Introduction
Proteine sind die am häufigsten vorkommenden Makromolekülen in Zellen, und sie spielen eine wesentliche Rolle in praktisch allen biologischen Prozessen. Die biologische Aktivität der meisten Proteine erfordert deren Faltung in und Wartung, die nativen dreidimensionalen Strukturen. Proteine mit aberranter Konformationen nicht nur ihre normale Funktion verlieren, sondern auch bilden häufig lösliche oligomere Spezies oder Aggregate, die die Funktionen von anderen Proteinen beeinträchtigen und sind toxisch für Zellen 1,2. Um dem entgegenzuwirken , falsch gefaltete Proteine, verwenden Zellen , die beide molekulare Chaperone, die entfaltete oder teilweise gefaltete Polypeptide unterstützen , um ihre native Konformation zu erreichen, und Abbauwege, die falsch gefaltete Proteine 3 zu beseitigen. Angesichts der Komplexität und der stochastischen Natur des Faltvorgangs, Protein misfolding unvermeidlich, und es kann nicht in dem Fall von Mutationen, biosynthetische Fehler umgekehrt werden, und posttranslationale Schäden 1. Daher verlassen Zellen schließlich auf degradatIonenwege, um ihre Proteinqualität aufrecht zu erhalten.
Die Bedeutung der zellulären Proteinqualitätskontrolle (PQC) -Systemen wird durch das Vorherrschen von Protein-Fehlfaltungen Krankheiten, einschließlich Krebs, Diabetes, und viele neurodegenerative Störungen wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Huntington-Krankheit (HD) unterstrichen, und spinocerebellar Ataxien (SCA) 4,5. Beispielsweise Mutationen in dem p53 - Tumorsuppressor ist die einzige am häufigsten genetischen Läsion in Tumoren, verbunden mit ~ 50-70% aller Fälle 6. Ein wesentlicher Anteil von p53 - Mutationen sind Missense - Mutationen , welche die Konformation von p53, was zur Bildung von Aggregaten 7 verändern. Darüber hinaus Proteine mit erweiterter polyQ Strecken sind genetisch und pathologisch mit HD und SCA in Verbindung gebracht. Diese progressiven und oft tödlichen Krankheiten manifestieren, wenn die Länge des polyQ Strecke in den betroffenen Proteine eine bestimmte THRES überschreitethalten, und wird zunehmend schwerer als die Länge des polyQ Strecke 8 verlängert.
Ein vielversprechender Ansatz, diese Krankheiten zu behandeln ist, um therapeutisch zellulären PQC Systeme zu stärken, insbesondere die Abbauwege. Jedoch involviert die Wege in der Degradation von fehlerhaften Proteine, insbesondere solche, in Säugerzellen, bleiben wenig verstanden. Obwohl es erkannt wurde, dass das Proteasom für den Abbau von falsch gefalteten Proteine von entscheidender Bedeutung ist, ein zentrales Thema bleibt undefiniert: wie falsch gefaltete Proteine sind für den Abbau spezifisch erkannt und zielgerichtet. Darüber hinaus, obwohl PQC Systeme in zellulären Kompartimenten einschließlich Zytoplasma identifiziert wurden, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Mitochondrium, bleiben die PQC Systeme im Kern unklar 2.
Neuere Studien von unserem Labor haben ein System identifiziert, das eine Vielzahl von falsch gefalteten Proteinen in den Zellkern erkennt und verschlechtertvon Säugerzellen 9. Dieses System besteht aus dem promyelocytic Protein (PML), einem Kernprotein und einem Mitglied des tripartite motif enthaltenden (TRIM) Proteinfamilie und RNF4, eine RING-Domäne enthaltendes Protein. PML und mehrere andere Proteine TRIM besitzen SUMO (small ubiquitin-like Modifier) E3 - Ligase - Aktivität, die die Spezifität und Effizienz der Protein SUMOylierung 10 erleichtert. RNF4 gehört zu einer kleinen Gruppe von SUMO-bezogene Ubiquitinligasen (Stübl), die einen oder mehrere Sumo-interacting Motive (SIMs) zusätzlich zu der RING - Domäne , die ihnen die Ubiquitin - Ligase - Aktivität 11 bietet. Wir fanden, dass PML erkennt spezifisch misfolded Proteine durch einzelne Substraterkennungsstellen, die unterschiedliche Merkmale auf falsch gefaltete Proteine erkennen können. Bei der Bindung, PML-Tags fehlgefaltetem Proteine mit poly-Ketten von SUMO2 / 3, zwei nahezu identische Säuger SUMO Proteine, die poly-Ketten aufgrund der Existenz eines internen SUMOylierung Stelle bilden kann. SUMOylated misfolded Proteine werden dann durch RNF4 erkannt, die ihre Ubiquitinierung und Abbau im Proteasom führt. Wir haben gezeigt , weiter , dass die PML-RNF4 System zum Schutz gegen Neurodegeneration wichtig, da Mangel in PML die Verhaltens- und neuropathologischen Defekte eines Mausmodells von SCA Typ 1 (SCA1) 9 verschärft.
