Abstract
Dotar a los materiales de superficie con propiedades de células adhesivo es una estrategia común en la investigación de biomateriales e ingeniería de tejidos. Esto es particularmente interesante para los polímeros ya aprobados que tienen un uso de larga data en la medicina debido a que estos materiales son bien caracterizados cuestiones y legales asociados a la introducción de los polímeros recién sintetizados puede ser evitado. Politetrafluoroetileno (PTFE) es uno de los materiales más frecuentemente empleado para la fabricación de injertos vasculares pero el polímero carece de adhesión celular promover características. Endotelización, es decir, la cobertura completa de los injertos de la superficie interior con una capa confluente de células endoteliales se considera clave para el rendimiento óptimo, principalmente mediante la reducción de la trombogenicidad de la interfaz artificial.
Este estudio investiga el crecimiento de células endoteliales en PTFE péptido modificado y compara estos resultados con los obtenidos en el sustrato sin modificar. El acoplamiento con elpéptido adhesivo de células endoteliales Arg-Glu-Asp-Val (REDV) se realiza a través de la activación del polímero que contiene fluorin-usando el reactivo naftalenuro sódico, seguido de pasos Conjugación posteriores. El cultivo celular se realiza utilizando células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) y un excelente crecimiento celular en el material peptídico inmovilizado se demuestra en un período de dos semanas.
Introduction
Varios polímeros utilizados en la medicina que han sido aprobados por algún tiempo no exhiben una mayor biocompatibilidad, es decir, la falta de células adhesividad, la inducción de la encapsulación fibrótica y la trombogenicidad, por mencionar unos pocos. Las interacciones entre el biomaterial y el sistema biológico se lleva a cabo principalmente en la superficie del implante. Como consecuencia, la investigación se ha centrado en la modificación de superficie con el fin de crear propiedades adecuadas para una aplicación deseada, dejando las propiedades a granel del material no modificado. Politetrafluoroetileno (PTFE) como un polímero fisiológicamente inerte se utiliza en muchos campos de la medicina, tales como hernia de malla quirúrgica 1, los puertos médicos 2 y, lo más importante, los injertos vasculares 3.
Especialmente en situaciones de contacto con la sangre la naturaleza hidrófoba de PTFE hace que la adsorción no específica de los componentes del plasma y, como consecuencia de adhesión de plaquetas, resultando a menudo en thrombotic acontecimientos y la oclusión del injerto 4. Además, PTFE, como la mayoría de los polímeros, no es compatible con la adhesión celular y la cobertura de lo que sería una característica deseable para inducir la formación de una capa beneficioso de las células endoteliales (EC) en la superficie interna (luminal) del injerto vascular 5. Se espera que un endotelio biomimético para cumplir muchas de las funciones de su equivalente natural, en particular sus propiedades antitrombogénicas 6. Una estrategia general modificación biomimético se basa en el concepto de dotar exclusivamente el material con células adhesividad mientras que deja las propiedades materiales a granel no afectado. Además, la adhesión de plaquetas se puede reducir mediante la incorporación de anti-adhesivo (antifouling) atributos de 7. Varios péptidos - en su mayoría derivados de proteínas de la matriz extracelular - se han descrito que mejoran fuertemente de adhesión celular mediante la unión a receptores celulares, que pertenece a la clase de integrinas 8. El serejemplo st-conocido en este sentido es el péptido Arg-Gly-Asp (RGD) que interactúa con la mayoría de tipos de células. Otras secuencias de aminoácidos son reconocidos por las integrinas expresadas exclusivamente en células específicas. Por ejemplo, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) y Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) se ha encontrado que se unen a ECs de una manera específica 9. La inmovilización covalente de tales péptidos se ha llevado a cabo en una gran variedad de materiales inherentemente no adhesivas, incluyendo metales y polímeros 10,11.
PTFE poroso, más precisamente PTFE expandido (ePTFE) - junto con tereftalato de polietileno (PET) - es el material más importante para la producción de injertos vasculares 12. Técnicas físicas establecidas para los tratamientos adecuados, como la modificación de plasma 13 o por métodos fotoquímicos 14, se ven obstaculizados por el hecho de que las estructuras porosas y / o tubulares no son fácilmente tratables dentro de los poros o el lumen respectivamente. química húmedaen PTFE es una tarea difícil debido a la naturaleza altamente inerte del polímero que contiene fluorin-que resiste ataques más químicos 15.
En este trabajo se describe un método relativamente fácil para una estrategia de modificación covalente. Adaptado de un procedimiento para hacer bondable PTFE, grupos funcionales fueron creados en la superficie de los materiales que sirven como puntos de anclaje para su posterior conjugación de moléculas biológicamente activas.
