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Bioengineering

향상된 세포 접착 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 젖은 화학 및 펩티드 고정화

Published: August 15, 2016 doi: 10.3791/54272

Abstract

물질이 세포 접착 특성과 표면 부여하는 것은 생체 재료 연구와 조직 공학의 일반적인 전략이다. 이는이 물질이 잘 피할 수 새롭게 합성 된 고분자의 도입과 관련된 특성화 및 법적 문제 때문에 의학의 오랜 사용이 이미 승인 폴리머에 특히 흥미 롭다. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)은 혈관 이식편의 제조에 가장 자주 사용되는 물질 중 하나이지만, 중합체의 기능을 촉진하는 세포 접착 성이 부족하다. 에 내피 세포, 즉, 내피 세포의 융합 층과의 접목 내면 전체에 따르면 주로 인공 인터페이스 혈전을 감소시켜 최적의 성능 키를 간주한다.

본 연구는 펩티드 변성 PTFE에 내피 세포의 성장을 조사하고 변경되지 않은 기판 상에 얻은 결과를 비교한다. 와 커플 링내피 세포 접착 펩타이드의 Arg-Glu가-: ASP 발 (REDV)는 이후 접합 공정 다음에, 시약 나트륨 나프탈렌 나이드를 사용 fluorin 함유 중합체의 활성화를 통해 수행된다. 세포 배양액은 2 주 기간에 걸쳐 증명되는 펩티드를 고정화 재료에 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를) 우수한 세포 성장을 이용하여 달성된다.

Introduction

즉, 향상된 생체 적합성, 세포 접착 부족, 섬유 성 캡슐화 및 혈전 형성의 유도를 전시하지 않는 몇 시간 동안 승인 된 의학에서 사용되는 다양한 폴리머는 몇 가지를 언급합니다. 바이오 물질 및 생물학적 시스템 사이의 상호 작용은 주로 임플란트의 표면에서 발생한다. 결과적으로, 많은 연구가 영향을받지 않는 재료의 벌크 특성을 남기면서, 원하는 응용에 적합한 특성을 생성하기 위해 표면 개질에 집중하고있다. 생리 학적으로 불활성 중합체 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)의 탈장 등 외과 메쉬 가장 중요한 의학적 포트 (2), 혈관 이식편 3으로 많은 의료 분야에서 사용된다.

특히 피 접촉 상황에서 PTFE의 소수성은 종종 thromboti 결과 결과 혈소판 혈장 접착 성분 등의 비특이적 흡착을 야기C 이벤트 및 이식 4의 폐쇄. 또한, PTFE는 대부분의 중합체와 같은 바람직한 특징은 혈관 그래프트 (5)의 내면 (내강) 표면에서 혈관 내피 세포 (EC에)의 유용 층의 형성을 유도하는 것 세포 부착 및 커버리지를 지원하지 않는다. 생체 모방 내피는 특히 그 antithrombogenic 특성 6 자연 등가의 많은 기능을 수행 할 것으로 예상된다. 일반적인 생체 모방 변형 전략은 영향을받지 않는 물질 벌크 특성을 남기고 전적으로 세포 접착 성 재료를 부여하는 개념에 기초한다. 또한, 혈소판의 부착을 방지 접착제 (방오) (7) 특성을 도입함으로써 감소 될 수있다. 각종 펩티드 - 대부분의 세포 외 기질 단백질로부터 유래는 - 강하게 인테그린 (8)의 클래스에 속하는 세포 수용체에 결합하여 세포 부착을 향상시키는 것이 기재되어있다. 수이와 관련하여, 예를 세인트 알려진 대부분의 세포 유형과 상호 작용하는 펩타이드의 Arg-의 Gly-의 Asp (RGD)이다. 다른 아미노산 서열이 전적으로 특정 세포에 발현 인테그린에 의해 인식된다. 예를 들어,의 Arg-의 Glu-ASP를-발 (REDV)와 티르 - 일드-의 Gly-빼앗아, 인수 (YIGSR)는 특정 방식으로 9되는 EC에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 펩티드의 공유 고정화 금속 및 폴리머 10, 11를 포함한 본질적으로 비 - 접착 성 물질의 과다에 대해 수행되었다.

