Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

Published: July 29, 2016 doi: 10.3791/54259
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1R&D Reagents, Miltenyi Biotec GmbH, 2In vivo Tumorbiology, Oncotest GmbH

Summary

Xenografts הסרטני האנושי הוא vascularized ו הסתננו תאים ממוצא העכבר במהלך שלב צמיחת in vivo. כדי לעקוף את ההטיה הנגרמת על ידי תאי זיהום אלה במהלך ניתוח במורד זרם, פתחנו שיטה המאפשרת דלדול מקיף של כל תאי העכבר על ידי מיון תא מגנטי.

Abstract

השימוש במודלים שורת תאים במבחנה לחקר הסרטן כבר כלי שימושי. עם זאת, הוכח כי מודלים אלה אינם מצליחים לחקות גידולים המטופל באופן אמין מבחני שונות 1. Xenografts גידול האנושי מייצג את תקן הזהב ביחס ביולוגית גידול, גילוי תרופות, ומחקר גרורות 2-4. Xenografts גידול יכול להיגזר סוגים שונים של חומרים כמו שורות תאים סרטניים, רקמת גידול מגידולים מטופלים עיקריים 4 או גידולים המושתלים באופן סדרתי. כאשר מופצות in vivo, רקמות xenografted הוא שחדר ו vascularized ידי תאים ממוצא העכבר. גורמים רבים כגון ישות הגידול, מקורם של חומר xenografted, קצב צמיחה באזור ההשתלה להשפיע על הרכב וכמות תאי עכבר נוכחים xenografts גידול. עם זאת, גם כאשר גורמים אלה נשמרים קבועים, מידת זיהום העכבר התא הוא משתנה מאוד.

שיתוףבתאי עכבר ntaminating משמעותיים לפגוע ניתוחים במורד זרם של xenografts הסרטני האנושי. כמו פיברובלסטים עכבר להראות efficacies גבוהה ציפוי ושיעורי התפשטות, הם נוטים לגדול יותר תרבויות של תאים סרטניים אנושיים, במיוחד מתרבים subpopulations לאט. תא עכבר נגזר DNA, ה- mRNA, ורכיבים חלבון יכול ניתוח ביטוי גנים הטיה במורד הזרם, רצף של הדור הבא, כמו גם proteome ניתוח 5. כדי להתגבר על המגבלות האלה, פתחנו שיטה מהירה וקלה לבודד תאים סרטניים אנושיים נגעו מרקמות גידול xenografted. הליך זה מבוסס על הדלדול המקיף של תאים ממוצא עכבר על ידי שילוב דיסוציאציה רקמות אוטומטית עם Dissociator המעבדתיים רקמות מיון תא מגנטי. כאן, אנו מראים כי תאי מטרה אנושיים יכולים להיות ניתן להשיג עם purities גבוה מ -96% בתוך פחות מ -20 דקות תלויות בסוג הגידול.

Introduction

גידולים אנושיים מוצקים מורכבים פיסיולוגי רב כמו גם סוגי תאי ממאירה. הם יוצרים רקמות הטרוגנית עם מבנים ביולוגיים מורכבים. תהליכים ביולוגיים כמו הגידול היווצרות, התקדמות ותגובות כלפי טיפולים עדיין אינם מובנים במלואם. מודלים תרבית תאים במבחנה ב מייצגים כלי שימושי ללמוד ולהבין ביולוגיה הגידול. עם זאת, הם יכולים רק חלקית לשקף מבנים ותהליכים נמצאים ברקמות גידול. במודלים פרה אמינים ויציבים של גידולים בבני אדם הם תנאים הכרחיים לפיתוח תרופות אנטי גידול וטיפולי 4,6 וכן להבנת ביולוגית גידול ואת האינטראקציה של תאים סרטניים לבין סביבתם.

מודלים אנושיים xenograft גידול שמקורם בגידולים מטופלים עיקריים להראות יחסים גבוהים לרקמות ממוצא לגבי אדריכלות היסטולוגית, אינטראקציות עם מבנים מיקרו-סביבה, פוטנציאל גרורתי ותגובות לתרופות 7 במבחנה. תכונות אלו הופכות אותם תקן הזהב של במודלים פרה 4. מלבד היישום שלה בחקר הסרטן, השתלה שלא מבן-מינו של תאים אנושיים בעכברים גם משמש לעתים קרובות במחקר תאי גזע כדי לקבוע את פוטנציאל stemness והבחנה של אוכלוסיית היעד 8.

הוכח כי microvasculature האדם ותאי חיסון אנושיים מוחלפים על התפשטות in vivo של גידולים אנושיים 2,9. גורמים כגון תת סוג הגידול, קצב צמיחה, ואת האזור של השתלה יש השפעות משמעותיות על ברמה הגלובלית של חדירה וכן בהרכב סוגי תאי עכבר נמצא. עם זאת, גם כאשר הגורמים אלה נשמרים קבועים, בסך ורכב תאי עכבר הם משתנים מאוד.

ניתוחי Downstream של רקמות xenografted לעתים קרובות מאותגרים על ידי תאים ממוצא בעכברים. תרבויות עיקריות של תאים סרטניים אנושיים מן xenografts הם מגודלים לעתים קרובות על ידי פיברובלסטים. מלבד פגע הדור של שורות תאים סרטניים במבחנה, מבחנים במורד כגון בדיקות או הפרמקוקינטיקה cytotoxicity תרופה מוטים מאז בתיקון סיליקון עבור תופעות שמקורן זיהום תאי עכבר הוא בלתי אפשרי ברוב המקרים. מעבר לכך, ההצטלבות הובהרה באופן חלקי בלבד בין פיברובלסטים עכבר ותאי גידול אנושיים יש השפעה ישירה על תוצאות ניסוי של מחקרים 10. יתר על כן, הווריאציה הצפויה הנרחב ביותר של הסתננות בתאי עכבר מחריף ניתוחים במורד מולקולרי מדויקים. ב NGS או proteome מנתח כל אות עכבר נגזרות נמדדה במקום אות גידול אנושית פוחתת רגישות רצף ישירות. גם מנתח הביטוי מבוסס microarray מאותגרים על ידי nuc murineחומצות leic ואולי והכלאה צולבת בדיקות אדם.