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Protocol
1. Preparación de sodio solución activadora naftalenuro y activación de superficies
Nota: Llevar a cabo las reacciones en una campana extractora bien ventilada. Seguir las reglas generales para la manipulación de disolventes altamente inflamables y corrosivos metales como el sodio metálico. Naftaleno tiene un olor muy desagradable (naftalina), incluso en cantidades muy pequeñas! Si no se indica lo contrario las reacciones se realizaron a temperatura ambiente. La azida de sodio es altamente tóxico! THF (99,9%, ver Lista de Materiales) se almacenó durante aproximadamente 20% (en volumen) de tamiz molecular. Se destila THF con un contenido de agua notable sobre sodio. La formación de naftalenuro sódico no se produce si trazas de agua están presentes.
- A una solución de 1,4 g (10,9 mmol) de naftaleno en 20 ml de tetrahidrofurano (THF, se secó sobre tamiz molecular 3 Å), añadir 0,25 g (10,9 mmol) de sodio metálico en una botella de vidrio de 100 ml con tapón de rosca equipado con un PTFE recubierto barra de agitación magnética.
Nota: Dissolución se puede mejorar en gran medida mediante la reducción de las sales de sodio en trozos pequeños y calefacción modestos (35 - 40 ° C). La solución final tiene un color oscuro, ligeramente verdoso y se puede almacenar en condiciones estrictamente secas. - Perforar discos de PTFE de 12 mm de diámetro a partir de material de aluminio de espesor 0,5 mm. Marcar un lado (por ejemplo, mediante una carta punzón sello) y limpio con iso-propanol.
- Incubar PTFE muestras individualmente en la solución de activación (paso 1.1) para el 1 - 2 min utilizando fórceps. Nota: El cambio de color de blanco a marrón oscuro indica un tratamiento exitoso.
- Posteriormente enjuagar dos veces con THF y después con iso-propanol.
Nota: La solución naftalenuro se agota cuando su color cambia a un color marrón claro acuosa. naftalenuro solución no utilizada (que posiblemente contiene sodio metálico) tiene que ser descompuesto por adición lenta de iso-propanol antes de su eliminación. - Oxidar las muestras tratadas en peróxido de hidrógeno (30%) que contiene 20% (w / v) de ácido tricloroacético durante 3 h. lavarcon agua y secar. La superficie tiene ahora una ligera apariencia de color marrón. Nota: La activación y el resultado de oxidación en un incrementado drásticamente humectabilidad de la superficie. Este hallazgo fue examinado en detalle previamente 14.
- El tratamiento de discos oxidados con 50% (v / v) hexametilendiisocianato (HMDI) en THF seco durante 2 horas, enjuague con THF y dejar secar.
- Hidrolizar muestras portadores de grupos isocianato en agua durante 2 - 3 horas y se seca. Nota: La superficie de PTFE amino-funcionalizado final es mucho más estable que las muestras de soporte de isocianato y es compatible con muchos agentes de reticulación estándar para acoplamiento adicional.
2. Péptido Inmovilización
- Preparar una solución de 20% (v / v) de éter de dietilenglicol diglicidil (diepóxido) en 50 mM de tampón carbonato, pH 9.
- Coloque los discos aminados con el lado marcado de forma individual en una placa de 24 pocillos y añadir 1,5 ml de la solución de epóxido. Garantizar la cobertura total de las muestras. Incubar durante 2 horas y se lava dosveces con agua y una vez con tampón de carbonato.
- Añadir 50 l de un 0,5 mg / ml de péptido (por ejemplo, REDV) en 50 mM de tampón carbonato, pH 9 que contiene 0,01% NaN 3, a la parte inferior de los pocillos individuales de una placa fresca 24 y se coloca cuidadosamente la epoxi-funcionalizado discos al revés -down (es decir, marcado de cara abajo) en la gota de la solución de péptido. Asegúrese de que el espacio entre el fondo del pozo y el disco de PTFE está completamente humectada debido a la acción capilar.
- Incubar en una cámara húmeda (por ejemplo, cualquier caja de plástico sellable con una tapa de cierre hermético) con atmósfera humidificada (mediante la colocación de papel de seda húmedo en la parte inferior) durante al menos 3 horas o durante la noche.
Nota: Aunque el motivo REDV puede ser considerado como bien caracterizado, una secuencia de aminoácidos codificada o inversa puede ser incluido como un control negativo adicional. - Lavar tres veces con agua y esterilizar en 50% iso-propanol / agua durante al menos 30 min. Antes de la siembra de células, Rinse las muestras en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
3. La siembra de la célula
- Crecer HUVEC utilizando procedimientos estándar de cultivo celular 17,18.