Um den Proteinabbau von anderen zellulären Mechanismen unterscheiden , die Proteinspiegel regulieren kann, wurde die Rate der Proteinumsatz 9 gemessen. Unter den am häufigsten verwendeten Methoden Proteinumsatz sind Puls Chase und Cycloheximid (CHX) Jagd zu bestimmen. Diese beiden Methoden untersuchen, über die Zeit bzw. die Radioisotop-markierte Proteine von Interesse in übersetzungs bewandert Zellen und Gesamt vorbestehenden Proteine von Interesse in Translation-inhibierten Zellen. Allerdings ist eine große Herausforderung, pathogene und Fehlfaltungen neigende Proteine für die Untersuchung, dass die Halbwertszeit dieser Proteine extrem lo sein kannng. Beispielsweise Ataxin-1, Ataxin-7, Huntingtin, α-Synuclein und TDP-43 haben alle Halbwertszeit von mehr als 12 bis 24 h 9,12-16. Die langsamen Umsatzraten dieser Proteine schließen die Verwendung der Analyse CHX chase, weil die Zellen, die diese Proteine beherbergen kann nicht längere Übersetzung Hemmung überleben, vor allem weil die misfolded Proteine können selbst hochtoxisch für Zellen sein. Die Pulse-Chase-Analyse mit Isotopenmarkierung kann auch für Proteine eine Herausforderung sein, die stark zur Aggregation neigen. Die meisten Pulse-Chase-Assays beruhen auf Immunpräzipitation des Proteins von Interesse von den anderen Proteinen abzutrennen, die auch radioaktiv markiert sind. Dieses Verfahren umfasst in der Regel langwierig Immunpräzipitation und Waschverfahren, bei dem SDS-unlösliche Aggregate bilden können, ungenaue die Analyse mit SDS-PAGE-Elektrophorese zu machen.
Hier ist ein Protokoll zur nuklearen misfolded Proteine analysieren mit einem langsamen Umsatzrate 9 beschrieben wird ,. Eine pathogene Form von Ataxin-1 (ATXN1) , die eine Strecke von 82 Glutamine (ATXN1 82Q) enthält , wird zu diesem Zweck 8 verwendet. Wenn in Zellen exprimiert wird , eine verstärkte grün fluoreszierende Protein (GFP) Fusion von ATXN1 82Q Formen mikroskopisch sichtbare Einschlüsse im Kern (1A). Pulse - Chase - Analyse zeigt , dass die Halbwertszeit von Ataxn1 82Q ist über 18 Stunden 9. ATXN1 82Q mit misfolded Konformationen unterschiedlicher Eigenschaften von Arten zusammengesetzt, sowie Spezies mit nativer Konformation. Es ist wahrscheinlich, dass diese Arten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten abgebaut werden, und sollte daher separat analysiert werden. Lysate aus ATXN1 82Q-GFP-exprimierenden Zellen werden fraktioniert in NP-40-löslich (löslich oder NS, wahrscheinlich repräsentieren native Proteine oder falsch gefaltete monomeren / oligomeren Proteine) und NP-40-unlöslichen (NI, aggregiert / misfolded) Portionen. Letztere kann weiter in SDS-löslichen (SS; wahrscheinlich ungeordnete Aggregate) unterteilt werden oder SDS-resistenten (SR; wahrscheinlich Amyloidfibrillen) Fraktionen (1B). NS und SS-Fraktionen können durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot, während der SR-Fraktion durch Filterverzögerungs Assays detektiert werden kann durch Immunoblotting gefolgt analysiert werden. CHX chase wird mit dem Detergens Fraktionierungsverfahren kombiniert und entdeckt , dass die Halbwertszeit von SS ATXN1 82Q ist viel kürzer als die von NS ATXN1 82Q und insgesamt ATXN1 82Q (2A), was darauf hinweist , dass die SS - Fraktion leicht erkannt und abgebaut in Zellen 9. Somit stellt diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik von falsch gefalteten Proteine zu untersuchen und deren Abbaumuster zu vergleichen.
Wir beschreiben auch ein Verfahren, das für Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung von Makromolekülen oder kleinen Verbindungen geeignet ist, die den Abbau fehlgefalteter Proteine modulieren können. Dieses Verfahren basiert auf einer konformationell destabilisiert Mutante von Glühwürmchen - Luciferase (LucDM) 17, einem Modell Chaperon Substrat. Wir haben Sicherungd LucDM zu einem Kernlokalisationssignal (NLS), die PQC Systeme in diesem Zellkompartiment zu sondieren, und GFP (NLS-LucDM-GFP) zur Erleichterung der Erkennung. NLS-LucDM-GFP Formen mikroskopisch sichtbare Kern Aggregate in einem kleinen Prozentsatz der Zellen (3A). Ähnlich wie bei ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-aber nicht seine Wildtyp - Gegenstück NLS-LucWT-GFP-durch SUMO2 / 3 modifiziert und reguliert durch die PML-RNF4 Weg 9. NLS-LucDM-GFP bildet auch SS und SR-Arten, obwohl die relativen Mengen von SS und SR Spezies minimal sind im Vergleich zu NS, unter Verwendung der in Protokoll 3 unten beschriebenen Bedingungen. Um den Assay zu vereinfachen, analysieren wir nur SDS löslich LucDM (einschließlich sowohl der NS und SS-Fraktionen) durch SDS-PAGE und Western Blot. Wichtig ist , zeigte CHX chase - Assay , dass die Halbwertszeit von SDS-löslichen NLS-LucDM-GFP ist viel kürzer als die der Wildtyp - Gegenstück (3B), was darauf hindeutet , dass LucDM ein spezifisches Substrat für das System ist , das und verschlechtert erkenntmisfolded Proteine.
Der Abbau von LucDM-GFP führt zu einem deutlichen Rückgang der Gesamtfluoreszenzsignal. Daher haben wir entwickelt auch ein Protokoll für Echtzeit-Erkennung von zellulärer LucDM-GFP Fluoreszenz basierenden Assay unter Verwendung von Mikrotiterplatten. Viele Hochdurchsatz - Screening (HTS) Systeme für Medikamente oder Gene Zellaggregaten und zelluläre Lebensfähigkeit durch anomale Proteine 18-20 verursacht Modifikation entwickelt. Jedoch sind sehr wenige HTS speziell für den Abbau in Säugerzellen abzielt. Dieses Protokoll dient als robustes System für die schnelle und umfangreiche Analyse der Auswirkungen der Proteinexpression, Knockdown und medikamentöse Behandlung auf die zelluläre misfolded Proteinabbau. Verwendung von HeLa-Zellen, wie beispielsweise unterhalb wir die Protokolle für die Analyse dieser beiden misfolded Proteine beschreiben. Die Assays können auch auf andere Zelllinien angewendet werden, obwohl Transfektionsbedingungen und Zeitverlauf benötigen für einzelne Zelllinien optimiert werden.
