Abstract
Endowing materialer overflaten med celle-lim egenskaper er en felles strategi i biomateriale forskning og tissue engineering. Dette er spesielt interessant for allerede godkjente polymerer som har en langvarig bruk i medisin fordi disse materialene er godt karakteriserte og juridiske problemstillinger knyttet til innføringen av nye syntetiserte polymerer kan unngås. Polytetrafluoretylen (PTFE) er en av de mest anvendte materialer for fremstilling av vaskulære transplantater, men at polymeren mangler celle-adhesjons-fremmende egenskaper. Endotelialisering, dvs. at fullstendig dekning av grafts indre overflate med et konfluent lag av endotelceller ansett nøkkelen til optimal ytelse, hovedsakelig ved å redusere trombogenisitet av den kunstige grensesnittet.
Denne studien undersøker veksten av endotelceller på peptid-modifisert PTFE og sammenligner disse resultatene med de som ble oppnådd med ikke-modifisert substrat. Kopling med denendotelcelle klebende peptidet Arg-Glu-Asp-Val (REDV) utføres via aktivering av fluorin-inneholdende polymer ved hjelp av reagenset natrium naphthalenide, etterfulgt av etterfølgende konjugasjon trinn. Cellekultur gjøres ved hjelp av menneskelig navleveneendotel Cells (HUVECs) og utmerket cellevekst på peptid-immobilisert materiale er vist over en to-ukers periode.
Introduction
Forskjellige polymerer som anvendes i medisin som er godkjent i noen tid ikke oppviser forbedret biokompatibilitet, dvs. manglende celle-klebrighet, induksjon av fibrotisk innkapsling og trombogenisitet, for å nevne noen få. Interaksjoner mellom biomaterialet og det biologiske system foregår hovedsakelig på overflaten av implantatet. Som en følge av dette har forskning fokusert på overflatemodifisering for å skape hensiktsmessige egenskaper for en ønsket anvendelse og samtidig la bulk materialets egenskaper upåvirket. Polytetrafluoretylen (PTFE) som en fysiologisk inert polymer er brukt i mange medisinske felt som brokk kirurgisk maske 1, medisinske porter 2 og, viktigst, vaskulære implantater 3.
Spesielt i blodet i kontakt situasjoner den hydrofobe karakter av PTFE bevirker uspesifikk adsorpsjon av plasmakomponentene, og som en konsekvens blodplateadhesjon, ofte resulterer i thrombotic hendelser og okklusjon av pode 4. Videre PTFE, som de fleste polymerer, støtter ikke cellulær adhesjon og dekning som ville være en ønskelig egenskap for å indusere dannelsen av et fordelaktig lag av endoteliale celler (ECS) på den indre (luminale) overflaten av det vaskulære implantat 5. En biomimetic endotelet er forventet å oppfylle mange av funksjonene til sin naturlige tilsvarende, særlig dens antithrombogenic egenskaper 6. En generell biomimetisk modifikasjon strategi er basert på konseptet med utelukkende endowing materialet med celle-klebrighet og samtidig la materialene bulkegenskapene upåvirket. I tillegg kan blodplateadhesjon reduseres ved inkorporering av anti-klebemiddel (anti-fouling) attributter 7. Forskjellige peptider - for det meste stammer fra proteiner fra den ekstracellulære matriks - er blitt beskrevet som sterkt forbedre celle-adhesjon ved å binde seg til cellulære reseptorer, som tilhører klassen av integriner 8. det værest kjent eksempel i denne forbindelse er peptidet Arg-Gly-Asp (RGD) som samvirker med de fleste celletyper. Andre aminosyresekvenser blir gjenkjent av integriner utelukkende uttrykt på spesifikke celler. For eksempel er Arg-Glu-Asp-Val (REDV) og Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) blitt funnet å binde til ECS på en bestemt måte ni. Kovalent immobilisering av slike peptider er blitt utført på en mengde av iboende ikke-klebende materialer, inkludert metaller og polymerer 10,11.
Porøs PTFE, mer presist ekspandert PTFE (ePTFE) - sammen med polyetylentereftalat (PET) - er det viktigste material for fremstilling av vaskulære implantater 12. Etablerte fysiske teknikker for passende behandlinger, slik som plasma modifikasjon 13 eller ved fotokjemiske metoder 14, blir hemmet av det faktum at porøse og / eller rørformede strukturer er ikke lett lar seg behandle på innsiden henholdsvis porer eller lumen. Wet kjemipå PTFE er en vanskelig oppgave på grunn av den sterkt inerte natur av fluorin-inneholdende polymer som motstår de kjemiske angrep 15.