על מנת לעקוף את המכשולים של זיהום תאי עכבר בניתוחים במורד זרם של תאים סרטניים אנושיים ממודלי xenograft גישות שונות הוצעו. במחקרים רבים תאי יעד רצויים לניתוח במורד זרם מבודדים על ידי ניצול סמנים או שילובים של סמנים לידי ביטוי אך ורק על תאים סרטניים אנושיים. עם זאת, העדר סמנים האמינים זיהוי חיובי של תאים סרטניים אנושיים לעתים קרובות מייצג מכשול גדול. אפילו רחבת סמנים הביעו, כגון EpCAM על קרצינומות אדם, לעתים קרובות להראות הבדלי ביטוי מהותי גידול 11. זה מגביר את הסיכון כי נמוך subpopulations להביע, למשל, תאים סרטניים שעברו אפיתל-to-mesenchymal המעבר, הם איבדו במהלך הבידוד. בנוסף, המחייב הישיר של סוכן בחירה לתא היעד עלול להשפיע על תוצאות הניתוח שלאחר מכן. ניסיונות של ומכלת תאי עכבר על ידיבאמצעות שילוב של נוגדנים ספציפיים עבור CD45 murine ו אפיטופים אני בכיתה MHC גם נעשו 12. עם זאת, שילוב סמן זה רק מזהה תת קבוצה של תאי עכבר. גישה נוספת היא לשפר תהליכי ניתוח על ידי תוכנה. אף על פי כן, כל הגישות הללו הן גם לא מתאימות לכל סוג של התקנה ניסיונית או לכל ישות גידול ושיטת השתלה.

במחקר זה אנו מציגים רומן שיטה מהירה עבור ומכלה בתאי עכבר מקיף מרקמות xenografted העצמאיות של זן העכבר ורקמות מוצא. בהקרנות על איברים ורקמות יעד מרובים להשתלה של xenografts (כולל עור, ריאות, מוח, כליות שרירי שלד) הצלחנו לזהות שילוב של נוגדנים המאפשרים לגילוי תאי עכבר באופן מקיף. נוגדנים אלה היו מצמידים לחלקיקים פאראמגנטי, טיטרציה אופטימיזציה עבור דלדול באמצעות מיון התא מגנטי. כפי ספציפי עכבר בלבדנוגדנים משמשים, תאי יעד אדם להישאר "נגעו" והשיטה אינה מוגבלת רקמת גידול xenotransplanted. אנו מראים כי תאי עכבר הסרה מקיפה ממדגם גידול xenografted סטנדרטיזציה ומקלים בתרביות תאים סרטניים אנושיים. יתר על כן, אנו מראים כי הניתוח של xenografts הסרטני האנושי על ידי רצף הדור הבא הוא השתפר באופן משמעותי. כמו האפקט הזה נצפה אף מבחר ספציפי אדם רצף בוצע במהלך עשרת exome, ההשפעה על הגנום כולו ועל רצף transcriptome שלם צפויות להיות אפילו יותר בולט. יחדיו, הסרת תאי עכבר באמצעות שיטה חדשנית זו מקלת טיפוח של תאים סרטניים אנושיים משפרת באופן משמעותי את הניתוחים במורד הזרם של xenografts הסרטני האנושי.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות אתיות ומשפטיות מקומיות של Regierungspräsidium פרייבורג "רפראט 35.

1. הכנת מגיב

הערה: לפני תחילת הניסוי, להכין את ריאגנטים הבאים מתוך הערכת דיסוציאציה:

  1. כדי להכין האנזים H לפזר כל בקבוקון של אבקת lyophilized ב 3 מ"ל של RPMI 1640 רוזוול פארק הזיכרון מכון 1640 (RPMI 1640) או בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM). על מנת למנוע קפיאה חוזרת פשרה להכין aliquots המתאים (למשל, 200 μl) ולאחסן אותם ב - 20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  2. כדי להכין אנזים R לפזר את הבקבוקון של אבקת lyophilized ב 2.7 מ"ל של מדיום RPMI או DMEM. על מנת למנוע קפיאה חוזרת פשרה להכין aliquots המתאים (למשל, 100 μl) ולאחסן אותם ב - 20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  3. להכין אנזים לפזר את נial של אבקת lyophilized ב 1 מיליליטר של הצפה מסופק עם הערכה בלי vortexing. על מנת להימנע חזרה הקפאה להפשרה להכין aliquots המתאים ולאחסן אותם ב (למשל, 25 μl.) - 20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. ודא ביסודיות לערבב השעיה זו מיד לפני משיכת עוצמת התגובה הנדרשת.
  4. כן 250 מיליליטר חיץ (1x PBS עם 0.5% BSA) עבור הליך הפרדת תא מכתים נוגדן.
    הערה: כאשר תאי culturing לאחר הסרת תאי עכבר לסנן את כל המאגרים ופתרונות אנזים דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.

2. גידול דיסוציאציה פרוטוקול

הערה: במחקר זה xenografts הנגזרות החולה בסרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC), סרטן הכליה ושלפוחית ​​השתן שימשו. הגידולים נוצרו על ידי השתלת xenografts של סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים (NSCLC) סרטן הכליה ושלפוחית ​​השתן ב 4 - 6 שבועות הנקבה NMRI נו / נו עכברים כפי שתואר לעיל 13 הערה: ככל פרוטוקול זה הוא עצמאי לחלוטין של סוג הגידול, ניתן להשתמש בו עבור כל סוג של מטופל או תא הנגזרות קו גידול, כמו גם סוגים אחרים של רקמה אנושית xenotransplanted ללא שינוים, את הפרוטוקול.

