Abstract
Tilføre materialer overflade med celle-klæbende egenskaber er en fælles strategi i biomateriale forskning og tissue engineering. Dette er især interessant for allerede godkendte polymerer, der har en lang tids anvendelse i medicin, fordi disse materialer er godt karakteriserede og juridiske spørgsmål i forbindelse med indførelsen af nyligt syntetiserede polymerer kan undgås. Polytetrafluorethylen (PTFE) er en af de hyppigst anvendte materialer til fremstilling af vaskulære transplantater, men polymeren mangler celle adhæsionsfremmende funktioner. Endothelialisering, dvs er fuldstændig dækning af transplantaterne indre overflade med et konfluent lag af endotelceller betragtes nøgle til optimal ydeevne, især ved at reducere thrombogenicitet af den kunstige interface.
Denne undersøgelse undersøger væksten af endotelceller på peptid-modificeret PTFE og sammenligner disse resultater til sådanne opnået på umodificeret substrat. Kobling med denendotelcelle klæbemiddel peptid Arg-Glu-Asp-Val (REDV) udføres via aktivering af fluorin polymer ved anvendelse af reagenset natrium naphthalenide, efterfulgt af efterfølgende konjugationsprocedurer trin. Celledyrkning opnås ved anvendelse af humant navleveneendotelceller (HUVEC'er) og fremragende cellulær vækst på peptid-immobiliserede materiale demonstreres over en periode på to uger.
Introduction
Forskellige polymerer, der anvendes i medicin, der er godkendt i nogen tid ikke udvise forøget biokompatibilitet, dvs. manglende celle-klæbeevne, induktion af fibrotisk indkapsling og thrombogenicitet, for at nævne nogle få. Interaktioner mellem biomaterialet og det biologiske system hovedsagelig finder sted på overfladen af implantatet. Som følge heraf har forskning fokuseret på overfladen modifikation med henblik på at skabe passende egenskaber for en ønsket anvendelse mens hovedparten materialets egenskaber upåvirket. Polytetrafluorethylen (PTFE) som en fysiologisk inert polymer bruges i mange medicinske områder såsom brok kirurgisk maske 1, medicinske porte 2 og, vigtigst af alt, vaskulære transplantater 3.
Især i blod kontaktes situationer hydrofobe natur PTFE forårsager uspecifik adsorption af plasma komponenter, og som en konsekvens blodpladeadhæsion, hvilket ofte resulterer i thrombotic begivenheder og okklusion af implantatet 4. Endvidere PTFE, ligesom de fleste polymerer, understøtter ikke cellulær adhæsion og dækning, som ville være et ønskeligt træk at inducere dannelsen af et gavnligt lag af endotelceller (ECS) på den indre (luminale) overflade af vaskulært transplantat 5. Der forventes en biomimetisk endotel at opfylde mange af de funktioner i sin naturlige tilsvarende, navnlig dets antitrombogene egenskaber 6. En generel biomimetiske modifikation strategi er baseret på begrebet udelukkende tilføre materialet med celle-klæbeevne mens materialerne masseegenskaber upåvirket. Desuden kan blodpladeadhæsion reduceres ved at inkorporere anti-klæbemiddel (anti-fouling) attributter 7. Forskellige peptider - hovedsagelig afledt af proteiner af den ekstracellulære matrix - er blevet beskrevet som stærkt forbedre celle-adhæsion ved binding til cellulære receptorer, der tilhører klassen af integriner 8. Den værest kendte eksempel i denne henseende er peptidet Arg-Gly-Asp (RGD), der interagerer med de fleste celletyper. Andre aminosyresekvenser genkendes af integriner udelukkende udtrykt på specifikke celler. For eksempel er Arg-Glu-Asp-Val (REDV) og Tyr-lle-Gly-Ser-Arg (YIGSR) vist sig at binde til EC'er på en specifik måde 9. Kovalent immobilisering af sådanne peptider er blevet udført på en overflod af principielt ikke-klæbende materialer, herunder metaller og polymerer 10,11.
Porøst PTFE, mere præcist ekspanderet PTFE (ePTFE) - sammen med polyethylenterephthalat (PET) - er det vigtigste materiale til fremstilling af vaskulære transplantater 12. Etablerede fysiske teknikker til passende behandlinger, såsom plasma modifikation 13 eller ved fotokemiske metoder 14, vanskeliggøres af, at porøse og / eller rørformede strukturer ikke umiddelbart kan behandles inde i porerne eller lumen henholdsvis. våd kemipå PTFE er en vanskelig opgave på grund af den meget inerte natur af fluorin polymer, der modstår mest kemiske angreb 15.