I denne beskrivelsen beskriver vi et forholdsvis lettvint fremgangsmåte for en kovalent modifikasjon strategi. Tilpasset fra en prosedyre for å gjengi PTFE bondable, ble funksjonelle grupper opprettet på materialer overflate som tjener som forankringspunkter for ytterligere konjugering av biologisk aktive molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Sodium Naphthalenide Aktivere Solution og Surface Activation
Merk: Utfør reaksjoner på et godt ventilert avtrekkshette. Følg generelle regler for håndtering av meget brannfarlige løsemidler og etsende metaller som metallisk natrium. Naftalen har en meget ubehagelig lukt (mothball), selv i meget små mengder! Dersom ikke annet er indikert reaksjonene blir utført ved romtemperatur. Natriumazid er svært giftig! THF (99,9%, se liste over materialer) ble lagret i løpet av ca. 20% (ved volum) molekylsikt. Destillere THF med en merkbar vanninnhold over natrium. Dannelsen av natrium naphthalenide oppstår ikke hvis spor av vann er tilstede.
- Til en oppløsning av 1,4 g (10,9 mmol) naftalen i 20 ml tetrahydrofuran (THF, tørket over 3 Å molekylsikt), tilsett 0,25 g (10,9 mmol) natrium-metall i en med skrulokk 100 ml glassflaske utstyrt med en PTFE- belagt magnetisk rørestav.
Merk: Dissolusjon kan bli betydelig forbedret ved å kutte natrium i små biter og beskjeden oppvarming (35 - 40 ° C). Den endelige oppløsning har en mørk, litt grønnaktig farge og kan bli lagret under strengt tørre forhold. - Slå ut PTFE-plater med diameter 12 mm fra 0,5 mm tykk folie. Mark ene siden (for eksempel ved hjelp av et brev stempel slag) og rent med isopropanol.
- Inkuber PTFE-samples individuelt i den aktiverende oppløsning (trinn 1.1) i 1 - 2 minutter ved hjelp av tang. Merk: fargeendring fra hvit til mørk brun indikerer vellykket behandling.
- Deretter skylles to ganger med THF og deretter med isopropanol.
Merk: naphthalenide Løsningen er oppbrukt da endrer det farge til en vassen lys brun. Ubrukt naphthalenide løsning (eventuelt inneholdende metallisk natrium) har til å bli spaltet ved langsom tilsetning av iso-propanol før tømming. - Oksidere behandlede prøver i hydrogenperoksyd (30%) inneholdende 20% (w / v) trikloreddiksyre i 3 timer. vaskmed vann og tørk. Overflaten har nå en svak brunaktig utseende. Merk: Aktivering og oksydasjon resulterer i en drastisk øket fukting av overflaten. Dette funnet ble undersøkt i detalj tidligere 14.
- Unn oksidert plater med 50% (v / v) heksametylendiisocyanat (HMDI) i tørr THF for 2 timer, skyll med THF og la tørke.
- Hydrolyze isocyanat førende prøver i vann for 2-3 timer og tørr. Merk: Den endelige amino-funksjonaliserte PTFE overflaten er langt mer stabil enn den isocyanat-bærende prøver, og er kompatibel med mange vanlige tverrbindingsmidler for videre kobling.
2. Peptide Immobilisering
- Fremstille en løsning av 20% (v / v) dietylenglykol-diglycidyleter (diepoksyd) i 50 mM karbonatbuffer, pH 9.
- Plasser aminerte plater med den merkede siden opp individuelt i en 24 brønners plate og tilsett 1,5 ml av epoksid løsning. Sikre full dekning av prøvene. Inkuber i 2 timer og vask toganger med vann og en gang med karbonatbuffer.
- Tilsett 50 pl av en 0,5 mg / ml peptid (f.eks REDV) i 50 mM karbonatbuffer, pH 9 inneholdende 0,01% NaN3, til bunnen av individuelle brønner i en ny 24-brønners plate og plassere den epoksy-funksjonaliserte plater opp nøye -ned (dvs. markert siden ned) til dråpe av peptidet løsning. Sørge for at avstanden mellom bunnen av brønnen og PTFE-platen er fullstendig fuktet på grunn av kapillarvirkning.
- Inkuber i et fuktig kammer (for eksempel en hvilken som helst lukkbar boks med en tett lukking lokk) med fuktig atmosfære (ved å anbringe vått papir på bunnen) i minst 3 timer eller over natten.
Merk: Riktignok REDV motivet kan betraktes som godt karakterisert, en kryptert eller omvendt aminosyresekvens kan inngå som en ytterligere negativ kontroll. - Vask tre ganger med vann og sterilisere i 50% iso-propanol / vann i minst 30 min. Før celle seeding, rinse prøvene i steril fosfatbufret saltløsning (PBS).
3. Cell Seeding
- Grow HUVECs bruker standard cellekultur prosedyrer 17,18.