  1. הכן 5 מ"ל של תערובת העיכול לדגימה רקמות (עד 1 גרם) זה עתה על ידי הוספת 4.7 מ"ל של RPMI 1640 או DMEM, 200 μl של האנזים H, 100 μl של אנזים R, ו -25 μl של אנזים לתוך צינור דיסוציאציה הסלולר ( Tube C). הקפד לערבב השעית R האנזים ביסודיות לפני הנסיגה בהיקף הנדרש.
  2. להקריב את בעלי החיים באמצעות פריקת צוואר רחם בהרדמה. לחטא עכבר על ידי ריסוס עם כמות קטנה של אתנול נ 80% / נ.
  3. גידול תת עורית קציר מסירת מאגף העכבר באמצעות מלקחיים ומספריים במנדף בתרבית רקמה. חותך את העור פתוח במקום של הגידול באמצעות מספריים ואז להפריד את הגידול לרקמות בריאות סמוכה באמצעות מלקחיים ומספריים.
    הערה: בהתאם התכליתהניסוי לבצע זה השלבים הבאים בתנאי aseptic. במחקר זה בכל הצעדים בוצעו במנדף תרבית תאים בתנאי aseptic כדי להיות מסוגל לטפח את התאים.
  4. הכן את מדגם הגידול עבור digestions על ידי הסרת השומן (כמו זו תהפוך את המצוף המדגם) ואזורי נימקים (כמו זה יגרום כדאיות ירד) על ידי חיתוך משם זה באמצעות מלקחי אזמל. לרכך את הרקמה לחתיכות של 2 - 4 מ"מ באמצעות אזמלים מלקחיים.
  5. מעבירים את חתיכות רקמה לתוך הצינור C המכיל תמהיל העיכול.
  6. סגור את Tube C ולוודא שזה סגור בחוזקה. צרף אותו הפוך על השרוול של Dissociator המעבדתיים הרקמות לוודא כי פיסות הרקמה ממוקמות באזור של הרוטור / הסטטור.
  7. בחר מצב "h_tumor_01" על ידי לחיצה על "למעלה" או כפתור "למטה" עד שהמצב מופיע בתצוגה ולאחר מכן לחיצה על כפתור "התחל".
    1. אם אתהלשיר את פונקצית החימום של Dissociator הרקמות המעבדתיים, לוודא גם לצרף את החימום. ואז להפעיל מצב 37C_h_TDK_1 (עבור גידולים רכים), 37C_h_TDK_2 (עבור גידולים בינוניים) או 37C_h_TDK_3 (עבור גידולים קשים) על ידי לחיצה על סמל התיקייה על מסך המגע עד התיקייה "Miltenyi" מופיעה.
    2. כדי לבחור את המצב, לחץ על חץ למעלה או למטה עד שתופיע מצב דיסוציאציה 37C_h_TDK_2 מודגשת. השרוולים של Dissociator רקמות המעבדתיים מתוארים כעמדות בתצוגה של המכשיר. בחר את עמדות דגימות מנוהלות על-ידי לחיצה עליהם על מסך המגע. לחץ "התחל" כדי להפעיל את המצב ולהמשיך עם צעד 2.16.
      הערה: בהתאם לסוג הגידול תוכני אחר דיסוציאציה עשוי להיות מתאים (ראה שלב 2.7.1).
  8. שימו חלון המציג "סיום של תוכנית" על המסך. לאחר סיום התוכנית, לנתק Tube C מן Dissociator רקמות המעבדתיים.
  9. דגירה מדגם למשך 30 דקות ב 37° C תחת סיבוב רציף, למשל, באמצעות Rotator צינור.
  10. לאחר דגירה לצרף Tube C במהופך על השרוול של Dissociator רקמות המעבדתיים. שוב לוודא כי החומר מדגם ממוקם באזור של הרוטור / הסטטור.
  11. הפעל את h_tumor_02 תכנית דיסוציאציה (עבור גידולים רכים בינוניים) או h_tumor_01 (עבור גידולים קשים) כמתואר בשלב 2.7.1.
  12. לאחר סיום התוכנית, לנתק Tube C מן Dissociator רקמות המעבדתיים.
  13. דגירה מדגם למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף.
  14. צרף C Tube במהופך על השרוול של Dissociator רקמות המעבדתיים לאחר דגירה. שוב לוודא כי החומר מדגם ממוקם באזור של הרוטור / הסטטור.
  15. הפעל את h_tumor_03 תכנית דיסוציאציה (עבור גידולים רכים), h_tumor_02 (עבור גידולים בינוניים) או h_tumor_01 (עבור גידולים קשים) כמתואר בשלב 2.7.
  16. כדי לאסוף את החומר המדגם בתחתית הצינור לבצע short צעד צנטריפוגה (ב 100 XG במשך 10 שניות).
  17. Resuspend התאים ולמרוח על מסננת תא עם 70 מיקרומטר גודל Nesh דגש על שפופרת 50 מ"ל. שטפו את מסננת תא עם 20 מ"ל של RPMI 1640 או DMEM.
  18. צנטריפוגה השעית תא XG 300 7 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין.
  19. תאים Resuspend ב 5 מ"ל של חיץ לספור. המשך עם שחסך בתאי עכבר ידי פרדת תא מגנטית (סעיף 3).