다공성 PTFE,보다 정확하게 PTFE (의 ePTFE) 확장 - 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET)와 함께 - 혈관의 제조를위한 가장 중요한 물질 12 접목이다. 플라즈마 개질 (13) 또는 광 화학적 방법 (14)에 의해 적절한 치료를위한 확립 된 물리적 기술은, 다공성 및 / 또는 튜브형 구조는 각각 구멍 또는 내강 안에 용이하게 치료할 수없는 사실에 의해 방해된다. 습식 화학PTFE에 있기 때문에 대부분의 화학 공격 15 견디는 fluorin 함유 중합체의 높은 불활성 자연의 어려운 작업입니다.

본 논문에서는 공유 수정 전략 비교적 손쉬운 방법을 설명합니다. PTFE의 본딩을 렌더링하는 과정에서 적응, 작용기는 생물학적 활성 분자의 추가 활용을위한 기준점 역할을 재료 표면에 만들어졌습니다.

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Protocol

나트륨 나프탈렌 나이드 활성화 솔루션 및 표면 활성화 1. 준비

참고 : 통풍이 잘되는 흄 후드에서 반응을 수행하십시오. 가연성 용제 및 금속 나트륨과 같은 부식성 금속을 처리하는 일반적인 규칙을 따르십시오. 나프탈​​렌은 매우 적은 양이라도 매우 불쾌한 냄새 (좀약)를 가지고! 달리 명시하지 않으면 반응은 실온에서 수행된다. 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이다! THF 분 자체 (부피)를 통해 약 20 %를 저장했다 (99.9 %은, 재료의 목록 참조). 나트륨에 비해 눈에 띄는 수분 함량과 THF를 증류. 물에 미량 존재하는 경우 나트륨 나프탈렌 나이드의 형성이 발생하지 않는다.

  1. (3 Å 분 자체상에서 건조 THF) 20 ㎖, 테트라 히드로 푸란, 나프탈렌 1.4 g (10.9 mmol)의 용액을 위해, PTFE- 구비 한 스크류 캡 100 ㎖ 유리 병에 0.25 g (10.9 mmol)의 나트륨 금속을 추가 코팅 된 자기 교반 막대.
    참고 : Dissolu을(- 40 ° C에서 35) 기 크게 작은 조각 적당한 가열로 나트륨을 절단함으로써 향상 될 수있다. 최종 용액을 어두운 약간 녹색 컬러를 가지며 엄격 건조 조건하에 저장 될 수있다.
  2. 0.5 mm 두께의 박막 재료 12mm 직경의 PTFE 디스크를 펀칭. 마크 한면 (예를 들어, 편지 우표 펀치 사용) 이소프로판올와 청소를.
  3. 2 분 사용 집게 - 1의 활성화 용액 (1.1 단계)에서 개별적으로 PTFE-샘플을 품어. 참고 : 어두운 갈색 흰색에서 색상 변화가 성공적인 치료를 나타냅니다.
  4. 그 후 이소프로판올로 두 번 THF와 다음 씻어.
    참고 : 나프탈렌 나이드 용액이 소진 될 때 물 밝은 갈색으로 색상이 변경됩니다. (아마도 금속 나트륨을 포함하는) 미사용 나프탈렌 나이드 용액을 천천히 폐기 전에 이소프로판올을 첨가하여 분해한다.
  5. 과산화수소 (30 %) 3 시간 동안 트리클로로 아세트산 (/ V W)의 20 %를 함유하는 샘플을 산화 처리. 빨래물과 건조와. 표면은 지금 약간의 갈색 외관을 가지고있다. 주 : 활성화 및 산화 결과를 표면의 대폭 증가 습윤성. 이 연구 결과는 이전에 14 자세히 조사 하였다.
  6. 2 시간 동안 건조 THF 50 % (v / v)의 헥사 메틸렌 디 이소시아네이트 (HMDI)와 산화 디스크를 치료 THF로 씻어 건조 둡니다.
  7. 3 시간 건조 - 2 물에 이소시아네이트 베어링 샘플을 가수 분해. 주 : 최종 아미노 - 작용 PTFE 표면 훨씬 안정 이소시아네이트 - 함유 샘플보다 더욱 많은 결합 가교제 표준과 호환된다.