I denne artikel beskriver vi en forholdsvis facile fremgangsmåde til en covalent modifikation strategi. Tilpasset fra en procedure til at gøre PTFE limes, blev funktionelle grupper oprettet på materialer overflade, der tjener som forankringspunkter for yderligere konjugering af biologisk aktive molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af natrium Naphthalenide Aktivering Solution og Surface Aktivering
Bemærk: Udfør reaktioner i et godt ventileret stinkskab. Følg generelle regler for håndtering af meget brandfarlige opløsningsmidler og ætsende metaller som metallisk natrium. Naphthalen har en meget ubehagelig lugt (mothball), selv i meget små mængder! Hvis ikke andet er angivet Reaktionerne udføres ved stuetemperatur. Natriumazid er meget giftig! THF (99,9%, se liste over materialer) blev opbevaret over ca. 20% (efter volumen) molekylsigte. Destillere THF med en mærkbar vandindhold over natrium. Dannelsen af natrium naphthalenide opstår ikke, hvis spormængder af vand er til stede.
- Til en opløsning af 1,4 g (10,9 mmol) naphthalen i 20 ml tetrahydrofuran (THF, tørret over 3 Å molekylsigte), tilsættes 0,25 g (10,9 mmol) natriummetal i et skruelåg 100 ml glasflaske forsynet med en PTFE- overtrukket magnetomrører.
Bemærk: Dissolution kan være langt større ved at skære natrium i små stykker og beskedne opvarmning (35-40 ° C). Den endelige opløsning har en mørk, svagt grønlig farve og kan opbevares under strengt tørre forhold. - Punch out PTFE diske på 12 mm i diameter fra 0,5 mm tyk folie materiale. Mark ene side (fx ved hjælp af et brev stempel slag) og rene med iso-propanol.
- Inkuber PTFE-prøver individuelt i den aktiverende opløsning (trin 1.1) til 1 - 2 min ved anvendelse af pincetter. Bemærk: farveændring fra hvid til mørkebrun indikerer vellykket behandling.
- Efterfølgende skylles to gange med THF og derefter med iso-propanol.
Bemærk: Den naphthalenide løsning er opbrugt, når farven ændres til en vandig lysebrun. Ubrugt naphthalenide opløsning (eventuelt indeholdende metallisk natrium) skal sønderdeles ved langsomt at tilsætte isopropanol inden bortskaffelse. - Oxidere behandlede prøver i hydrogenperoxid (30%) indeholdende 20% (vægt / volumen) trichloreddikesyre i 3 timer. Vaskmed vand og tør. Overfladen har nu en svag brunlig udseende. Bemærk: Aktivering og oxidation resulterer i en drastisk stigning befugtelighed af overfladen. Dette fund blev undersøgt i detaljer tidligere 14.
- Behandle oxiderede diske med 50% (v / v) hexamethylendiisocyanat (HMDI) i tør THF i 2 timer, skylles med THF og lad det tørre.
- Hydrolysere isocyanat bærende prøver i vand til 2 - 3 timer og tør. Bemærk: Det endelige aminofunktionaliserede PTFE overflade er langt mere stabil end de isocyanat-bærende prøver og er kompatibel med mange standard tværbindere til yderligere kobling.
2. Peptid Immobilisering
- Der fremstilles en opløsning af 20% (v / v) diethylenglycol-diglycidylether (diepoxid) i 50 mM carbonatbuffer, pH 9.
- Placer aminerede diske med den markerede side op individuelt i en plade med 24, og der tilsættes 1,5 ml af epoxidet opløsning. Sikre fuld dækning af prøverne. Der inkuberes i 2 timer og vask togange med vand og en gang med carbonatbuffer.
- Tilsæt 50 gl af en 0,5 mg / ml peptid (f.eks REDV) i 50 mM carbonatbuffer, pH 9 indeholdende 0,01% NaN3, til bunden af individuelle brønde i en frisk plade med 24 brønde og anbring forsigtigt epoxy-funktionaliserede diske upside -down (dvs. markerede side nedad) på dråbe af peptidopløsning. Kontroller at mellemrummet mellem bunden af brønden og PTFE skiven befugtes fuldstændigt på grund af kapillarvirkning.
- Inkuber i en våd kammer (f.eks enhver forseglelig plastkasse med en tætlukkende låg) med fugtig atmosfære (ved at placere vådt silkepapir på bunden) i mindst 3 timer eller natten over.
Bemærk: Omend REDV motivet kan betragtes som velkarakteriseret, en kodet eller omvendt aminosyresekvens kan være indbefattet som en yderligere negativ kontrol. - Der vaskes tre gange med vand, og der steriliseres i 50% isopropanol / vand i mindst 30 min. Før celle såning, Rinse prøverne i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS).