- Colocar las muestras de péptido conjugado con el lado modificado en unas placas de 24 pocillos. Utilice discos de PTFE sin tratar como control.
- Semilla de 5 x 10 4 HUVEC en 2 ml de medio por pocillo y se incuba durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora.
- Retire los discos, enjuagar cuidadosamente para eliminar las células no fijadas y la transferencia a una placa de 24 fresca. Añadir 2 ml de medio fresco y se incuba durante el periodo deseado (por ejemplo, 24 horas, 1 w, etc.). Cambio de medio cada dos días.
- Preparar una solución madre de 1 mg / ml de calceína-AM en sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Después de crecer las células eliminar el medio, se lavan con PBS y se añaden PBS que contiene 1 l / ml mancha calceína-AM (por ejemplo, 1 l de una solución madre por ml PBS). agitar y incubat suavementeE a 37 ° C durante 45 minutos en la oscuridad.
- Lavar con PBS e inmediatamente tomar micrografías en un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de FITC estándar (Ex 488 nm, Em 515 nm). Utilice amplificación de 100 veces. Realizar triplicados de no modificado, así como las muestras tratadas.
- El uso de software ImageJ determinar el área colonizado por las células. Alternativamente contar las células manualmente o utilizar ImageJ. Ambos métodos darán información similar acerca de la unión y el crecimiento de las células en las superficies respectivas.
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Representative Results
Los resultados de las etapas de reacción químicas cruciales fueron controlados por espectroscopia de IR (Figura 1). La activación inicial con naftalenuro de sodio genera enlaces dobles - y en un grado menor - OH funcionalidades. La señal que indica C = C enlaces desaparecen tras la oxidación, produciendo una superficie de apoyo casi exclusivamente grupos hidroxilo. Análisis de nuevas medidas Conjugación estándar no se muestran aquí. Los cambios de color debido a la activación y la oxidación están de acuerdo con la química esperado que se utiliza: Se espera que los sistemas de unión dobles conjugados a ser de color marrón y sus resultados de pérdida de brillo (Figura 2). Además, el posible resultado de la activación y la oxidación en la morfología de la superficie fue investigado por medio de microscopía electrónica de barrido. Prácticamente no se observó ningún efecto perjudicial del tratamiento (Figura 2).
Figuras 3 y 4 muestran el resultado de REDV-inmovilización sobre el crecimiento celular endotelial. Mientras que prácticamente no adhesión y proliferación celular se produce en el material sin tratar la modificación apoya firmemente la colonización durante un período de dos semanas. Ejemplifica para una aplicación clínica (es decir, injertos vasculares), la modificación se realizó de forma idéntica en material original de un injerto disponibles comercialmente de PTFE expandido con un resultados similares durante un período de una semana (Figura 5).
Figura 1. espectroscopia IR de PTFE. El tratamiento de PTFE virgen (A) resulta en la formación de dobles enlaces y en cierta medida de funciones hidroxi (B). Posteriormente C = C enlaces se reducen debido a la oxidación (C Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Aspecto óptico de PTFE activado al descubierto y la superficie. (A) Considerando que el PTFE sin tratar (izquierda) aparece en color blanco, la activación mediante naftalenuro de sodio produce un color marrón oscuro (en el centro) que está ligeramente iluminó la oxidación (derecha). Las muestras no tratadas (B) y se oxida de PTFE (C) se investigaron adicionalmente mediante microscopía electrónica de barrido (aumento: 2,000x). Los discos son de 12 mm de diámetro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. cultivo de células endoteliales en PTFE virgen y el péptido modificado. Las muestras no tratadas no son colonizados por ECs (A, C, E después de 24 hr, 1 w y w 2, respectivamente), mientras que la adhesión y el crecimiento en el material de péptido modificado es mucho mayor (B, D y F después de 24 horas, 1 w w y 2, respectivamente). Barra de escala:. 100 micras, un aumento de 100X Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La cuantificación de la cobertura de la célula por el análisis de ImageJ. Crecimiento celular en PTFE desnudo (A, C,E) y en las superficies de polímero RedV conjugado (B, D, F) expresados como porcentaje de cobertura de superficie total. Péptido inmovilizado permite claramente la adhesión inicial (B) y apoya la colonización en un período de 2 semanas (D, F). Triplicados determinaciones, media ± desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Las células endoteliales se cultivaron durante 1 semana en PTFE expandido. La estructura de ePTFE se muestra utilizando microscopía electrónica de barrido (A). Los resultados obtenidos en el material poroso están en conformidad con los obtenidos para la muestra de PTFE planas. En contraste con las pocas células que se encuentranen el material desnudo (B) la superficie modificada (C) proporciona un excelente sustrato para el crecimiento celular. Las barras de escala son 100 micras para A, B y C, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Representación esquemática de la modificación química de PTFE usando wet-química. Los enlaces dobles generados por tratamiento Na-naftalenuro se oxidado resultante en OH funcionalidades. Un diisocianato que reacciona con hidroxilo está entonces inmovilizado y se hidroliza a una amina. Por último, el diepóxido bifuncional se aplica para conjugar el péptido REDV utilizando el grupo amino N-terminal. Por favor, haga clic aquí para vIEW una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La descripción detallada del protocolo de modificación de la superficie de PTFE consiste en etapas sucesivas empezando con la eliminación de flúor de la cadena principal de polímero tal como se representa en la Figura 6. Como resultado, se forma una capa que contiene una abundante cantidad de dobles enlaces carbono-carbono conjugados en de acuerdo con el color de color marrón oscuro que se desarrolló en el tratamiento naftalenuro. oxidación estándar con peróxido de hidrógeno ácido produce una superficie hidroxilada acompañado de brillo a un color marrón pálido, esto refleja la pérdida de dobles enlaces. Este proceso se evidencia claramente por espectroscopia IR.