2. 펩타이드 고정화

  1. 탄산 완충액, pH가 9에서 50 mM의 20 % (v / v)의 디 에틸렌 글리콜 디 글리시 딜 에테르 (디 에폭시)의 용액을 준비한다.
  2. 개별적으로 24 웰 플레이트에 표시된면이 위로와 민화 디스크를 놓고 에폭시 용액 1.5 ml를 추가합니다. 샘플의 전체 범위를 확인합니다. 2 시간 동안 품어 두 씻어시간 물에 한 번 탄산 버퍼.
  3. 신선한 24 웰 플레이트의 각 우물의 바닥에, NaN가 3 0.01 %를 포함하는 50 밀리미터에서 0.5 ㎎ / ㎖ 펩타이드 (예를 들어, REDV) 탄산 완충액, pH가 9의 50 μl를 추가 조심스럽게 에폭시 작용 디스크의 상승 여력이 배치 -down 펩타이드 솔루션의 드롭에 (즉, 아래 좌우로 표시). 우물의 바닥과 PTFE 디스크 사이의 공간이 완전히 모세관 현상으로 침수되어 있는지 확인합니다.
  4. 습식 챔버에 품어 (예를 들어, 꽉 닫는 뚜껑있는 밀폐 플라스틱 상자) 가습 분위기 하룻밤 적어도 3 시간 또는 위해 (바닥에 젖은 티슈 페이퍼를 배치하여).
    주 : REDV 모티프뿐만 특성화 간주 될 수이기는하지만 스크램블링 또는 역방향 아미노산 서열은 부가적인 대조군으로서 포함 할 수있다.
  5. 물로 3 회 세척하고 적어도 30 분 동안 50 % 이소프로판올 / 물에 소독. 시드, RINS 셀에 앞서멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에서 샘플을 전자.

3. 셀 시드

  1. 표준 세포 배양 절차 (17, 18)를 사용하여 HUVECs를 성장.
  2. 24 웰 플레이트에서 수정 된면이 위로와 펩티드 결합 된 샘플을 놓습니다. 대조군으로 치료 PTFE 디스크를 사용합니다.
  3. 종자 5 × 10 4 웰 당 2 ml의 배지에서 HUVECs를하고 인큐베이터에서 37 ° C에서 4 시간 5 % CO 2 품어.
  4. 디스크를 제거하고 부착되지 않은 세포를 제거하고 신선한 24 웰 플레이트로 전송 조심스럽게 씻어냅니다. 원하는 기간 동안 새로운 배지 2 ㎖를 추가하고 배양 (예를 들어, 24 시간, w 1 등). 이틀 매체 변경합니다.
  5. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 1 ㎎ / ㎖ 칼 세인 AM의 스톡 용액을 제조 하였다.
  6. 성장 후, 세포 배지를 제거하고 PBS로 세척 한 PBS 함유 μL / mL의 칼 세인 AM 얼룩을 추가 (예컨대, PBS 용액 당 원액 1 μL). 부드럽게 교반과 incubat어둠 속에서 45 분 동안 37 ° C에서 전자.
  7. 표준 FITC 필터가 장착 된 형광 현미경에 현미경을 (예 488 nm의, 엠 515 ㎚) 즉시 PBS로 세척합니다. 100 배의 배율을 사용합니다. 수정되지 않은에서 삼중뿐만 아니라 처리 된 샘플을 수행합니다.
  8. ImageJ에 소프트웨어를 사용하면 세포에 의해 식민지 영역을 결정합니다. 또는 수동으로 세포를 계산 또는 ImageJ에 사용합니다. 두 방법 모두 각각의 표면에 부착 및 세포의 성장에 대한 유사한 정보를 제공합니다.

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Representative Results

중요한 화학 반응 공정의 결과는 IR 스펙트럼 (도 1)에 의해 모니터링 하였다. 나트륨 나프탈렌 나이드와 초기 활성화는 이중 결합을 생성 - 그리고 작은 범위 - OH-기능. 신호를 나타내는 C = C 결합은 거의 독점적으로 수산기 그룹 베어링 표면을 산출 산화에 사라집니다. 또한 표준 접합 단계의 분석은 여기에 표시되지 않습니다. 활성화 및 산화에 의한 색상 변화가 사용되는 것으로 화학와 일치한다 : 공액 이중 결합 시스템은 (그림 2)을 밝게에서 그 손실의 결과 갈색이 될 것으로 예상된다. 또한, 표면 형태의 활성 산화의 가능한 결과는 주사 전자 현미경에 의해 조사 하였다. 실제로 치료의 불리한 효과는 (도 2)이 관찰되지 않았다.