3. דלדול תא עכבר ידי טכנולוגית הפרדת Cell המגנטית

הערה: כרכי תיוג מגנטי כדלקמן הם עד 2 x 10 6 תאים סרטניים או 10 7 תאים הכוללים כולל תאי דם אדומים. בהתאם לגודל הגידול נמוך או מספרים גבוהים יותר תא יושג. במקרה של פחות תאים, השתמש באותה כרכים כמצוין. בעת שימוש מספרים גבוהים יותר תא, בקנה מידה את כל כרכים מגיבים כרכים הכוללים בהתאם (למשל, עבור 4 x 10 6 תאים סרטניים או 2 x 10

  1. לקבוע את מספר הנייד של aliquot מן ההשעיה התא בשלב 2.21 באמצעות מיקרוסקופ קאמרית מתאים והיד עוד נטויה.
    הערה: בשלב זה את השעית התא מורכבת מתערובת הטרוגנית של תאים סרטניים אנושיים כמו גם עכבר סטרומה ותאי דם, כוללים תאי דם אדומים. רכב התאים מאוד תלוי בסוג גידול באזור להשתלה.
  2. בעת ביצוע ניתוח תזרים cytometric לאחר הסרת תאים העכבר למשוך 100 aliquots μl לצינורות המתאימים עבור רבב ושני ניתוח תזרים cytometric עבור של מכתים בקרת צבע יחיד. אחסן אותם במקרר ב 2 - 8 ° C עד צעדים מכתימים נוספים (סעיף 4).
  3. צנטריפוגה השעית תא XG ב 300 במשך 10 דקות. בטל supernatant.
  4. גלולה תא גלולה ב 80 μl של חיץ לכל 2 x 10 6 תאים סרטניים או 10 7תאים כוללים הוספו 20 μl של מגיב התיוג המגנטי עבור בתאי עכבר.
  5. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר (2 - 8 ° C). במהלך תיוג מגנטי, להכין עמודות בקנה מידה גדולות (עמודות LS) עבור פרדה מגנטית, על ידי הצבתו בתוך השדה המגנטי של מגנט מתאים (ראה טבלה של חומרים וציוד) על פי הפרוטוקול של היצרן. לשטוף את העמודה עם 3 מ"ל של חיץ.
  6. כוון את עוצמת הקול מדגם 500 μl באמצעות חיץ עד 2 x 10 6 תאים סרטניים או עד 10 7 תאים כוללים. (עד 1 x 10 7 תאים סרטניים או עד 5 x 10 7 תאים הכולל יכול להיות מעובד על עמודה LS אחד. כאשר עובדים עם תאים יותר לפצל את המדגם על עמודות LS מרובים).
    1. בעת ביצוע ניתוח תזרים cytometric, ניתוח מולקולרי או השוואת שברים בתרבויות, לסגת aliquot 50 μl כמו לדוגמה ממוינת. לאחסן אותו במקרר ב 2 - 8 ° C עד לעיבוד נוסף.
    </ Li>
  7. החל 500 μl של השעית התא על הטור שהוכן קודם לכן. אסוף זרימה דרך המכיל תאי יעד ללא תווית, המייצג את תאי גידול האנושיים המועשרים.
    הערה: כשעובד עם מספרים סלולריים גבוהים עד 2.5 מיליליטר של השעית תא זה הוכן על פי שלב 3.5 ניתן להחיל על עמודה אחת.
  8. לשטוף טור עם 2 x 1 מ"ל של חיץ. אוספים את התאים העוברות ולשלב עם דרך זרימת משלב 3.6. בצע שלבי כביסה ידי הוספת aliquots חיץ 1 המ"ל בהקדם מאגר הטור ריק.
    הערה: הזרימה דרך מכיל תאים סרטניים אנושיים מטוהרים.
  9. כדי גם לאסוף את התאים בעכבר שמר בעמודה, להסיר עמודה מן המפריד ומניח אותו על צינור מתאים. פיפטה 3 מ"ל של חיץ על הטור ומיד להשתמש הבוכנה כדי לשטוף את התאים עכבר ידי דחיפתו לתוך הטור בתקיפות.
  10. ספין למטה שברים ודגימות בקרה XG ב 300 במשך 10 דקות. Supe לשאובrnatant לגמרי ותאי resuspend במאגר, בינוני תרבות או להקפיא גלולה בחנקן נוזלי, בהתאם ליישום הזרם הרצוי.