Con el fin de lograr una funcionalidad de aplicación más general, el colgante grupos OH se convirtieron en amino-funcionalidades por tratamiento simple con un diisocianato y la posterior hidrólisis de los restos NCO a aminas primarias. Esto es favorable, ya que el material de soporte de amina se puede almacenar durante períodos prolongados, mientras que la HIGHly isocianato reactivo es susceptible a la misma presencia de humedad del aire.
Se debe tener cuidado en evitar la incluso cantidades traza de agua en la etapa de activación inicial y el tratamiento HMDI porque tanto naftalenuro de sodio y el isocianato son muy susceptibles a la hidrólisis. En contraste con los procedimientos estándar en el que la muestra se sumerge completamente en la solución, el presente protocolo requiere sólo pequeñas cantidades del reactivo. Por lo tanto este método ahorra una gran cantidad del péptido costoso.
amina superficies que soportan son puntos de partida ideal para el acoplamiento de muchas biomoléculas. El diepóxido empleado en este trabajo es interesante en varios aspectos: es comparativamente barato, hidrófilo, altamente reactivos hacia las aminas y epóxidos que no han reaccionado se hidrolizan en un entorno acuoso en dioles "fisiológicamente inertes". reticuladores homobifuncionales son reactivos adecuados en el que sólo un grupo reactivo está presente on el péptido que va a inmovilizarse. Esto se aplica para REDV que contiene solamente un único grupo amino primario en el N-terminal (este es el mismo para los RGDS secuencia de uso frecuente). Para los péptidos que contienen residuos de lisina (con aminas de cadena lateral) el resultado de la conjugación es ambigua, lo que significa que el acoplamiento correcto no se produce de una manera definida. En este caso, una estrategia de uso de agentes de reticulación heterobifuncionales (por ejemplo, aminas y reactivos con tiol) péptidos que contienen cisteína y (N- o C-terminales) es útil 18.
Los resultados de la inmovilización de péptidos en términos de la adhesión celular no es ambigua (Figuras 3 y 4). Mientras que prácticamente no se adhieren a las células de PTFE desnudo, REDV modificación hace que el material un excelente sustrato de células adhesivo. Como complemento a lo anterior mencionado protocolo trabajos preliminares muestran que esta técnica también es aplicable en PTFE poroso (ampliado) con resultados similares (Figura 5 13, polimerización por plasma 19) de superficie, este protocolo proporciona una guía para la modificación covalente de PTFE mediante el empleo de productos químicos fácilmente disponibles y procedimientos de laboratorio y evitando equipos altamente sofisticados. Metodologías de plasma tales como plasma reactivo (O 2, NH 3, etc.) y polimerización por plasma no son aplicables dentro de construcciones porosas o tubos ya que las especies reactivas (por ejemplo, los radicales) no son capaces de penetrar en estas estructuras debido a la inactivación al entrar en contacto con los materiales superficie. Por ejemplo injertos vasculares de pequeño calibre (diámetro <5 mm) no pueden ser tratados de esta manera. En contraste con esto, por medio de química húmeda, no hay ninguna restricción en cuanto a la forma del dispositivo. De esta manera, al permitir la formación de un endothELIAL capa en el lado luminal de un injerto vascular de ePTFE, trombogenicidad y la permeabilidad a largo plazo puede ser mejorado. Además, una superficie adhesiva celular para mallas de hernias quirúrgicas se supone que como resultado una mejor integración del tejido.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
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