3 및도 4는 혈관 내피 세포 성장에 REDV 고정화의 결과를 나타낸다. 사실상 세포 부착 및 증식 치료 재료에 발생하는 반면 수정 강력 2 주 동안 식민지를 지원합니다. 임상 응용 (즉, 혈관 이식)을위한 예시의 변형 예와 동일 일주 (도 5)에 걸쳐 유사한 결과 발포 PTFE로 이루어지는 시판에서 이식 원 소재에 대해 수행 하였다.

그림 1
원시 PTFE (A)의 이중 결합의 형성 및 히드 록시 함수 (B)의 어느 정도의 결과 PTFE. 치료도 1 IR 스펙트럼. 그 후 C는 (C 결합이 산화로 인해 감소 C를 = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
맨 손으로 표면 활성화 PTFE 그림 2. 광학 모습. (A) 치료 PTFE 반면이 (왼쪽) 흰색 나타납니다, 나트륨 나프탈렌 나이드를 사용하여 활성화는 약간 산화 (오른쪽)에 밝게 어두운 갈색 색상 (가운데)를 산출한다. 미처리 (B) 및 산화 PTFE (C)의 샘플은 추가로 주 사형 전자 현미경 (: 2,000X 배율)을 이용하여 조사 하였다. 디스크는 직경 12mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


원시 및 펩타이드 수정 된 PTFE 그림 3. 내피 세포 배양. 미처리 샘플이되는 EC (A는 C가, E 24 시간 후, w 1과 2는 각각 w) 펩타이드 변형 물질에 부착과 성장하는 반면 크게 향상 식민지가되지 않습니다 (각각 w 24 시간 1 승 2 이후 B, DF). 스케일 바 :. 100 μm의 배율 100X 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
ImageJ에 분석에 의해 셀 커버리지 그림 4. 정량화. 노출 된 PTFE (A, C에 세포 성장,E) 및 REDV 공액 고분자 표면에은 (B는, D, F)는 전체 면적의 비율 범위로 표시됩니다. 고정 된 펩타이드는 분명히 초기 접착력 (B)를 가능하게하고 2 주 동안 (D, F)을 통해 식민지를 지원합니다. ) 평균 ± 표준 편차, 결정을 세중. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
5는 혈관 내피 세포의 팽창 PTFE 1 주간 자란.의 ePTFE의 구조는 주사 전자 현미경 (A)를 사용하여 도시된다. 다공성 물질에 얻어진 결과는 평평한 PTFE 시험편에 대해 얻은 결과에 따라이다. 검색된 몇 셀 달리노출 된 재료 (B)의 표면 개질 (C)은 세포 성장을위한 우수한 기질을 제공한다. 스케일 바는 각각 A, B 및 C 100 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
도 6 습식 화학 제를 사용하여 PTFE의 화학적 변형의 도식 표현. 나트륨 - 나프탈렌 나이드 처리에 의해 생성 된 이중 결합 작용기 OH-결과 산화된다. 수산기의 반응성 이소시아네이트이어서 아민 고정화 가수 분해된다. 마지막으로 디 에폭시 관능의 N 말단 아미노기를 이용 REDV 펩티드 컨쥬 게이트에인가된다. V 여기를 클릭하세요이 그림의 더 큰 버전을 서평.

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Discussion

PTFE 표면 개질 프로토콜의 상세한 설명은도 6에 도시 된 바와 같이 중합체 골격으로부터의 불소의 제거로 시작하는 연속적인 단계로 구성된다. 결과적으로, 층의 공액 탄소 - 탄소 이중 결합의 풍부한 양을 포함하는 형성되고 나프탈​​렌 나이드 치료에 개발 된 어두운 갈색 색상에 따라. 산성 과산화수소와 표준 산화는 옅은 갈색으로 밝게 동행 수산화면,이 이중 결합의 손실을 반영 산출한다. 이 프로세스는 명확 IR 분광법에 의해 입증된다.

보다 일반적으로 해당 기능을 달성하기 위해, 펜던트-OH 기는 차 아민의 NCO-잔기의 디 이소시아네이트 및 후속 가수 간단한 처리에 의해 아미노 작용기로 전환 하였다. 아민 - 함유 물질이 HIG 반면 장기간 저장 될 수 있기 때문에, 바람직하다hly 반응성 이소시아네이트 습도의 존재에 매우 민감하다.

나트륨 나프탈렌 나이드 이소시아네이트 모두 가수 분해에 매우 취약하기 때문에, 심지어 초기 활성화 단계와 HMDI 처리 물에 미량의주의가 회피에주의해야한다. 시료가 완전히 용액에 침지되어있는 표준 절차와 대조적으로, 본 프로토콜은 시약의 소량을 필요로한다. 따라서이 방법은 비용이 많이 드는 펩티드를 많이 절약 할 수 있습니다.