- Plasser peptid-konjugert prøver med den modifiserte siden opp i en 24 brønners plater. Bruk ubehandlet PTFE-plater som kontroll.
- Seed 5 x 10 4 HUVECs i 2 ml medium per brønn og inkuber i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator.
- Fjern platene, skyll nøye for å fjerne fristilt celler og overføre til en frisk 24-brønners plate. Tilsett 2 ml friskt medium og inkuberes i den ønskede periode (for eksempel 24 timer, en w, etc.). Endre medium annenhver dag.
- Fremstille en stamløsning av 1 mg / ml Calcein-AM i dimetylsulfoksyd (DMSO).
- Etter dyrking av cellene fjerne mediet, vask med PBS og legge til PBS inneholdende 1 pl / ml Calcein-AM flekk (f.eks, 1 ul av en stamoppløsning per ml PBS). Beveg lett og incubate ved 37 ° C i 45 min i mørket.
- Vask med PBS og umiddelbart ta mikrofotografier på et fluorescens mikroskop utstyrt med standard FITC-filtre (Ex 488 nm, Em 515 nm). Bruk 100 gangers forstørrelse. Utføre triplikater fra umodifisert samt behandlede prøver.
- Ved hjelp av ImageJ programvare bestemme området kolonisert av cellene. Alternativt telle cellene manuelt eller bruke ImageJ. Begge metoder vil gi tilsvarende informasjon om festingen og veksten av celler på de respektive overflater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene av de viktige kjemiske reaksjonstrinnene ble overvåket ved IR-spektroskopi (figur 1). Den innledende aktivering med natrium naphthalenide genererer dobbeltbindinger - og til en mindre grad - OH-funksjonalitet. Det signal som indikerer C = C-bindinger forsvinne ved oksydasjon, noe som gir en overflate som bærer nesten utelukkende hydroksylgrupper. Analyse av ytterligere vanlige konjugering trinn er ikke vist her. Fargeendringer som følge av aktivering og oksydasjon er i overensstemmelse med den forventede kjemi som er brukt: konjugerte dobbeltbindingssystemer, ventes å bli brun og dens tap resulterer i lysere (figur 2). I tillegg ble det mulige utfall av aktivering og oksidasjon på overflaten morfologi undersøkt ved hjelp av scanning elektronmikroskopi. Praktisk talt ingen skadelig virkning av behandlingen ble observert (figur 2).
Figurene 3 og 4 viser resultatet av REDV-immobilisering på endotelial cellevekst. Mens praktisk talt ingen celle-adhesjon og spredning skjer på ubehandlet materiale modifisering støtter sterkt kolonisering i løpet av en to ukers periode. Eksemplifisert for en klinisk anvendelse (dvs., vaskulære transplantater), ble modifikasjon identisk utført på originalt materiale fra et kommersielt tilgjengelig pode fremstilt av ekspandert PTFE med en lignende resultater over en periode på en uke (figur 5).
Figur 1. IR-spektroskopi av PTFE. Behandling av uberørt PTFE (A) resulterer i dannelsen av dobbeltbindinger og til en viss grad av hydroksyfunksjoner (B). Deretter C = C obligasjoner er redusert på grunn av oksidasjon (C Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Optisk utseende av nakent og overflate aktivert PTFE. (A) Det ubehandlede PTFE (venstre) er hvit, aktivering ved hjelp av natrium-naphthalenide gir en mørk brun farge (i midten) som er litt lysere ved oksidasjon (til høyre). Ubehandlet (B) og oksydert PTFE (C) prøver ble også undersøkt ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (forstørrelse: 2,000X). Plater er 12 mm i diameter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Endotelial cellekultur på urørte og peptid-modifisert PTFE. Ubehandlede prøver er ikke kolonisert av ECS (A, C, E etter 24 timer, 1 w og w 2 henholdsvis), mens adhesjon og vekst på peptid-modifisert materiale er betydelig forbedret (B, D og F etter 24 timer, 1 m og 2 m henholdsvis). Skala:. 100 mikrometer, forstørrelse 100X Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kvantifisering av celle dekning av ImageJ analyse. Cellular vekst på bart PTFE (A, C,E) og på REDV-konjugert polymer flater (B, D, F), uttrykt som prosent dekning av totalarealet. Immobiliserte peptidet muliggjør tydelig initial adhesjon (B) og støtte for kolonisering i løpet av en to-ukers periode (D, F). Tre bestemmelser, gjennomsnitt ± standardavvik). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Endotelceller dyrket i en uke på ekspandert PTFE. Strukturen av ePTFE er vist ved hjelp av scanning elektronmikroskopi (A). De oppnådde på porøst materiale resultatene er i overensstemmelse med dem som ble oppnådd for flate PTFE prøven. I motsetning til de få cellene ble funnetpå bart materiale (B) den modifiserte overflaten (C) gir et utmerket substrat for cellevekst. Skala barer er 100 mikrometer for henholdsvis A, B og C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Skjematisk fremstilling av kjemisk modifikasjon av PTFE ved hjelp av våt-kjemi. Dobbeltbindinger som er generert av Na-naphthalenide behandling oksyderes resulterer i OH-funksjonalitet. En hydroksyl-reaktiv diisocyanat blir så immobilisert og hydrolyseres til et amin. Endelig bifunksjonelle diepoxide påføres å bøye den REDV peptid bruke N-terminal aminogruppe. Klikk her for å vIEW en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den detaljerte beskrivelsen av overflatemodifisering protokoll av PTFE består av suksessive trinn som starter med eliminering av fluor fra polymerryggraden som vist i figur 6. Som et resultat av dette er et lag dannet som inneholder en rikelig mengde konjugerte karbon-karbon-dobbeltbindinger i samsvar med den mørke brunaktig farge som utvikles ved naphthalenide behandling. Standard oksidasjon med surt hydrogenperoksyd gir en hydroksylert overflate ledsaget av lysere til en lysebrun, gjenspeiler dette tapet av dobbeltbindinger. Denne prosessen er klart vist ved IR-spektroskopi.