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Protocol
1. Herstellung von Reagent
- Bereiten Zelllyse - Puffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 0,5% NP-40). Ergänzung 2 mM DTT, 1x vollständige Protease-Cocktail, und 250 IU / ml Benzonase vor dem Gebrauch.
- Bereiten Pelletpuffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl 2). Ergänzung 2 mM DTT, 1x vollständige Protease-Cocktail und 250 IU / ml Benzonase vor dem Gebrauch.
- Bereiten 3x siedende Puffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT vor dem Gebrauch.
- Bereiten Sie Low-Fluoreszenz DMEM-Medium für Tests unter Verwendung von Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader. Mischungs 25 mM Glucose, 0,4 mM Glycin, 0,4 mM Arginin, 0,2 mM Cystein, 4,0 mM Glutamin, 0,2 mM Histidin, 0,8 mM Isoleucin, 0,8 mM Leucin, 0,8 mM Lysin, 0,2 mM Methionin, 0,4 mM Phenylalanin, 0,4 mM Serin, 0,8 mM Threonin, Tryptophan 0,078 mM, 0,4 mM Tyrosin, 0,8 mM Valin, 1,8 mM CaCl 2, 0,81 mM MgSO 4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO 3, 110 mM NaCl, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Der pH-Wert der Lösung mit HCl oder NaOH auf pH 7,4. Sterilisieren des Mediums durch Filtration.
Hinweis: Dieses Medium enthält Komponenten des Standard - DMEM - Medium mit hohem Glucosegehalt , außer dass Fe (NO 3) 3, Vitamine und Phenolrot weggelassen. Phenolrot, Riboflavin und Pyridoxal in regelmäßigen DMEM - Kulturmedium mit der Detektion von Fluoreszenzsignal 21 erheblich stören. Das Kulturmedium ohne diese Komponenten ist entscheidend für eine erfolgreiche Live-Cell-GFP-Bildgebung. Das Medium ist stabil für 12 Monate bei gekühlter Lagerung.
2. Der Abbau Assay von ATXN1 82Q GFP
- Platte etwa 3 x 10 5 HeLa - Zellen in 35 mm - Platten mit DMEM - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, so daß nach O / N Kultivieren von Zellen auf eine Konfluenz von 40-60% zum Zeitpunkt der Transfektion wachsen.
HINWEIS: Die Anzahl von Platten benötigt wird, basierend auf der Anzahl von Zeitpunkten und Behandlungen dunter escribed. - Transfizieren HeLa - Zellen mit 0,3 & mgr; g ATXN1 82Q-GFP / pRK5 Plasmids in jede Vertiefung Reagenz Transfektion Herstelleranweisung gemäß 9. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz und Aliquotierung es für jeden gut.
- 4-5 Stunden nach der Transfektion, untersuchen Sie die lebenden Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm. Rück Zellen zurück zu Inkubator nach der Bebilderung.
Hinweis: Beachten Sie die beiden diffuses GFP-Signale und kleine Sprenkel von GFP-Signale in Kern zu diesem Zeitpunkt. - Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und 2 ml frisches DMEM, das 50 ug / ml CHX. Behandlung von Zellen für 0, 4, 8, 12 und 16 h mit CHX vor der Ernte. Um den proteasomalen Abbau, sind Proteasom-Inhibitor MG132 (10 & mgr; M) in einer Platte behandelt für 16 Stunden als Kontrolle untersuchen.
- Ernten Sie eine Platte von Zellen zu jedem Zeitpunkt. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung eind die Platten zweimal mit 3 ml eiskaltem 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) waschen. Snap-gefrieren die Platte auf Trockeneis.
- Nach dem letzten Zeitpunkt (16 Stunden), kratzen die gefrorenen Zellen (aus allen Zeitpunkten) in 150 ul eiskaltem Puffer Zelllyse und für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
- Zentrifugieren der Zelllysate in einer Tischzentrifuge bei 17.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
- Den Überstand, die NP-40-löslichen (NS) Proteine enthält, in ein anderes Röhrchen mit einer Pipette.
HINWEIS: Stände Verwendung für Proteinkonzentrationen von Bradford-Test messen, wenn nötig. - Spülen Sie die Pellets durch sanft Zusatz von ca. 200 ul 1x PBS auf die Rohre, ohne die Pellets zu stören. Sorgfältig PBS durch Absaugung oder Pipette entfernen. Re-suspendieren sie in 150 ul eiskaltem Zellpelletpuffer, gefolgt von 15-30 min Inkubation auf Eis.
HINWEIS: Die resuspendierte Pellet-Fraktion enthält NP-40 unlöslich (NI) Proteine. Siehe Abbildung 1B für eine diagWidder der Waschmittel-Fraktionierung. - In 75 ul 3x siedendem Puffer in NS-Fraktionen und NP-40 unlöslich (NI) Fraktionen, die aus den Pellets suspendiert. Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C auf einem Heizblock für 5 min.
HINWEIS: Clumps in den NP-40 unlöslichen Fraktionen werden aufgelöst nach dem Erhitzen und Proben wird deutlich werden. - In SDS-Gelladepuffer auf eine aliquote Menge von gekochtem NS und NI. Laden gleichen Volumen von Proben aus allen Zeitpunkten auf SDS-PAGE-Gel aufgefangen. Die Volumen geladen entspricht etwa 20 & mgr; g NS von der Probe zum Zeitpunkt 0 NOTE gesammelt: NS sowie SDS-löslichen (SS) Protein aus NI-Fraktion kann durch SDS Trenngel gelöst werden. Im Gegensatz dazu SDS-resistente (SR) Aggregate von NI Fraktion werden in den Gel - Befüllungs - Wells (1B) stecken. Zur Western-Blot-Erkennung, doppeltes Volumen von NI verbessern können geladen werden.
- Erkennen NS und SS ATXN1 82Q-GFP durch Western-Blot unter Verwendung von anti-GFP-Antikörper und verstärkte Chemilumineszenz (ECL).
HINWEIS: ATXN1 82Q in der SS-Fraktion wird in der Regel im Vergleich weniger auf die NS-Fraktion, wenn dieses Protokoll verwenden. Längere ECL Belichtung für optimale Signale benötigt. - Untersuchen SR ATXN1 82Q von der Pelletfraktion durch Filterverzögerungs Assays unter Verwendung eines Dot-Blot - Vorrichtung (1B). Kurz gesagt, stellen Sie eine 0,2 um Celluloseacetat-Membran eine Dot-Blot-Vorrichtung hält. Last 80-120 ul gekocht NI in jede Vertiefung der Dot-Blot-Apparatur.
Hinweis: Da nur geringe Mengen an SR-Aggregate in den Zellen gebildet werden, für die Dot-Blot-Assay, laden ein Volumen des SR-Fraktion, die etwa 10-15 mal des Volumens des NS-Fraktion für Western-Blot-Analyse verwendet wird.- Nach dem Filtrieren der Proben durch die Membran durch Vakuum, ATXN1 82Q-GFP - Aggregate auf der Membran stecken kann 9,12,22 von anti-GFP - Immunoblotting nachgewiesen werden.
HINWEIS: Siehe vorherigen Berichte 9,12,22 für detaillierte Beschreibung der Filter Retardation - Assay. Dieser Schritt ist optionalweil SR ATXN1 82Q ist minimal im Vergleich zu SS und NS Fraktionen, die die kurze Transfektion in diesem Protokoll beschrieben folgen. Darüber hinaus bleiben die Ebenen der SR ATXN1 82Q weitgehend gleich über CHX chase (2B). Jedoch ist es immer noch von entscheidender Bedeutung zu prüfen, ob die Mengen von SS ATXN1 82Q sind im Laufe der Zeit beeinflusst für jede medikamentöse Behandlung oder Genexpression in anfänglichen Experimenten. SS Proteinspezies bleiben in SDS-PAGE-Gel Befüllungs-Wells kann durch Western-Blot nachgewiesen werden. Jedoch ist dieses Verfahren weniger empfindlich und erzeugt mehr variable Ergebnisse (1B).
- Nach dem Filtrieren der Proben durch die Membran durch Vakuum, ATXN1 82Q-GFP - Aggregate auf der Membran stecken kann 9,12,22 von anti-GFP - Immunoblotting nachgewiesen werden.
3. Degradation Assay von NLS-Luciferase-GFP unter Verwendung von SDS-PAGE und Western-Blot
- Platte etwa 3 x 10 5 HeLa - Zellen in 35 mm - Platten mit DMEM - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Nach O / N Kultivierung eine Konfluenz von 40-60% zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen. Die Anzahl von Platten benötigt wird, von der Anzahl der t basierendime Punkte und Behandlungen im Folgenden beschrieben.
- Transfizieren HeLa - Zellen mit 1,0 ug NLS-Luciferase-GFP / pRK5 Plasmid in jedes Well Reagenz Transfektion Herstelleranweisung gemäß 9. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz für aliquoten jeder Vertiefung.
- Nach O / N-Transfektion (etwa 15 Stunden), die lebende Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm zu untersuchen. Rück Zellen zurück zu Inkubator nach der Bebilderung.
HINWEIS: Diffuse Kern GFP-Signal kann in der Mehrzahl der Zellen (70%) beobachtet werden. Ein kleiner Anteil (5%) von Zellen haben Kern Aggregate. - Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und 2 ml frisches DMEM, das 50 ug / ml CHX. Behandeln Sie Zellen für 0, 1,5, 3, 4,5 und 6 Stunden mit CHX vor der Ernte. Um den proteasomalen Abbau, zusätzliche Proteasom-Inhibitor MG132 (10 & mgr; M) in einer Platte behandelt 6 Stunden als Kontrolle untersuchen.
- Ernten Sie eine Platte von Zellen zu jedem Zeitpunkt. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und waschen Sie die Platten zweimal mit 3 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS). Snap-gefrieren die Platte auf Trockeneis.
- Nach dem letzten Zeitpunkt (6 Stunden) ist abgeschlossen, bei gefrorenen Zellen Allzeitpunkte werden für 30 min in 150 ul eiskaltem Zelllysepuffer und inkubiert auf Eis gekratzt.
- Hinzufügen SDS-Gel-Ladepuffer zu Ganzzelllysaten für eine Endkonzentration von 2% SDS und 50 mM DTT. Inkubieren Proben auf einem Heizblock bei 95 ° C für 5 min.
- Analysieren NLS-Luciferase-GFP durch SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung von Anti-GFP-Antikörper. Laden gleichen Volumen von Proben aus allen Zeitpunkten auf SDS-PAGE-Gel aufgefangen. Das Volumen entspricht etwa 20 & mgr; g Ganzzelllysaten von Probe bei der Zeit gesammelt 0 geladen.
4. Echtzeit-Abbau-Test der NLS-Luciferase-GFP mittels Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader
- Samen etwa 1 x 10 & sup4 ;HeLa-Zellen in schwarz 96-Well-Gewebekulturplatten mit transparentem Boden. Nach O / N Kultivierung eine Konfluenz von 50-70% zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen.
HINWEIS: 60 ul Medium vollständig suspendiert HeLa-Zellen enthalten, werden direkt in jede Vertiefung ausgesät. Nicht zusätzliches Medium oder Steinplatte nach dem Aussäen hin und her hinzufügen, sonst können Zellen ungleichmäßig verteilt werden. - Transfizieren HeLa - Zellen mit 0,05-0,1 ug NLS-Luciferase-GFP / pRK5 Plasmid 9 in jede Vertiefung Reagenz Transfektion Herstelleranweisung entsprechend. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz und Aliquotierung es für jeden gut. Drei Brunnen mit Zellen nicht mit DNA transfiziert, die für die Hintergrundfluoreszenzsignal für jede Behandlungsbedingung als Kontrolle dient.
ANMERKUNG: Eine alternative Weise Transfektion Variation zu reduzieren ist, Zellen zu transfizieren, vor der Aussaat. Jedoch transfiziert ein großer Anteil von Zellen mit fehlgefaltetem Proteins scheitern reduzierte Lebensfähigkeit zu befestigen oder zeigen mit dieser Methode. Es ist wahrscheinlich, dass einige Zellen möglicherweise nicht die durch Trypsin Verdauung verursacht Stress stehen, wenn toxische misfolded Proteine exprimieren. Als Ergebnis wird die Gesamtfluoreszenzsignal wesentlich reduziert. - 20-24 Stunden nach der Transfektion, untersuchen Sie die lebenden Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm.
- Entfernen Sie das Medium durch Absaugung. Hinzufügen, etwa 200 ul 1x PBS in jede Vertiefung und dann Restmenge an DMEM-Medium zu entfernen anzusaugen.
- Hinzuzufügen 60 ul Low-Fluoreszenz DMEM-Medium mit 5% FBS und 50 ug / ml CHX. Um den proteasomalen Abbau, zusätzliche Proteasom-Inhibitor MG132 (10 & mgr; M) in einer Reihe von Proben zu untersuchen. Stellen Sie dreifach von Vertiefungen für jede Behandlung / Zustand.
HINWEIS: MG132 Behandlung wird als Kontrollen für den proteasomalen Abbau enthalten, da es entscheidend ist, andere Faktoren auszuschließen, die Tropfen Fluo verursachen könnenzenz Signal, einschließlich Zelltod und Fluoreszenzlöschung. - Messen Sie das Fluoreszenzsignal von GFP sofort auf einem Fluoreszenzplattenleser nach CHX Zugabe.
Hinweis: Die Software Messeinstellungen sind in Tabelle 1 gezeigt. - Lesen Sie jede Stunde die Platte für bis zu 8-10 Stunden. Nach der Lektüre, Rückkehr zur Zellkultur-Inkubator der Platte zurück.
- Exportieren Sie die Daten als Tabellenkalkulationsdatei. Verwenden Mittelwert von Multi liest für jede Vertiefung als Fluoreszenzintensität. Normalisieren Werte jedes Datenpunktes auf die Mittelwerte der Zeit 0 in den jeweiligen Gruppen. Plotten der normierten Fluoreszenzintensität über die Zeit , wie in 4A und 4B gezeigt ist , und Figur 5, rechte Felder.
- Führen Sie eine statistische Analyse der Abbauraten zwischen zwei Zuständen unter Verwendung von Zwei-Wege - ANOVA mit wiederholten Messungen 23.
HINWEIS: In dieser Analyse "Fluoreszenzintensität" ist die abhängige Variable während "treatmbungsbedingungen "und" Zeit "sind die beiden Faktoren. Statt Daten zu einzelnen Zeitpunkten zu vergleichen, Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen den Unterschied zwischen den beiden Behandlungsgruppen über die gesamte Zeitverlauf analysiert.
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Representative Results
50% der HeLa - Zellen 20 Stunden nach der Transfektion (1A) - in einem stationären Zustand Analyse können mikroskopisch sichtbare ATXN1 82Q-GFP Kern Aggregate in 30 beobachtet werden. Western - Blot - Analyse von NS und SS - Fraktionen unter Verwendung von Anti-GFP - Antikörper zeigt eine deutliche Bande von ATXN1 82Q-GFP zwischen 100 kDa und 150 kDa - Marker, an das Protein des Molekulargewicht entspricht (1B). ATXN1 82Q-GFP in der SR - Fraktion kann entweder durch Filterverzögerungs Assay oder durch SDS-PAGE und Western - Blot wie Spezies an der Spitze des Stapel Gel (1B) detektiert werden. Für die Analyse Halbwertszeit oben beschriebenen Protokoll verwenden, startet CHX Chase 4-5 Stunden nach der anfänglichen Transfektion, bevor irgendwelche großen Kernaggregate gebildet werden. Die Halbwertszeit von ATXN1 82Q-GFP in der SS - Fraktion beträgt ca. 5 Stunden, im Gegensatz zu einem geringen oder keiner Abnahme der ATXN1 82Q-GFP in der NS - Fraktion über 16 h (2A). Die degradation von ATXN1 82Q-GFP wird durch Behandeln Zellen mit MG132 (2A) teilweise gehemmt. Wir haben bereits gezeigt, dass PML den Abbau von falsch gefalteten Protein stimuliert durch ihre SUMOylierung fördern. Hier verwenden wir PML Zuschlags als Beispiel für veränderte Abbauweg. PML siRNA Behandlung verlängert die Halbwertszeit von ATXN1 82Q-GFP in der SS - Fraktion (2A). Keine offensichtlichen Änderungen in SR ATXN1 82Q-GFP werden entweder Kontrolle oder PML siRNA-behandelten Zellen (2B und 2C) nachgewiesen.
Zwanzig Stunden nach der Transfektion NLS-LucDM-GFP Aggregate werden mikroskopisch sichtbar in 5 bis 15% der HeLa - Zellen, aber je nach den Mengen der DNA variieren kann , die (3A) transfiziert werden. Die Halbwertszeit von SDS löslichen NLS-LucDM-GFP ist 2 - 3 h (3B und 3C). Die Fluoreszenzintensität transfizierter Zellen verringert auch überZeit auf CHX - Behandlung (4A und 4B). Sechs Stunden nach CHX - Behandlung, die Fluoreszenzintensität erreicht eine stabile Phase und stoppt abnehm (4A und 4B). Zur gleichen Zeitpunkt, lösliche NLS-LucDM-GFP ist weitgehend abgebaute (3B und 3C), was darauf hindeutet , dass die restliche Fluoreszenz von aggregierten Spezies resistent gegen Abbau erzeugt wird. Konsequent, aggregiert, aber nicht diffundiert, bleibt GFP in Zellen 9 h nach CHX - Behandlung (4C). Interessanterweise Transfektion eine höhere Menge an NLS-LucDM-GFP - Plasmid erzeugt mehr Kernaggregate sowie höhere Intensität der verbleibenden Fluoreszenz unter Verwendung, obwohl die Abbaurate nicht beeinflusst wird (4A und 4B). Unter Verwendung entweder SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot oder Fluoreszenzmesswert, sind wir in der Lage, die Hemmung der NLS-LucDM-GFP-Abbau durch MG132 Behandlung zu erkennen oder PML siRNA (3C, 4A, 4B und 5).
Abbildung 1. Der Nachweis von ATXN1 82Q-GFP durch Fluoreszenzmikroskopie und Waschmittel Fraktionierung. (A) HeLa - Zellen wurden mit ATXN1 82Q-GFP transfiziert und mit DAPI gefärbt. Individuelle und fusionierte Bilder werden angezeigt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. (B) ein Diagramm , das die Waschmittel Fraktionierung von Atxn1-82Q exprimierenden Zellen , wie in Protokoll 2. Molekulargewichtsmarker beschrieben sind , auf der linken Seite von Western - Blot - Bilder von ATXN1-ATXn 82Q angezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
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. (-) Oder PML siRNA (A und C) oder unbehandelten (B) Abbildung 2. Der Abbau Test von ATXN1 82Q-GFP Waschmittel Fraktionierung unter Verwendung von HeLa - Zellen wurden zuvor mit Kontrolle behandelt. Zellen wurden mit ATXN1 82Q-GFP transfiziert und mit CHX in Abwesenheit oder Anwesenheit von MG132 behandelt. Zelllysat Fraktionen durch SDS-PAGE , gefolgt von Western - Blot (A, für NS und SS - Fraktionen) oder Filter Retardation - Assay (B und C, für SR - Fraktion) unter Verwendung von Anti-GFP - Antikörper untersucht wurden. Bitte hier klicken um eine größere Version zu sehen diese Figur.
Abbildung 3. Analyse der NLS-LucDM-GFP - Abbau durch Fluoreszenz microscopy und Western - Blot. (A) transfizierten HeLa - Zellen mit NLS-LucDM-GFP wurden mit DAPI gefärbt. Individuelle und fusionierte Bilder werden angezeigt. Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. Pfeilspitze zeigt eine Zelle mit Kernaggregate. (B und C) HeLa - Zellen wurden mit NLS-LucDM-GFP transfiziert und dem Wildtyp - Luciferase - Fusionsprotein NLS-LucWT-GFP (B), oder transfiziert mit Kontrolle oder PML siRNA, gefolgt von Transfektion mit NLS-LucDM-GFP ( C). Zellen wurden mit CHX und MG132 behandelt, wie angegeben. Ganzzelllysate wurden durch Western-Blot unter Verwendung von anti-GFP-Antikörper untersucht. Das Bild ist aus früheren Veröffentlichung mit Genehmigung 9. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Fluoreszierende Mikrotiterplatten-basierten Assay für NLS-LucDM-GFP Abbau. HeLa - Zellen ausgesät auf Platten mit 96 Vertiefungen wurden mit 0,05 & mgr; g (A) transfiziert oder 0,1 ug (B und C) NLS-LucDM-GFP und mit CHX in die behandelte Anwesenheit oder Abwesenheit von MG132. (A und B) Fluoreszenzintensitäten der Vertiefungen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen (Mittelwerte ± Standardabweichungen, n = 3). Panels auf der linken Seite zeigen die ursprüngliche Fluoreszenzmesswert, während die Platten auf der rechten Seite die Werte zeigen, normiert auf Lesungen zum Zeitpunkt 0 in den jeweiligen Behandlungsgruppen. Der Unterschied zwischen den behandelten Gruppen mit und ohne MG132 wurde durch Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen analysiert. P-Werten zwischen den beiden Behandlungsgruppen sind angegeben. (C) Wells wurden vor oder nach 9 Stunden CHX Behandlung oder nach CHX und MG132 Behandlung, durch Fluoreszenzmikroskop. Um zu zeigen, besser beide Zellen mit hellen aggregierten NLC-LucDM-GFP und solche mit dim diffuses Protein, Gamma-Wert von 1,5 wurde auf alle Bilder angewendet. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Eine reduzierte Abbaurate von NLS-LucDM-GFP in PML - Zellen Knockdown. HeLa - Zellen , die vorher behandelt mit Kontrolle oder PML siRNA wurden in 96 - Well - Platten ausgesät. Der Abbau von NLS-LucDM-GFP wurde wie beschrieben analysiert in 4 (Zwei-Wege - ANOVA, p <0,0001). Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 6. Die Fluoreszenz von ATXN1 82Q-GFP bleibt unverändert über CHX Verfolgungsjagd. HeLa - Zellen mit ATXN1 82Q-GFP transfiziert wurden. 24 Stunden nach der Transfektion Abbau von ATXN1 82Q-GFP wurde analysiert , wie in Abbildung 4 beschrieben. Die Abbildung zeigt die ursprüngliche Fluoreszenzmesswert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Fluoreszierende Mikrotiterplatte basierten Assay für den Abbau von zytoplasmatischen LucDM-GFP. HeLa - Zellen ausgesät auf 96 - Well Platten wurden mit 0,1 ug transfiziert LucDM-GFP behandelt mit CHX in Gegenwart oder Abwesenheit von MG132. (P <0,0001 Zweiweg-ANOVA) Die Ergebnisse wurden wie in Figur 4 beschrieben , analysiert.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1 .: Messeinstellungen auf Fluoreszenz Mikroplatten - Reader.
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Discussion
Mechanismen, die den Abbau fehlgefalteter Proteine sind wesentlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase zellulärer Proteine reguliert, und sie stellen wahrscheinlich wertvolle Arzneimittelziele für neurodegenerative Erkrankungen und anderen eiweiß misfolding Behandlung von Krankheiten. Hier Assays, die den Abbau fehlgefalteter Proteine untersuchen, werden beschrieben, eine pathogene ATXN1 Protein (ATXN1 82Q) und einem Kern lokalisierten Luciferase-Mutante (NLS-LucDM) als Beispiele verwendet.
Um den Abbau ATXN1 82Q, untersuchen , die eine Halbwertszeit über 18 Stunden hat, haben wir ein neues Verfahren durch Zell Fraktionierung mit klassischen CHX 9 kombiniert. Dieses Verfahren ergab eine viel schnellere Abfertigung der misfolded Arten ATXN1 82Q über die Zeit. Darüber hinaus stellt die Einführung von LucDM ein Modell misfolded Substrat allgemeinen Abbaumechanismen falsch gefalteter Proteine zu untersuchen. die Notwendigkeit eines HTS-Systems zur Adresse in Säugerzelle misfolded Proteinabbau zum Detektierens, entwickelten wir einen schnellen Abbau Test für LucDM Fluoreszenz Mikroplatten-Reader verwenden. Das System dient als ein mächtiges Werkzeug für die chemische und genetische Bildschirme.
Die ATXN1 82Q Protein liegt in NS, SS und SR Fraktionen von Zelllysaten. Die SR - Fraktionen werden immer häufiger bei längerer Kultur nach Transfektion, was darauf hindeutet , dass es in einer Form ist , die schwierig revered oder abgebaut zu werden, beispielsweise die Amyloidfibrillen. Erzeugung toxischer misfolded Spezies oder Aggregate, die nicht ohne weiteres abgebaut werden können , können Proteinabbauwege zu blockieren, um die Analyse von endogenen zellulären Maschinerie behindern Steuerung aberrant Proteine 24, 25,26. Zur Vermeidung der Bildung einer großen Menge von SR, beginnen wir CHX chase 4-5 Stunden nach der anfänglichen Transfektion. Wir haben festgestellt, dass dies für die Analyse von zellulären Bedingungen ist kritisch, dass die Verschlechterung der SS Fraktion verzögern. Neben Transfektionszeit, ist es auch wichtig, nicht zu überwhelm Zellen durch auf sehr hohem Niveau ATXN1 82Q Protein exprimieren. Wenn keine oder nur sehr langsame Abbau für alle Fraktionen beobachtet wird, eine geringere Menge an ATXN1 82Q Plasmid sollte für die Transfektion verwendet werden. Idealerweise sollte der Test innerhalb von 12 Stunden abgeschlossen werden, da apoptotische Zellen über diesem Zeitpunkt bemerkt werden. In 2A ist die Menge an SS ATXN1 82 in Kontrollzellen auffallend verschieden von dem in PML siRNA-behandelten Zellen so kurz wie 8 Stunden. Vorsicht ist geboten, wenn eine Differenz in der behandelten Gruppe nur über 12 Stunden beobachtet wird, wie sie durch andere Faktoren verursacht werden, die die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen, anstatt Proteinabbau.
Im Vergleich zu NS ATXN1 82Q, 82Q ATXN1 in der SS - Fraktion wird schnell eliminiert, was darauf hinweist , dass es eine misfolded Spezies darstellt , die leicht durch das Proteasom (2A) abgebaut werden kann. Im Gegensatz dazu bleiben die Ebenen der SR ATXN1 82Q unverändert gegenüber dem gleichen Zeitverlauf (2B), was bestätigt ,dass es ein nicht-abbaubares Arten. Dennoch Analyse der SR - Fraktion sollte Mechanismen zur Analyse von Bedeutung sein , die zytoplasmatischen Aggregate entfernt direkt (zB autophagy) oder die Bildung dieser Aggregate beeinflussen. Bemerkenswerterweise scheint MG132 weniger wirksam zu sein, in ATXN1 82Q Abnahme SS Fraktion verhindern. Dies kann durch die Erhebung in den ROS Ebenen auf Proteasominhibition 27, verursacht werden , die die Aggregation von ATXN1 82Q fördern könnte.
Ein großer Vorteil von LucDM-GFP-Assay ist, dass es an HTS-Analyse angepasst werden kann Fluoreszenz-Plattenleser. Wir haben versucht, zunächst ein HTS-System für ATXN1 82Q zu entwickeln. Da jedoch nur ein kleiner Bruchteil der Gesamt ATXN1 82Q Protein im Laufe der Zeit abgebaut wird, bleibt die Fluoreszenz von Zellen , die GFP-exprimierenden ATXN1 82Q weitgehend unverändert über den Verlauf CHX chase (Abbildung 6). Andere misfolded Proteine mit insgesamt lange Halbwertszeit hätte ähnliche Probleme mit Echtzeit-fluorzier Test. Im Gegensatz dazu ist eine deutliche Abnahme der Gesamt NLS-lucDM-GFP - Proteins beobachtet (3 und 4). Dieses Merkmal, zusammen mit seiner kurzen Halbwertszeit (2-3 Stunden), ermöglicht dieses Modell Chaperonsubstrat leicht durch Fluoreszenzspektroskopie nachgewiesen werden. In früheren Studien, GFPU-, GFP - Protein zu einem konstruktiven Abbausignal (CL-1) fusioniert, als Reporter für die Funktionalität des Ubiquitin-Proteasom - System 28,29 wurde in großem Umfang eingesetzt. Es ist auch ein bekannter Surrogat misfolded Protein in Zell- und Tiermodellen 30. Im Vergleich zu GFPU-, ein Vorteil der Abbau Test hier beschrieben ist, dass misfolded Luciferase ist ein umfangreich verwendete Modell Chaperonsubstrat. Durch die Luciferase - Aktivität untersucht, kann man beurteilen , leicht die nativen, denaturiert und wieder gefaltet Konformationen von Luciferase in vitro und in vivo. Somit dient unser System als äußerst nützliche Plattform Proteinbindung und Falten-Assays zu verbinden mitzelluläre Abbausystem das gleiche Substrat 9 verwendet.
Durch Echtzeit-Fluoreszenzmessung die folgenden Werte erhalten werden können: Ausgangsfluoreszenzintensität, stabil verbleibenden Fluoreszenzintensität und Proteinhalbwertszeit. Diese Werte werden jeweils korreliert mit der Menge des Gesamtproteins vor chase, Menge an Proteinen resistent gegen Abbau, und die Rate des Proteinumsatzes. Daher ist es möglich, Echtzeit-Fluoreszenz-Assay zu verwenden, um eine umfassende Analyse der Niveaus und Dynamiken unterschiedlicher misfolded Proteinarten zu machen. Gelegentlich wird eine relativ große Variation der Ausgangsfluoreszenz unter den Wiederholungen beobachtet (beispielsweise Figur 5, linkes Feld). Dies ist wahrscheinlich durch die Variabilität in dem Aussähen der Zellen oder Transfektion verursacht werden. Trotz des Unterschieds in der Ausgangsfluoreszenzintensität fällt das Signal aller Replikate auf einem sehr ähnlichen Rate. Die Normalisierung der Signale from jeweils Zeitpunkte der Intensität zum Zeitpunkt 0 die Well-to-gut Variation reduzieren und spiegelt genau die Abbauraten (4A, 4B und 5, links gegen rechts Panels).
Neben der Kernform, analysierten wir auch zytoplasmatische LucDM-GFP. Zytoplasmatischen LucDM-GFP hat ein ähnliches Abbaumuster mit Ausnahme höherer Prozentsatz der restlichen Fluoreszenz wurde beobachtet , wenn das gleiche experimentelle Verfahren angewandt wurde wie in Protokoll 4 (Figur 7) beschrieben wurde . Der Abbau vollständig MG132 gehemmt werden konnte, was auf dieser Assay verwendet werden können zytoplasmatische Protein Qualitätskontrolle durch den proteasomalen Abbau zu überwachen. Für künftige Studien, wäre es interessant, ob LucDM-GFP erkunden anderen zellulären Kompartimenten, beispielsweise Mitochondrien oder das endoplasmatische Retikulum angewendet werden, wenn auf bestimmte Zellkompartiment Lokalisierungssignale fusioniert.
Wie in dem Protokoll für die fluoreszenzbasierten Assays festgestellt, ist es entscheidend, low-fluoreszierendes Medium zu verwenden fluoreszierenden Hintergrund zu reduzieren und Mastermix von DNA und Transfektionsreagenz verwenden well-to-well-Transfektion Variation zu reduzieren. Die Verstärkungsregelung kann auf einigen Fluoreszenzplattenleser eingestellt werden. Es ist wichtig , die Verstärkung auf manuelle statt optimiert und verwenden den gleichen Wert während des gesamten Tests (Tabelle 1) einzustellen. Der Wert der Verstärkung kann das Lesen aus dem zellulären GFP Fluoreszenz so lange zu maximieren eingestellt werden, wie das Lesen nicht über der Nachweisgrenze geht.
In der jetzigen Phase, setzen wir nach wie vor auf der Transfektion LucDM auszudrücken. Zur Variation verringern und den Assay für HTS vereinfachen, ein zukünftiges Ziel ist es, eine stabile Zelllinie mit induzierbarer Expression von LucDM herzustellen. als Mikrotiterplatte und Kulturmedium jedoch sowohl die Hintergrundfluoreszenz, ist es entscheidend, GFP-Signal signifikant höher als der Hintergrund haben. UNFORdie stabilen Linien, die wir vor kurzem alle haben eine geringe Expression von LucDM etabliert Glücklicher. So verbessern die Entwicklung einer stabilen Linie mit höheren Proteinexpression deutlich das Screening Effizienz.
Die Abbau Assays hier beschrieben sind, können auch auf andere misfolded Proteine angewendet werden. Aufgrund der dynamischen Funktion fehlgefalteter Proteine, müssen diese Tests mit anderen Analyse gekoppelt werden, um die in-Tiefe Mechanismen der Proteinqualitätskontrollen aufzudecken. Diese Analysen umfassen die Steady - State - Niveaus von Aggregaten zu messen und ihre Partitionen in verschiedenen Zellfraktionen (Abbildung 1) und Analyse von Proteinen Faltung oder Aggregation gereinigte rekombinante Proteine verwendet wird . Diese Tests helfen bei der Proteinabbau oder Aggregation direkte oder indirekte Auswirkungen von Drogen-oder Genexpression zu unterscheiden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
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