Summary

Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos

Published: September 29, 2016
doi:

Summary

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Abstract

estudos de patch-clamp de gânglios da raiz dorsal (DRGs) neurônios têm aumentado nossa compreensão do sistema nervoso periférico. Actualmente, a maioria das gravações são realizadas sobre os neurónios DRG dissociados, que é uma preparação padrão para a maioria dos laboratórios. propriedades neuronais, no entanto, pode ser alterada por lesão axonal resultante da digestão com enzimas utilizadas na aquisição de neurónios dissociados. Além disso, as preparações neuronais dissociadas não pode representar plenamente o microambiente do DRG desde perda de contacto com células gliais por satélite que rodeiam os neurônios sensoriais primários é uma conseqüência inevitável desse método. Para superar as limitações no uso de neurônios DRG dissociados convencionais para gravações de patch clamp, neste relatório nós descrevemos um método para preparar DRGs intactas e realizar gravações patch clamp em neurônios sensoriais primários individuais ex vivo. Esta abordagem permite a preparação rápida e simples das DRGs intactos, imitando emvivo condições de manter os neurônios DRG relacionadas com as suas células gliais por satélite em volta e membrana basal. Além disso, o método evita a lesão axonal de manipulação e de digestão enzimática, tais como quando se dissociar DRGs. Esta preparação ex vivo pode, adicionalmente, ser utilizado para estudar a interacção entre os neurónios sensoriais primários e células gliais por satélite.

Introduction

Sensation é essencial para a sobrevivência e bem-estar de um organismo. A transmissão de estímulos é dependente das vias sensoriais a partir de terminações periféricas dos axónios de neurónios sensoriais primários. neurónios sensoriais primários, com a excepção de o núcleo mesencefálico do nervo trigeminal, situam-se nos gânglios da raiz dorsal e gânglios trigeminais (DRG). Eles servem como guardiões da informação sensorial 1. Na membrana perikarial, assim como nos terminais centrais e periféricos, os neurônios DRG expressam receptores e canais iônicos, tais como receptores de glutamato, os receptores alfa de TNF, receptor de potencial transitório canal cátion membro da subfamília V 1 (TRPV1), canais de sódio, etc. 2 -7. gravações de patch clamp da membrana perikarial permitir compreender alterações funcionais de muitos destes receptores e canais ao longo do neurónio.

A técnica de gravação de patch-clamp é uma ferramenta poderosa para stumorrendo as actividades dos canais ou receptores e um grande número de estudos foram realizados por aplicação da presente técnica em neurónios DRG 8-10. Na maioria dos estudos, o DRG é removido através do corte das radículas dorsais e nervo perto da coluna vertebral para o gânglio. Após a trituração, o gânglio é, então, colocado em enzimas digestivas que resultam na dissociação dos neurónios DRG, que podem então ser gravados imediatamente ou cultivadas durante vários dias antes da gravação. Infelizmente, a dissociação dos neurônios DRG envolve uma axotomia necessário perto do pericários. Uma vez dissociados e axotomia, os neurônios DRG sofrer alterações fenotípicas, bem como alterações na excitabilidade da membrana 11,12. A perda de contato entre o pericários de neurônios individuais e as células gliais por satélite que normalmente cercam deles é susceptível de contribuir para estas mudanças 13. O crosstalk entre os neurônios e células gliais por satélite é tanto essencial em condições fisiológicas e na adaptação às pathologcondições políticas, tais como as que podem causar dor intratável 14,15. Seria um desafio para estudar a interação entre os neurônios e células gliais por satélite usando uma preparação DRG dissociada.

DRGs intacto, por outro lado, fornecer aproximar das condições in vivo. Nos últimos anos, nosso laboratório, bem como alguns outros grupos, tem vindo a utilizar DRGs intactas de ratos adultos para investigar mudanças de neurônios sensoriais primários em diferentes condições associadas com dor crônica 3-5,11,15-17. Embora as técnicas utilizadas nestes estudos são relativamente estabelecido, uma descrição passo-a-passo não foi ainda publicada. No presente artigo, são apresentadas uma maneira conveniente e rápido para preparar DRGs intactas e sua utilização para gravações patch clamp.

Protocol

Declaração de Ética: Todos os procedimentos para a manutenção e utilização dos animais experimentais conformados com os regulamentos das comissões UCSF em Pesquisa Animal e foram realizadas em conformidade com as diretrizes dos regulamentos do NIH sobre o uso e cuidados (Publicação 85 animais – 23, revista em 1996 ). O Comité Cuidados e Uso de Animais aprovou os Institucional UCSF protocolos utilizados neste estudo. 1. Preparação de Instrumentos, Soluções e pratos P…

Representative Results

A Figura 1 mostra o processo de preparação de DRG intactos para gravação de remendo. A Figura 1A mostra a orientação e localização dos gânglios após laminectomia. Figura 1B mostra DRGs L3, L4 e L5, com as raízes nervosas associadas após a remoção da medula espinhal. Em seguida, L4 e 5 DRGs são cuidadosamente dissecado e libertado a partir das vértebras. Em seguida, o perineuro, uma membrana transparente em torno do DRG, ?…

Discussion

Nós relatamos um método para preparar DRGs inteiros para estudos patch clamp. Há vários elementos-chave para a preparação de um espécime ideais. Em primeiro lugar, é importante para dissecar os DRGs com raízes dorsais anexados. Depois disso, o perineuro necessitam de ser cuidadosamente removidas, evitando danos para os neurónios. Finalmente, para expor os neurónios e as suas células gliais circundantes por satélite, que é necessário para digerir o tecido conjuntivo restante. DRGs intactas a partir de rato…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.

Materials

Pentobarbital sodium vortech Pharmaceuticals
syringe BD 309659 1 ml, 5 ml.
scalpel BD size: 15
Mayo straight scissor Fine Science Tools 14010-15
Mayo curved scissor Fine Science Tools 14011-15
Rongeur Fine Science Tools 16021-14
Adson toothed forceps Fine Science Tools 11027-12
Iris Scissor Fine Science Tools 14084-08
Noyes spring scissor Fine Science Tools 15124-12
Bone scissors Fine Science Tools 16044-10 Special for cutting the bones. 
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 Fine Science Tools 11252-30 These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased.
periosteal elevator Sklar 97-0530
Dissection microscope WILD
Transfer pipette Fisher brand 13-711-5AM
Petri dish (10 cm) Pyrex Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps
Collagenase (Liberase TM) Roche 05-401-119-001 dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw.
filter Thermo scientific 7232520 Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog.
Glass pipette Sutter BF150-110-7.5
Anchor Havard apparatus 64-0250 stabilize the DRG to avoid drift.
Peristaltic pump WPI
Pipette puller Sutter P97
Amplifier Molecular devices Axopatch 200B
Digitizer Molecular devices 1440D
Microscope NIKON FN600
Micro-manipulator Sutter MPC200
microinjection dispense system General Valve Picrospitzer II fast drug application system
Carbogen (95% O2, 5% CO2) Local Medical Gas supplier

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Cite This Article
Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. J. Vis. Exp. (115), e54287, doi:10.3791/54287 (2016).

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