For å oppnå et mer generelt gjelder funksjonalitet, ble anheng OH-grupper omdannet til amino-funksjonalitet ved enkel behandling med et diisocyanat og etterfølgende hydrolyse av NCO-grupper til primære aminer. Dette er gunstig, fordi amin-bærende materiale kan lagres i lengre perioder, mens den highly isocyanat er utsatt for selve tilstedeværelsen av luftfuktigheten.
Hensyn må tas i unngåelse av selv spormengder av vann i det første aktiveringstrinn og den HMDI behandling fordi både natrium naphthalenide og isocyanatet er svært utsatt for hydrolyse. I motsetning til standardprosedyrer i hvilken prøven er fullstendig nedsenket i oppløsningen, nødvendiggjør den foreliggende protokoll bare små mengder av reagenset. Derfor er denne fremgangsmåte sparer mye av den kostbare peptidet.
Aminlageroverflater er ideelle utgangspunkt for kobling av mange biomolekyler. Det diepoksyd som anvendes i dette arbeidet er interessant på flere forhold: det er forholdsvis billig, hydrofile, sterkt reaktive overfor aminer og ikke-omsatt epoksyder hydrolyseres i et vandig miljø i «fysiologisk inert" dioler. Homobifunksjonelle tverrbindingsmidler er egnede reagenser hvor bare en reaktiv gruppe er til stede on peptidet som skal immobiliseres. Dette gjelder for REDV inneholdende bare en enkelt primær amino-gruppe på N-terminalen (dette er den samme for de ofte brukte sekvens RGDS). For peptider inneholdende lysinrester (med sidekjede-aminer) utfallet av konjugering er tvetydig, noe som betyr at korrekt kopling forekommer ikke på en definert måte. I dette tilfellet, en strategi ved hjelp av heterobifunksjonelle tverrbindingsmidler (for eksempel amin- og tiol-reaktiv) og cystein (N- eller C-terminale) inneholdende peptider er nyttig 18.
Resultatene av peptidet immobilisering i form av celleadhesjon er entydige (figur 3 og 4). Mens nesten ingen cellene holder seg på bar PTFE, REDV-modifikasjon gjør materialet en utmerket celle-lim underlaget. Komplementære til ovennevnte protokoll forberedende arbeid viser at denne teknikken er også anvendelig på porøse (ekspandert) PTFE med lignende resultater (Figur 5 13, plasma polymerisering 19), gir denne protokollen en retningslinje for kovalent modifikasjon av PTFE ved å anvende lett tilgjengelige kjemikalier og laboratorieprosedyrene og ved å unngå svært avansert utstyr. Plasma metoder som reaktivt plasma (O 2, 3 NH, etc.) og plasmapolymeriseringen er ikke aktuelt innenfor porøse konstruksjoner eller slangen fordi reaktive arter (f.eks radikaler) er ikke i stand til å trenge gjennom disse strukturene på grunn av inaktivering ved kontakt med materialene flate. For eksempel liten kaliber vaskulære transplantater (diameter på <5 mm) kan ikke behandles på denne måten. I kontrast til dette, ved hjelp av våt kjemi, er det ingen begrensning med hensyn til formen på enheten. På denne måten, ved å muliggjøre dannelsen av en endothelial lag på den luminale siden av en ePTFE vaskulære implantat, trombogenisitet og langvarig åpenhet kan forbedres. I tillegg er en celle-klebende overflate for kirurgiske masker brokk ment for å resultere i bedre vev integrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S.
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S.
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