4. ניתוח Downstream

  1. מכתים עבור ניתוח תזרים Cytometric
    הערה: לפני ביצוע ניתוחים נוספים במורד זרם, חלק תאים המתקבלים הליך דלדול עכבר תא ניתן לנתח (למשל, להעריך טוהר תשואה) ב cytometry זרימה.
    1. לקבלת תזרים cytometric מנתח, ספין לפחות 10% של חלק שלילי וחיובי המתקבל הליך הפרדת תא מגנטי (סעיף 3), כמו גם את דגימות בקרת משלב 3.2 ו -3.5 XG ב 300 במשך 10 דקות.
    2. בטל supernatant. Resuspend התא הגלול של דגימות בקרת מכתים משלב 3.2 ב 90 μl של חיץ. Resuspend שברים המתקבל הליך ההפרדה תא המגנטי 80 μl של חיץ.
    3. הוסף 10 μl של מגיב חסימת העכבר FCR לכלדגימות. מערבבים היטב דגירה במשך 5 דקות ב 2 - 8 ° C במקרר.
    4. הוסף 10 μl של PE EpCAM אנטי אנושי (שווה דילול נוגדן של 1:10) ו -25 μl של קוקטייל אנטי עכבר APC (שווה דילול נוגדן של 1: 4) על דגימות ממדור 3. מוסיפים 10 μl של אנטי EpCAM-PE האדם הן כדי מדגם בקרת צבע אחד (שווה דילול נוגדן של 1:10) ו -10 μl של אנטי אנושי EpCAM-APC לצד השני (שווה דילול נוגדן של 1:10). מערבבים את כל דגימות דגירה במשך 10 דקות ב 2 - 8 ° C במקרר.
      הערה: EpCAM אינו מתאים כסמן תאים סרטניים מכל סוג הגידול. עבור גידולים המשמשים ביטוי EpCAM במחקר זה היה ידוע.
    5. כדי לשטוף את דגימות, להוסיף 1 מ"ל של חיץ כל ספין ב XG 300 במשך 5 דקות.
    6. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה לריכוז עבור ניתוח תזרים cytometric. כדי לא לכלול תאים מתים להוסיף יודיד propidium (1 מיקרוגרם / מ"ל).
    7. ביצוע ניתוח תזרים cytometric באמצעות f מתאימהcytometer נמוך על פי הפרוטוקולים של היצרן.
  2. טיפוח של תאים סרטניים אנושיים
    הערה: בנוסף cytometry זרימה, תאים המתקבלים הליך ההפרדה יכולים להיות מתורבתים המשמש מבחנים נוספים במבחנה.
    1. Resuspend השבר מסודרים מסעיף 3 במדיום תרבות לריכוז של 5 x 10 5 תאים / מ"ל.
      הערה: בהתאם ציפוי סוג הגידול, צפיפות זריעה מתאימה, ותנאי גידול יכולים להיות שונים.
    2. הוסף 500 μl של השעיה התא לתוך בארות צלחת 24 באר מצופה עם ג'לטין 0.1%.
    3. דגירת תאי חממת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5%.
      הערה: תנאי תרבות אופטימליים תלוי בסוג הגידול בשימוש. לכן, חל תנאי התרבות מתאימים לסוג הגידול בשימוש.
  3. מכתים immunofluorescence של תאים בתרבית
    1. כן פתרון לחסימה ידי הוספת FCS 10% ו -0.1%טריטון X-100 1X PBS.
    2. מדיום תרבות מחק. הוסף 500 μl של 1x PBS לכל טוב לשטוף תאים. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ואז להשליך 1x PBS לחלוטין.
    3. תקן תאים על ידי הוספת 300 μl של פתרון 4% PFA. לדגור על RT במשך 15 דקות.
    4. בטל פתרון PFA. שטוף תאים קבועים 3 פעמים כמצוינות בשלב 4.3.2.
    5. בצע permeabilization וחסימה על ידי הוספת 300 μl של חסימה לכל טוב. לדגור על RT במשך 30 דקות.
    6. בטל חסימת פתרון. שטפו תאים כמצוין בשלב 4.3.2.
    7. הוספת 300 μl של נוגדן ראשוני מדולל חסימת פתרון התאים. נוגדן EpCAM אנטי אנושי הוא מדולל 01:40, נוגדן vimentin הוא מדולל 1: 200. דגירת הלילה ב 2 - 8 מעלות צלזיוס.
      הערה: הנוגדנים המשמשים אינם מתאימים לכל סוג גידול כמו EpCAM אולי לא לבוא לידי ביטוי על תאים סרטניים ו / או vimentin מתבטאת גם על ידי התאים הסרטניים. ודא נוגדנים המשמשים מתאימים xenograft מודל.
    8. בטל פתרון נוגדן ראשוני. לשטוף תאים 3 פעמים כמצוינות בשלב 4.3.2.
    9. הוספת 300 μl של נוגדנים משני מדולל חסימת פתרון התאים. נוגדנים שני, נגד ארנב IgG-Alexe594 ואנטי עכבר IgG-Alexa488 מדולל 1: 400. דגירה עבור שעה 1 בחושך ב RT.
    10. בטל פתרון נוגדנים משני. שטפו תאים 2 פעמים כמצוין בשלב 4.3.2.
    11. הוספת 300 μl של פתרון DAPI (0.1 מיקרוגרם / מ"ל) זה טוב. דגירה של 10 דקות בחושך ב RT.
    12. בטל פתרון DAPI. לשטוף תאים 3 פעמים כמצוינות בשלב 4.3.2.
    13. הוסף 500 μl של 1x PBS היטב כל אחד. בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ מתאים.
  4. סידור פריטי Exome
    1. עבור סידור exome שלמים (WES) כדורי הקפאת משלב 3.9 בחנקן נוזלי. חנות ולאסוף דגימות ב -80 מעלות צלזיוס.
    2. לאחר איסוף תאים, לבצע לכידת exome ו seq exome כולוuencing בהתאם להוראות היצרן של ערכת בהתאמה (ראה טבלה של חומרים וציוד).

Representative Results

גישות שונות הוצעו כדי לזהות אותך או לרוקן בתאי עכבר המופקים מגידולים אנושיים xenografted, למשל שילוב של נוגדנים ספציפיים העכבר נגד CD45 ואני בכיתה MHC עם זאת, רק תת-אוכלוסיות של תאים עכבר התגלו באמצעות שילובים אלה ואילו השילוב המוצע זוהה CD45 ו MHC אני בכיתה לבטא בתאי עכבר, כמו גם את שאר תאי העכבר נמצאים ברקמות יעד להשתלה (איור 1). ניצול שילוב הרומן הזה של נוגדנים עבור מיון תא מגנטי, תאים סרטניים אנושיים יכולים להיות מבודדים עצמאיים של סוג גידול (איור 2).

תאי מתקבל הסרת עכבר מבוסס תאי הליך הפרדת תא מגנטית יכולים להיות מתורבתים, מה שמוביל תרבויות טהורות של תאים סרטניים אנושיים (איור 4). בנוסף, תאי עכבר קיימא יכולים להיות מושגת ותרבותית מןמדגם זהה. מלבד הסרת תאי עכבר, גם פסולת הוסרה על דלדול תא עכבר (MCD) (איור 3).