아민 - 함유 표면은 다양한 생체 분자의 결합을위한 이상적인 출발점이다. 이 연구에서 사용 된 디 에폭시 여러 안부 재미있다 : 그것은 "생리 학적으로 불활성"디올으로 수성 환경에서 가수 분해되어, 친수성, 비교적 저렴​​한 아민과 미 반응 에폭시 대한 반응성이 매우 높은 것입니다. 하나의 반응기가 존재 O이고 호모이 기능성 가교제는 적당한 시약이다n은 펩타이드는 고정된다. 이는 (이 자주 사용되는 시퀀스 RGDS 동일하다)를 N 말단에 단 하나의 일차 아미노기를 함유 REDV 적용된다. (측쇄 아민) 리신 잔기를 함유하는 펩티드 공액의 결과는 적절한 결합 정의 된 방식으로 발생하지 않는 것을 의미 모호하다. 이 경우, 이종 가교제 (예를 들면, 아민 및 티올 - 반응성) 및 시스테인 (C 또는 N- 말단)를 함유하는 펩티드를 사용하는 전략 유용 18이다.

세포 접착의 측면에서 펩티드 고정화 결과는 모호 (도 3 및도 4)이다. 사실상 세포가 노출 된 PTFE에 부착하지 반면, REDV - 수정 재료를 우수한 세포 접착 기판을 렌더링합니다. 이 기술은 유사한 결과로 다공성 (확장) PTFE (도 5에 적용 할 수있는 것은 전술 한 프로토콜 예비 작업 표시 상보 (13), 플라즈마 중합 19)의 사용을 기술 표면 대조적으로,이 프로토콜은 쉽게 구할 화학 및 실험 절차를 이용하여 매우 복잡한 장비를 피함으로써 PTFE의 공유 적 변형에 대한 지침을 제공한다. 반응성 플라즈마 (O 2, NH 3 등) 및 플라즈마 중합 등의 플라즈마 방법은 다공성 구조 또는 튜브 내에서 적용되지 않습니다 때문에 반응성 종 (예, 라디칼) 때문에 물질과의 접촉시 불 활성화에 이러한 구조에 침투 할 수 없습니다 표면. 예를 들어 소 구경 혈관 이식 (직경 <5 mm)를 이런 방식으로 처리 할 수​​ 없다. 이와 대조적으로, 습식 화학 수단에 의해, 장치의 형상에 대한 제한은 없다. 이러한 방식에서, endoth의 형성을 가능하게함으로써의 ePTFE 혈관 이식, 혈전 및 장기 개통의 내강 측 elial 층은 개선 될 수있다. 또한, 수술 탈장 메쉬 세포 접착면은 더 나은 조직 통합 될 예정이다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PTFE foil 0.5 mm Cadillac Plastic  n/a
REDV peptide Genecust n/a custom synthesis >95% purity
iso-propanol Sigma Aldrich 34965
tetrahydrofurane (THF) Sigma Aldrich 401757
dimethylsulfoxide Sigma Aldrich D8418
molecular sieve 3 Å Sigma Aldrich 208574
sodium metal Sigma Aldrich 483745
phosphate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich D8537
naphthalene Sigma Aldrich 147141
hydrogen peroxide 30% Sigma Aldrich 95321
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399 
diethylene glycol diglycidyl ether Sigma Aldrich 17741
hexamethylene diisocyanate (HMDI) Sigma Aldrich 52650
Calcein-AM Sigma Aldrich 56496
sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014 
sodium azide Sigma Aldrich 71290
24 well plates Greiner-Bio-One 662 160
ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850  Nicolet n/a
fluorescence microscope Olympus X-70 Olympus n/a
humbilical vein endothelial cells (HUVECs) Lonza n/a
ePTFE vascular graft Gore n/a

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References

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생물 판 (114) 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 생체 재료 조직 공학 표면 개질 펩티드 고정화 REDV 내피 세포 혈관 이식에 내피 세포 혈액 접촉면
향상된 세포 접착 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 젖은 화학 및 펩티드 고정화
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Gabriel, M., Niederer, K., Frey, H.More

Gabriel, M., Niederer, K., Frey, H. Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion. J. Vis. Exp. (114), e54272, doi:10.3791/54272 (2016).

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