3. Cell Seedning
- Grow HUVEC'er hjælp standard celle kultur procedurer 17,18.
- Placer peptid-konjugeret prøver med den modificerede side op i en brønd plader 24. Brug ubehandlet PTFE diske som kontrol.
- Seed 5 x 10 4 HUVEC'er i 2 ml medium per brønd og inkuberes i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator.
- Fjern diske, skylles forsigtigt at fjerne ubundne celler og overføre til en frisk plade med 24 brønde. Tilsæt 2 ml frisk medium og inkuberes i den ønskede periode (f.eks 24 timer, 1 w, etc.). Skift medium hver anden dag.
- Der fremstilles en stamopløsning af 1 mg / ml Calcein-AM i dimethylsulfoxid (DMSO).
- Efter dyrkning af cellerne fjerne mediet, vask med PBS, og der tilsættes PBS indeholdende 1 pl / ml Calcein-AM farvning (f.eks, 1 pi af en stamopløsning pr ml PBS). agitere og incubat forsigtigte ved 37 ° C i 45 minutter i mørke.
- Vask med PBS og straks mikrografier på et fluorescensmikroskop udstyret med standard FITC filtre (Ex 488 nm, Em 515 nm). Brug 100 ganges forstørrelse. Udfør triplikater fra umodificeret såvel som behandlede prøver.
- Hjælp ImageJ software bestemme området koloniseret af cellerne. Alternativt tælle cellerne manuelt eller bruge ImageJ. Begge metoder vil give lignende oplysninger om fastgørelse og vækst af celler på de respektive overflader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne af de afgørende kemiske reaktionstrin blev overvåget ved IR-spektroskopi (figur 1). Den indledende aktivering med natrium naphthalenide genererer dobbeltbindinger - og i mindre grad - OH-funktionaliteter. Signalet indikerer C = C bindinger forsvinder ved oxidation, hvilket giver en overflade, der bærer næsten udelukkende hydroxylgrupper. Analyse af yderligere standard konjugering trin er ikke vist her. Farven ændringer som følge af aktivering og oxidation er i overensstemmelse med det forventede kemi, der bruges: konjugerede dobbelt limning systemer forventes at være brunlig og dets tab resultater i lysere (figur 2). Desuden blev det mulige resultat af aktivering og oxidation på overfladen morfologi undersøgt ved hjælp af scanning elektronmikroskopi. Stort set ingen skadelig virkning af behandlingen blev observeret (figur 2).
Figur 3 og 4 viser resultatet af REDV-immobilisering på endotelcellevækst. Ud fra følgende betragtninger næsten ingen celleadhæsion og spredning sker på ubehandlet materiale ændringen støtter kraftigt kolonisering over en periode på to uger. Eksemplificeret for en klinisk anvendelse (dvs., vaskulære transplantater) blev ændringen identisk udført på originale materiale fra et kommercielt tilgængeligt graft fremstillet af ekspanderet PTFE med en lignende resultater over en periode på en uge (figur 5).
Figur 1. IR-spektroskopi af PTFE. Behandling af uberørt PTFE (A) resulterer i dannelsen af dobbeltbindinger og i et vist omfang af hydroxyfunktioner (B). Efterfølgende C = C bindinger er reduceret på grund af oxidation (C Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Optisk udseende nøgne og overflade aktiveret PTFE. (A) Ubehandlet PTFE (venstre) ser hvidt ud, aktivering ved hjælp natrium naphthalenide giver en mørk brunlig farve (midten) som er lidt lysere ved oxidation (højre). Ubehandlede (B) og oxideret PTFE (C) prøver blev yderligere undersøgt ved anvendelse af scanningselektronmikroskopi (forstørrelse: 2,000X). Diske er 12 mm i diameter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. endotelcelle kultur på uberørt og peptid-modificeret PTFE. Ubehandlede prøver ikke koloniseret af EC'er (A, C, E efter 24 timer, 1 w og 2 w henholdsvis) henviser adhæsion og vækst på peptid-modificeret materiale er stærkt forbedret (B, D og F efter 24 timer, 1 w og 2 w henholdsvis). Målestok:. 100 um, forstørrelse 100X Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kvantificering af celle dækning af ImageJ analyse. Cellular vækst på bar PTFE (A, C,E) og på REDV-konjugeret polymeroverflader (B, D, F) udtrykt som procentvise dækning af det samlede areal. Immobiliseret peptid giver helt klart indledende adhæsion (B) og støtter kolonisering over en 2 ugers periode (D, F). Tredobbelte bestemmelser, gennemsnit ± standardafvigelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Endotelceller dyrkes i 1 uge på ekspanderet PTFE. Strukturen af ePTFE er vist ved hjælp af scanningselektronmikroskopi (A). De opnåede på porøst materiale resultater er i overensstemmelse med dem, der opnås til flade PTFE eksemplar. I modsætning til de få celler fundetpå bar materiale (B) den modificerede overflade (C) giver en fremragende substrat for cellevækst. Scale barer er 100 um for A, B og C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Skematisk repræsentation af den kemiske modifikation af PTFE benytte wet-kemi. Dobbeltbindinger genereret af Na-naphthalenide behandling oxideres resulterer i OH-funktionaliteter. En hydroxyl-reaktiv diisocyanat derefter immobiliseret, og hydrolyseres til en amin. Endelig bifunktionelle diepoxid påføres konjugere REDV peptid ved hjælp af N-terminale aminogruppe. Klik her for at view en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den detaljerede beskrivelse af overflademodifikation protokol af PTFE består af successive trin starter med fjernelse af fluor fra polymerrygraden som afbildet i figur 6. Som et resultat heraf dannes et lag, der indeholder en rigelig mængde af konjugeret carbon-carbon-dobbeltbindinger i overensstemmelse med den mørke brunlige farve, der udvikles ved naphthalenide behandling. Standard oxidation med sur hydrogenperoxid giver en hydroxyleret overflade ledsaget af lysere til en lysebrun, afspejler tabet af dobbeltbindinger. Denne proces er klart fremgår af IR-spektroskopi.
For at opnå en mere generelt anvendelig funktionalitet blev vedhængende OH-grupper omdannes til amino-funktioner ved simpel behandling med et diisocyanat og efterfølgende hydrolyse af NCO-grupper til primære aminer. Dette er gunstigt, fordi amin-holdigt materiale kan opbevares i længere perioder hvorimod HIGHly reaktive isocyanat er modtagelige for selve tilstedeværelsen af luftfugtighed.
Der skal udvises omhu i at undgå selv spormængder af vand i den indledende aktivering skridt og HMDI behandling, fordi både natrium naphthalenide og isocyanat er meget modtagelige for hydrolyse. I modsætning til standardprocedurer, hvor prøven er helt nedsænket i opløsningen, den foreliggende protokol kræver kun små mængder af reagenset. Derfor er denne metode sparer en masse af de kostbare peptid.
Amine-bærende overflader er ideelle udgangspunkter for koblingen af mange biomolekyler. Diepoxidet anvendt i dette arbejde er interessant i flere henseender: det er forholdsvis billigt, hydrofil, stærkt reaktiv over aminer og ikke-reagerede epoxider hydrolyseres i et vandigt miljø til "fysiologisk inerte" dioler. Homobifunktionelle tværbindere er egnede reagenser, hvor kun en reaktiv gruppe til stede on peptidet, der skal immobiliseres. Dette gælder REDV der kun indeholder en enkelt primær aminogruppe på N-terminalen (dette er den samme for de ofte anvendte sekvens RGDS). For peptider indeholdende lysinrester (med sidekæde aminer) resultatet af konjugationen er tvetydig, hvilket betyder, at korrekt kobling ikke forekommer i en defineret måde. I dette tilfælde, en strategi, der anvender heterobifunktionelle tværbindere (fx amin- og thiol-reaktive) og cystein (N- eller C-terminale) holdige peptider er nyttige 18.
Resultaterne af peptidet immobilisering i form af celleadhæsion er entydige (figur 3 og 4). Ud fra følgende betragtninger næsten ingen celler klæbe på bar PTFE, REDV-modifikation gør materialet en fremragende celle-klæbende underlag. Komplementær til den ovennævnte protokol forarbejde viser, at denne teknik også kan anvendes på porøse (ekspanderet) PTFE med lignende resultater (figur 5 13, plasma polymerisation 19), denne protokol giver en rettesnor for den kovalente modifikation af PTFE ved at ansætte let tilgængelige kemikalier og lab procedurer og ved at undgå meget avanceret udstyr. Plasma metoder såsom reaktiv plasma (O 2, NH3, etc.) og plasma polymerisation ikke finder anvendelse i porøse konstruktioner eller slanger, fordi reaktive arter (f.eks radikaler) er ikke i stand til at trænge disse strukturer på grund af inaktivering ved kontakt med materialerne overflade. For eksempel lille kaliber vaskulære transplantater (diameter <5 mm) kan ikke behandles på denne måde. I modsætning hertil, ved hjælp af våd kemi, er der ingen begrænsning med hensyn til formen af indretningen. På denne måde ved at muliggøre dannelsen af en endothelial lag på den luminale side af en ePTFE vaskulært transplantat, thrombogenicitet og langvarig åbenhed kan forbedres. Desuden er en celle klæbende overflade til kirurgiske brok masker formodes at resultere i en bedre væv integration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S.
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S.
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