הדלדול המקיף של תאי עכבר כמו גם להוביל הסרת פסולת לניתוחים במורד מולקולרי השתפרו. זה הודגם על ידי השוואת תוצאות המתקבלות רצף exome כולו (WES) בוצעו על חתיכות גידול בכמויות דגימות מדולדלות עכבר תא משלושה נגזרות חולות שונים מודלי גידול xenograft (איורים 5 - 9). הנתונים שלנו מצביעים כי הסרת תאי עכבר לפני ביצוע WES על דגימות גידולי xenograft לא רק מגבירה באופן משמעותי את הסכום הכולל של קורא (איור 5), אלא גם מפחיתה באופן משמעותי את מספר המארח נגזר קורא ממופה הגנום ההתייחסות האנושי (איור 6). כפי בטעות ממופה אלה העכבר קורא להפריע לעתים קרובות באמצעות שיחות SNP, צפינו ירידה חזקה של שקר חזהSNPs לאחר MCD (איורים 7 - 8). לבסוף, הראינו כי הסרת סיליקון ב של העכבר הנגזר קוראה בשיטות ביואינפורמטיקה לא יכול להחליף את ההליך הניסיון לחלוטין, כמו משימה מבוססת רצף חד משמעית מיני ממוצא לא הייתה אפשרית עבור כל הקורא. יתר על כן, בהליך סיליקון לא יכול נכון עבור איכות משופרת וכיסוי לקרוא במקביל גבוה של דגימות מדולדלות חוץ גופייה (איור 9).

איור 1
איור 1. הקמת קוקטייל נוגדן הכרה כל תאי העכבר פני 14 איברים מרובים. הקרנות באיברים רבים, כולל עור, ריאות, מוח, כליות שרירי שלד, בוצע. איברים אלה מייצגים את רקמות יעד מרכזיות עבור השתלה שלא מבן-מינית. צירופים כגון אלה mou ההכרהse CD45 ו MHC בכיתה אני אפיטופים כבר שימשו כדי לרוקן בתאי עכבר לאחר השתלה שלא מבן-מינו. עם זאת, שילובים סמן אלה מוכרים רק קבוצת משנה של תאי עכבר בכל הרקמות המנותחות. בשנת הקרנות קודמות שילוב של חמישה נוגדנים זוהה המאפשר זיהוי המקיף של כל התאים ממקור עכבר. לוח זה כולל תאי דם אדומים הוא עצמאי של רקמת מוצא (A, B, ו מידע לא מוצג). שונה מ 14. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. דלדול מהיר ואמין של תאי עכבר 15. Conjugates של שילוב הנוגדן עם n פאראמגנטיanoparticles שמש לפתח פרוטוקול אופטימיזציה עבור דלדול של תאי עכבר xenografts הסרטני האנושי על ידי תא מגנטי מיון (פרדת תא מגנטית) (א). פרוטוקול הרומן הזה מותר לשם מניעה> 99% של זיהום בתאי עכבר בתוך פחות מ -20 דקות, ללא קשר לסוג הגידול. שברים ניידים המתקבלים הליך הפרדת תא מגנטי תויגו עם הקוקטייל של נוגדני הפאן עכבר נוגדן ספציפי אדם נגד CD326 (EpCAM) (B). שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
בידוד איור 3. של אדם תאי Glioblastoma. ערכת שחסך בתאי עכבר שמש לבודד תאי גליובלסטומה אדם מן mous המבוגרמוח דואר. במהלך דיסוציאציה של כמויות גדולות של רקמה עצבית פסולת נוצרת בדרך כלל. MCDK מכלת תאים מתים ביעילות פסולה כפי שניתן לראות על ידי העלילה מראה גודל תא מול גרעיניות תא. עם קוקטייל המצומד זה, אפשר היה לחסל> 99% של תאי עכבר זיהום ו> 60% של הפסולת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
דלדול איור 4. עכבר תאי מקלת תרבויות Downstream של תאים סרטניים אנושיים 14. פיברובלסטים העכבר לעתים קרובות לעכב את הטיפוח של תאים סרטניים אנושיים לאחר הניתוק של רקמות מושתלות או להוביל תרבויות הטרוגנית. פיברובלסטים לצרף ולהרחיב ביעילות רבה יותר, ובכך overgrowing ג היעד אמות. זה מדאיג מבחני תרבית תאים במבחנה (בדיקות רעילות למשל, תרופה), מאז תיקון מתמטי תופעות נובעות זיהום תאי עכבר הוא בלתי אפשרי ברוב המקרים. הצד השלילי (B) והשברים חיוביים (C) לאחר דלדול עכבר תא היו בתרבית למשך שלושה ימים, קבוע מוכתם עבור סמן פיברובלסטים עכבר ספציפי (vimentin) ואת סמן הגידול האנושי ספציפי CD326 (EpCAM). כביקורת, השבר המקורי המכיל תאי unseparated (א) היה מתורבת ומוכתם גם כן. גם לאחר שלושה ימים של תרבות, אוכלוסייה טהורה כמעט של תאים סרטניים אנושיים נצפתה השבר השלילי (ב), ואילו את החלק היחסי הממוין (א) היה כמעט מגודל על ידי פיברובלסטים. רק חלק קטן של תאי היעד אבד החלק החיובי (C). השתנה מ -14.ge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. כל הפריטים Exome רצף (WES) של דגימות גידולים לפני ואחרי דלדול תא עכבר (MCD) 15. ערכנו WES על שלושה מודלים xenograft שונים נגזר כליה אנושית, ריאות וסרטן שלפוחית ​​השתן על מנת להעריך את ההשפעה של MCD על איכות נתוני רצף של הדור הבא. DNA מגידולים בתפזורת מתאי גידול מבודד לאחר שחסך בתאי העכבר היה השתמש כדי ליצור ספריות רצף שנתפס exome החלת ערכה ללכוד exome. עבור סידור על מכשיר ברצף שולחן עבודה, ערכה מגיבה ברצף שולחן עבודה 150 מחזורים, נוצל כדי ליצור 75-נ"ב לזווג סוף הקורא. עלייה משמעותית (p <0.05) בצפיפות אשכול (א) וכן aveזעם עלייה בספירת קריאה של 33% (ב) ​​נצפתה על הדגימות המדולדלות של בתאי עכבר, המציין איכות מדגם השתפרה. במקביל, ירידה חזקה של פסולת תאים מתים על MCD יכולה גם לבוא לידי ביטוי על ידי ניתוח תזרים cytometry (ראה איור 3). שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
דלדול Cell איור 6. עכבר (MCD) בתוקף מפחית המספר בטעות הממופה העכבר קורא אחרי כל פריטי Exome רצף (WES) 15. כפי oligonucleotides ללכוד המשמש להעשרה ממוקדת של רצפי מקודדי חלבונים נועדו מבוסס על גנום האדם, גידול טרום ראשוני העשרת קטעי דנ"א של fr ממקור אנושיom את התערובת של עכבר תאים אנושיים הייתה צפויה. על מנת להעריך את מספר oligonucleotides לכידת שעשוי לחצות להכליא עם הדנ"א הגנומי העכבר, ערכנו חיפושים תפציץ של כל בדיקה exome ללכוד מהירה אחת נגד גנום העכבר. פרמטרי היישור וכתוצאה ששמשו לקביעת הכלאה צולבת אפשרית. (.. אורך יישור, לא של חוסר התאמה, לא פערים) בהתאם ספי הבחירה, אנו חזינו תגובתיות צולבת של 5 - 10% של בדיקות ללכוד עם תמלילי עכבר (מידע לא מוצג). לאחר גזיר מתאם (trimmomatic v0.32 16), אנו מייפים את הקורא של כל הדגימות נגד הגנום אנושי ועכבר (v0.7.12 BWA 17) וקבענו מהמוצא המשוער שלהם בהתבסס על פרמטרי יישור בהתאמה (פגז LINUX, שורת פקודה פרל) (א). בממוצע 12% של הקורא נגזר דגימות גידולים בתפזורת יוחס בתאי עכבר. סכום זה יכול להיות מופחת ל -0.3% על ידי דלדול מראש של תאי עכבר (B איור 6 מדגים את המשימה לקרוא מפורטת גידול בכמויות תאים סרטניים אנושיים מבודדים נגזרים xenograft סרטן שלפוחית ​​השתן. שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. MCD בתוקף מפחית את מספר SNPs חזוי שווא 15. על מנת לקבוע את ההשפעה של העכבר קורא ממופה הגנום האנושי, קבענו את מספר predicteSNPs ד עבור דגימות xenograft לפני ואחרי MCD. מאחר שלא רקמה בריאה היה זמין עבור השוואה, SNP הוגדרה הבדל בין המדגם רצף ואת הגנום הפניה (hg19). לאחר הסרת כפולים קורא, SNP וקראו INDEL נערך 18 ו הוגבל באזורים אליהם מכוון ערכת ללכוד exome. 63 ± 10% מכלל SNPs ניבאו עבור דגימות גידול בכמויות הגדולות אינה אותרו כבר לאחר שחסך בתאי עכבר, 18 ± 1% היו ספציפיים עבור התאים הסרטניים האנושיים המבודדים (א). בעוד שהראשונים נגרמו בעיקר על ידי עכבר ממופה בטעות קורא את זה האחרון נראה להתגלות בשל ספירת קריאה גבוהה וכיסוי בהתאם גבוה בתוך דגימות תאים סרטניים האנושיות המבודדות. אפקט זה היה גלוי גם עבור indels חזה (B). שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה דמות.

