (sammenlign med figur 8). Men dette in silico fremgangsmåde kunne ikke helt erstatte in vitro MCD, især hvis den forbedrede prøve kvaliteten og den tilsvarende forhøjelse af læste tællinger og dækning betragtes. Modificeret fra 15."_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har udviklet en hurtig og nem metode til isolering uberørte humane tumorceller fra xenotransplanteret tumorvæv. Denne procedure er baseret på omfattende udtømning af celler af museoprindelse ved at kombinere automatiseret væv dissociation og magnetisk cellesortering. Udover udtømning af alle museceller også mængden af døde celler og rester reduceres væsentligt i fraktionen målcellen. Tilsammen denne metode forbedrer markant molekylære downstream analyser og dyrkning af humane tumorceller.
I modsætning til alternative metoder, er der ikke behov for kendskab til tumorcellespecifikke markører, tilpasning til varierende sammensætninger af museceller eller etablering af algoritmer. I denne procedure er uafhængig af muse stamme og tumortype. Derfor er en forspænding gennem isolering af humane tumor subpopulationer på grundlag af enkelte humane specifikke markører, som kan variere i udtryk, som vist for EpCAM 11, er undgåed. Det er endvidere ikke begrænset til tumor materiale, men kan anvendes til enhver form for xenotransplanted væv som museceller målrettes stedet for specifikke humane tumor subpopulationer (data ikke vist).
Omfattende fjernelse af museceller lettes ved at målrette overflade epitoper der udelukkende udtrykkes på celler af museoprindelse. Bortset fra den veletablerede fremgangsmåde til tumor dissociation som præsenteret i denne undersøgelse, er der mange procedurer, der anvender forskellige typer af enzymer. Bevarelse af celleoverflade-epitoper er en forudsætning for denne hidtil ukendte fremgangsmåde, men også for at opnå nøjagtige analyser af humane tumorcellepopulationer. Derfor er det afgørende, at blide enzymer anvendes til fordøjelse af tumorvæv. Således kan muse cellereduktion kun anvendes i kombination med enzymatisk fordøjelse procedurer, som åbenbart ikke påvirker epitoper målrettet under muse-celle depletion procedure. I tvivlstilfælde kan dette kun verificeres af den respektive producent.
Fjernelse af museceller forbedrer signifikant dyrkning af humane tumorceller ved at undgå kultur overgrow af musefibroblaster. Desuden er analysen af humane tumor-xenotransplantater af næste generation sekventering væsentligt forbedret og standardiseret. Som det blev observeret denne effekt, selv om en målrettet human sekvens-specifik udvælgelse er foretaget under exome berigelse, er den indflydelse på hele genomet og hele transkriptom sekventering forventes at blive endnu mere fremtrædende.
Desuden er den foreliggende fremgangsmåde letter ACCURAte molekylære studier af tumor subpopulationer inden xenotransplanted humane tumorer. Fjernelse af museceller fra en respektiv prøve i det første trin og efterfølgende sortering humane tumorceller i to forskellige subpopulationer muliggør direkte molekylær sammenligning af tumoren subpopulation af interesse for human bulk-tumorceller 20. Differentiel genekspression mellem tumor celle undertyper kan mere pålideligt vurderes det ikke påvirkes af krydshybridisering af muse-afledte molekyler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
References
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494 (2013).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
- Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
- Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
- Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
- Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
- Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , AACR. (2014).
- Agorku, D., et al. Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , AACR. (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).
