A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.
Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.
Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.
We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.
One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.
The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).
CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.
हम जानते हैं कि chlorotriazine रंगों के आधार पर कर रहे हैं बहुरंगी CPH और आईसीबी substrates की एक नई पीढ़ी (तालिका 1 में substrates की पूरी सूची) का उपयोग कर रहे एक कस्टम डिजाइन वाणिज्यिक परख किट में व्यवस्था की। Substrates के एंजाइम पाचन छोटे, घुलनशील, रंगे उत्पादों जो परख समाधान में पहचाने जा रहे हैं और एक प्लेट पाठक 9 का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है अर्जित करता है। इस परख एंडो -acting एंजाइमों का मूल्यांकन और परख की संवेदनशीलता के लिए डिज़ाइन किया गया है AZURINE पार से जुड़े (AZCL) का उपयोग कर एक substrates 10 है, जबकि अन्य तरीकों EXO -acting एंजाइमों 11,12 के लिए उपलब्ध हैं इसी तरह की है। इस परख किट की सीमा steric बाधा डाई और crosslinker अणुओं 8 से उत्पन्न होने के कारण, एंडो -enzyme गतिविधि का पता लगाने में निहित के रूप में CPH के साथ ही आईसीबी substrates सड़ सकने नहीं EXO सबसे अधिक संभावना -enzymes से कर रहे हैं।
परख एक 96 wel में किया जाता हैएल प्रारूप और व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं कुओं में जगह ले लो। प्रतिक्रिया की थाली में मिलाया जा करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए है। जिसके परिणामस्वरूप supernatants एक उत्पाद प्लेट जहां प्रत्येक कुएं के absorbance absorbance स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है में छान रहे हैं। बुनियादी सिद्धांतों और परख के लेआउट चित्र 1 में दिखाया गया है। परख एक परख प्लेट (एक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट) substrates के साथ होते हैं, और एंजाइमों के साथ ऊष्मायन के बाद, सतह पर तैरनेवाला एक स्पष्ट अच्छी तरह से थाली में के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है और absorbances एंजाइम विशिष्टता और गतिविधि की एक अर्द्ध मात्रात्मक माप उपलब्ध कराने पढ़ रहे हैं। यह दिखाया गया है कि इस स्क्रीनिंग CPH substrates का उपयोग परख भी एक अगर प्लेट प्रारूप, जहां घुलनशील प्रतिक्रिया उत्पादों रात ऊष्मायन के बाद एक रंग का प्रभामंडल बनाने में इस्तेमाल किया जा सकता है। 8
परख किट के रूप में प्रदर्शन शुद्ध एंजाइम और अपनी क्षमता पक्ष गतिविधियों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताचित्रा 2। साइड गतिविधियों एक एंजाइम है और इसके अनेक विशिष्टता से, लेकिन यह भी एक तथ्य है कि नमूना विश्लेषण किया विभिन्न एंजाइमों का एक मिश्रण है और उनके समन्वित प्रभाव का अध्ययन किए जाने की जरूरत से पैदा कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, के रूप में यह पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है, कि कवक 8 के साथ ही अंतर्जात संयंत्र एंजाइम और बैक्टीरिया (अप्रकाशित डेटा) से एंजाइम कॉकटेल, पेट microbiota 13 और संस्कृति बतख एक एंजाइम स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
आईसीबी substrates अक्सर बायोमास टूटने के औद्योगिक प्रक्रियाओं में सामना करना पड़ा कोशिका दीवार घटकों के जटिल मिश्रण को संबोधित। इन substrates polysaccharide उपलब्धता का मूल्यांकन और कैसे प्रभावी ढंग से और अधिक कुशल गिरावट उत्पादन के लिए गिरावट कॉकटेल का अनुकूलन करने के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए तैयार कर रहे हैं। जैसा कि चित्र में सचित्र 3 CPH और आईसीबी substrates पक्ष द्वारा एंजाइम स्क्रीनिंग पक्ष में इस्तेमाल किया जा सकता है – एंजाइम विशिष्टता के बारे में जानकारी का खजाना खुलासादोनों वरीय सब्सट्रेट (CPH) और एक अधिक प्राकृतिक जटिल वरीय सब्सट्रेट और अधिक बारीकी से प्रकृति (आईसीबी) में पाया गया एक macromolecular विधानसभा नकल उतार के अलावा अन्य घटकों से युक्त के संदर्भ में विकास गतिविधियों। कई रंगों के उपयोग के कई substrates जो उच्च throughput और परख के multiplexity वृद्धि के खिलाफ अलग एंजाइम गतिविधियों के एक साथ पता लगाने के लिए अनुमति देता है। अलग-अलग रंगों के स्पेक्ट्रा सरल रेखीय प्रतिगमन द्वारा और ज्यादातर मामलों बहु सब्सट्रेट गतिविधि अकेले दृश्य निरीक्षण द्वारा मनाया जा सकता है में हल किया जा सकता है। इस तरह के प्रयोग और उसके परिणामों के एक नकली उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है।
इस परख उपकरण बॉक्स और उसके आवेदन की चंचलता बहुत अच्छी तरह से एंजाइम और अज्ञात गतिविधियों के साथ संस्कृति बतख की पहली स्तरीय स्क्रीनिंग के लिए अनुकूल हैं। इस परख के सर्वाधिक महत्वपूर्ण पहलुओं में अपनी उच्च throughput प्रकृति, customizability, उपयोग और लचीलेपन की आसानी रहे हैं। मन में है कि, w के साथई का मानना है कि उपकरण के इस उपन्यास सेट काफी सुधार और औद्योगिक में एंजाइम स्क्रीनिंग प्रक्रिया के साथ-साथ शैक्षणिक आवेदनों को गति देगा।
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए प्रो जे पॉल नॉक्स (लीड्स विश्वविद्यालय, ब्रिटेन), जो फिल्म के लिए अपनी प्रयोगशालाओं के लिए उपयोग प्रदान की है, और सुसान ई मार्कस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। जे एस WallTraC परियोजना (यूरोपीय आयोग के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (अनुदान समझौते के कोई मानता है। 263916) और 21 वीं सदी के लिए परियोजना बायोमास (इनोवेशन फाउंडेशन डेनमार्क; मामले में कोई .: 103408) SKK SET4Future परियोजना (डेनिश सामरिक अनुसंधान परिषद) को धन्यवाद है, जैव मूल्य सामरिक सामरिक अनुसंधान, प्रौद्योगिकी और नवाचार (अनुदान मामले में कोई .: 0603-00522B) के लिए डैनिश परिषद के लिए डेनिश परिषद द्वारा स्थापित किया गया है, और जटिल Polysaccharide सिस्टम (अनुदान के मामले की enzymatic गिरावट को समझना के लिए एक जीव विज्ञान-आधारित दृष्टिकोण कोई ।:। 107279) के वित्तपोषण के लिए यह पत्र केवल लेखकों के विचार को दर्शाता है कि यूरोपीय संघ के साथ साथ शामिल जानकारी का बनाया जा सकता है किसी भी उपयोग के लिए उत्तरदायी नहीं है।।
assay kit plates | Glycospot | customized assay kit plates | |
activation solution | Glycospot | for activating CPH substrates | |
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold | Pall Corporation | 5015 | spacer block |
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile | Millipore | MSHVN4510 | assay plate |
96-Well Microplates, Polypropylene | Greiner Bio-One | 651201 | collection plate after washing the substrates |
Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates | Thermo Scientific | 269620 | product plate |
Diaphragm pump MZ 2 NT | Vacuubrand | 732000 | vacuum pump used with the vacuum manifold |
Infors HT Ecotron | Infors HT | 4950132 (Buch & Holm) | horizontal shaker |
SpectraMax M5 | Molecular Devices | 10067-750 (VWR) | 96-well plate absorbance reader |
Vacuum manifold | Pall Corporation | 5017 | vacuum manifold |
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) | Megazyme | E-CELTR | cellulase [cel] |
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus) | Megazyme | E-BMACJ | mannanase [man] |
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) | Megazyme | E-LAMSE | β-glucanase [glu] |
endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger) | Megazyme | E-EGALN | galactanase [gal] |
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger) | Megazyme | E-XYAN4 | xylanase [xyl] |
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) | Megazyme | E-XEGP | xyloglucanase [xg] |
α-amylase (Bacillus licheniformis) | Megazyme | E-BLAAM | amylase [amy] |