הספרה 8
איור 8. MCD משפר את חיזוי מרשימות SNPs 15. (א) השפעת MCD על חיזוי SNP בתוך אקסון המקודדים חלבונים של הגן POLA1 19 מודגם. בעוד העכבר ממופה בטעות קורא גרם למספר SNPs ניבא באופן שקרי ב xenograft סרטן הכליה בתפזורת, SNPs אלה חסרים לאחר MCD. בנוסף, MCD גם שיפרה את התחזית של השפעה גבוהה SNPs. לדוגמא, עכבר קורא ממופה הגנום ההתייחסות האנושי במדגם גידול בתפוצה הרחב גרם להרס חזה בטעות של קודון ההתחלה של גן GRIA3 (B). שונה מ 15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

s = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 9
איור 9. סיליקו דלדול של עכבר נגזר קורא לא יכול מלא להחליף לי n Vitro 15 MCD. קורא צפוי להיות ממוצא העכבר הוסרו מחשוב מנתוני הרצף, וקראו SNP חזר על עצמו. לפי גישה זו, מספר SNPs ניבא עבור דגימות גידולים בתפזורת הופחת באופן משמעותי מ -63% ל -8.5% של המספר הכולל של SNPs (להשוות עם איור 8). עם זאת, זה בגישת סיליקון לא יכול להחליף לחלוטין את במבחנת MCD, במיוחד אם איכות המדגם המשופרת והעלייה במקביל בספירה לקריאה והכיסוי נחשב. שונה מ 15."_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פתחנו שיטה מהירה וקלה לבודד תאים סרטניים אנושיים נגעו מרקמות גידול xenografted. הליך זה מבוסס על הדלדול המקיף של תאים ממוצא עכבר על ידי שילוב דיסוציאציה רקמות אוטומטיות מיון תא מגנטי. מלבד דלדול של כל התאים בעכבר גם את כמות תאים מתים ופסולת מצטמצם משמעותית בשבריר תא המטרה. יחדיו, שיטה זו משפרת ניתוחים במורד מולקולריים משמעותית וטיפוח התאים סרטניים אנושיים.

בניגוד לשיטות חלופיות, אין צורך בידע של סמנים ספציפיים תאים סרטניים, התאמה שונה קומפוזיציות של תאי עכבר או הקמת אלגוריתמים. השיטה המוצגת היא עצמאית של זן העכבר וסוג הגידול. לכן, הטיה דרך בידוד של תת-אוכלוסיות של גידולים בבני אדם על בסיס סמנים ספציפיים אנושיים אחת אשר עשוי להשתנות ביטוי, כפי שמוצג על EpCAM 11, היא להימנעed. יתר על כן, זה אינו מוגבל לחומר גידול אך יכול לשמש לכל סוג של רקמת xenotransplanted כתאי עכבר ממוקדים במקום תת-אוכלוסיות של גידולים בבני אדם ספציפיים (מידע לא מוצג).

הסרה מקיפה של תאי עכבר היא הקלה על ידי מיקוד אפיטופים שטח לידי ביטוי אך ורק על תאים ממוצא עכבר. מלבד השיטה המבוססת היטב עבור דיסוציאציה גידול כפי שהוצג במחקר זה, קיימים נהלים רבים באמצעות סוגים שונים של אנזימים. שימור אפיטופים פני התא הוא תנאי הכרחי שיטה חדשנית זו, אלא גם עבור ניתוחים מדויקים של אוכלוסיות תאים סרטניים אנושיות. לכן, חשוב כי אנזימים עדינים משמשים לעיכול של רקמת גידול. לפיכך, דלדול תא עכבר ניתן להשתמש רק בשילוב עם נהלי עיכול אנזימטי שכנראה אינו משפיעים אפיטופים ממוקדים במהלך הליך שחסך בתאי עכבר. במקרה של ספק זה ניתן לאמת רק על ידי היצרן, בהתאמה.

הסרת תאי עכבר משפרת באופן משמעותי את התרבות של תאים סרטניים אנושיים על ידי הימנעות לגדול תרבות של פיברובלסטים עכבר. בנוסף, הניתוח של xenografts הסרטני האנושי על ידי הרצף של הדור הבא הוא השתפר באופן משמעותי טופל. כמו האפקט הזה נצפה אף מבחר רצף ספציפי אדם ממוקד בוצע במהלך עשרת exome, ההשפעה על הגנום כולו ועל רצף transcriptome שלם צפויות להיות אפילו יותר בולט.

יתר על כן, השיטה המוצגת מקלה ACCURAמחקרים מולקולריים te של תת-אוכלוסיות גידול בתוך גידולים אנושיים xenotransplanted. הסרת תאי עכבר ממדגם בהתאמה בשלב הראשון ולאחר מכן מיון תאים סרטניים אנושיים בשתי תת-אוכלוסיות שונות מאפשרת השוואה מולקולרית ישירה של תת-אוכלוסיית הגידול מעניין תאים סרטניים בתפזורת אדם 20. ביטוי גנים דיפרנציאלי בין תת תא גידול ניתן להעריך בצורה מהימנה יותר כפי שהוא אינו מושפע הכלאה צולבת של מולקולות נגזרות עכבר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tumor Dissociation Kit, human Miltenyi Biotec 130-095-929 contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions
RPMI 1640 Biowest L0501-500
gentleMACS C-Tubes Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
MACS SmartStrainer (70 µm) Miltenyi Biotec 130-098-462
Petri dish 100 mm Various
Scalpel Various
Mouse Cell Depletion Kit Miltenyi Biotec 130-104-694
PBS Various use 1x PBS for PEB buffer
EDTA Sigma-Aldrich 3610 use final concentration of 2 mM in PEB buffer
BSA Miltenyi Biotec 130-091-376 or use 5 mg/L BSA in PEB buffer
MACS LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
PreSep filters (70 µm) Miltenyi Biotec 130-095-823
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
CD326-FITC, human Miltenyi Biotec 130-080-301 use 1:40 for immunofluorescence staining 
anti-Vimentin antibody abcam ab92547
goat-anti-mouse IgG-Alexa488 Life Technologies A11029
goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 Life Technologies A11012
DAPI Sigma-Aldrich D9542 dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate 
Inside Stain Kit Miltenyi Biotec 130-090-477 InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining 
FBS Various
Triton X-100  Sigma-Aldrich 93418
FcR Blocking Reagent, mouse Miltenyi Biotec 130-092-575
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100g
Nextera Rapid Capture Enrichment Kit Illumina FC-140-1000
MiSeq Reagent Kit v3 Illumina MS-102-3001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
  2. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  5. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494 (2013).
  6. Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
  7. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
  8. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  9. Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
  10. Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
  11. Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
  12. Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
  13. Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
  14. Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , AACR. (2014).
  15. Agorku, D., et al. Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , AACR. (2015).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  18. Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).

Tags

רפואה גיליון 113 אונקולוגיה תאי גזע סרטני מודלי xenograft גידול רקמות xenografted פיתוח תרופות דוגמנות פרה-קלינית הקמת קו התא רצף הדור הבא רצף exome כולו תרבית תאים סרטנית קורא SNP ביולוגית הסרטן
חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Agorku, D. J., Tomiuk, S., Klingner, … More

Agorku, D. J., Tomiuk, S., Klingner, K., Wild, S., Rüberg, S., Zatrieb, L., Bosio, A., Schueler, J., Hardt, O. Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells. J. Vis. Exp. (113), e54259, doi:10.3791/54259 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter