Abstract
Los estudios de pinzamiento zonal de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) neuronas han aumentado nuestra comprensión del sistema nervioso periférico. Actualmente, la mayoría de las grabaciones se llevan a cabo en las neuronas DRG disociadas, que es una preparación estándar para la mayoría de los laboratorios. propiedades neuronales, sin embargo, pueden ser alterados por lesión axonal resultante de la digestión de la enzima utilizada en la adquisición de las neuronas disociadas. Además, las preparaciones de neuronas disociadas no puede representar completamente el microambiente de la DRG ya que la pérdida de contacto con las células gliales satélite que rodean a las neuronas sensoriales primarias es una consecuencia inevitable de este método. Para superar las limitaciones en el uso de las neuronas DRG disociadas convencionales para las grabaciones de patch clamp, en este informe se describe un método para preparar GRD intactas y realizar grabaciones de patch clamp en las neuronas sensoriales primarias individuales ex vivo. Este enfoque permite la preparación rápida y directa de los GRD intactas, imitando enVivo condiciones de mantenimiento de las neuronas DRG asociados a sus células capsulares circundantes y la membrana basal. Además, el método evita la lesión axonal de la manipulación y la digestión enzimática, tales como cuando disociar GRD. Esta preparación ex vivo, además, puede ser usado para estudiar la interacción entre las neuronas sensoriales primarias y células gliales satélite.
Introduction
La sensación es esencial para la supervivencia y el bienestar de un organismo. La transmisión de los estímulos depende de las vías sensoriales a partir de las terminaciones periféricas de los axones de las neuronas sensoriales primarias. neuronas sensoriales primarias, con la excepción del núcleo mesencefálico del trigémino, se encuentran en los ganglios de la raíz dorsal y ganglios del trigémino (GRD). Sirven como guardianes de la información sensorial 1. En la membrana perikarial, al igual que en los terminales centrales y periféricas, neuronas DRG expresan receptores y canales iónicos, tales como los receptores de glutamato, receptores de alfa TNF, receptor de potencial transitorio canal catiónico miembro de la subfamilia V 1 (TRPV1), los canales de sodio, etc. 2 -7. patch clamp grabaciones de la membrana perikarial permiten la comprensión de los cambios funcionales de muchos de estos receptores y canales a lo largo de la neurona.
La técnica de grabación de patch clamp es una poderosa herramienta para Stumorir las actividades de los canales o receptores y un gran número de estudios se han llevado a cabo mediante la aplicación de esta técnica en las neuronas DRG 8-10. En la mayoría de los estudios de los GRD se elimina mediante la reducción de las raicillas dorsal y los nervios cerca de la médula al ganglio. Después de picar, el ganglio se coloca entonces en las enzimas digestivas que resultan en la disociación de las neuronas DRG, que pueden entonces ser registrados inmediatamente o se cultivaron durante varios días antes de la grabación. Por desgracia, la disociación de las neuronas DRG implica una axotomía necesario cerca del pericarion. Una vez disociado y axotomizadas, neuronas DRG experimentan cambios fenotípicos, así como cambios en la excitabilidad de la membrana 11,12. La pérdida de contacto entre el pericarion de las neuronas individuales y las células gliales por satélite que normalmente rodean ellos es probable que contribuya a estos cambios 13. La diafonía entre las neuronas y las células gliales satélite es tanto esencial en condiciones fisiológicas y en la adaptación a pathological condiciones tales como las que conducen a dolor intratable 14,15. Sería un reto para estudiar la interacción entre las neuronas y las células gliales satélite que utilizan una preparación DRG disociado.
GRD intacto, por otra parte, proporcionan más cerca de las condiciones in vivo. En los últimos años, nuestro laboratorio, así como algunos otros grupos, ha estado utilizando GRD intactos de ratas adultas para investigar los cambios de las neuronas sensoriales primarias en diferentes condiciones asociadas con dolor crónico 3-5,11,15-17. Aunque las técnicas utilizadas en estos estudios se establecen tanto, una descripción paso a paso aún no ha sido publicada. En el presente manuscrito, se describe una forma cómoda y rápida de preparar GRD intactas y su uso para grabaciones de patch clamp.
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Protocol
Ética Declaración: Todos los procedimientos para el mantenimiento y uso de los animales de experimentación se ajustaba a las normas de los Comités de la UCSF en investigaciones en animales y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la normativa NIH sobre el uso de animales y el cuidado (Publicación 85 - 23, revisada en 1996 ). El Comité para el Cuidado y Uso de Animales institucional UCSF aprobó los protocolos utilizados en este estudio.
1. Preparación de Instrumentos, Soluciones y Platos
- Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF).
- Preparar 500 ml de 10x solución de bajo de cationes y 500 ml de solución de bicarbonato de 10x (ver Tabla 1 y 2 para la preparación de la solución). Almacenar a 4 ° C y su uso dentro de un mes.
- Preparar 600 ml de ACSF fresca mezclando 60 ml de 10x solución de bajo cationes con 60 ml de solución de bicarbonato, y luego añadir 480 ml de agua desionizada para alcanzar un volumen final de 600 ml. Burbuja la LCRa con carbógeno(5% O 2 y 95% de CO 2) durante al menos 10 min antes de su uso.
- Tire parche pipeta del capilar de vidrio.
- Coloque capilar de vidrio de paredes delgadas en un extractor de pipeta para preparar las pipetas de registro.
Nota: En nuestro laboratorio, los siguientes parámetros de ajuste del extractor se utilizan para conseguir la forma de pipeta ideal: a calor (510), la velocidad (32). La forma de pipeta ideal para la grabación intacta DRG debe tener una pendiente gradual delgado con un ángulo de cono baja, y esto puede lograrse mejor por ensayo y error. - Asegúrese de que la resistencia de la pipeta es de 3-5 mO cuando se llena de soluciones internas (véase la Tabla 3 para la preparación de la solución). Por favor, consulte la Guía Axon para el método detallado de la medición de la resistencia de la pipeta 18.
- Coloque capilar de vidrio de paredes delgadas en un extractor de pipeta para preparar las pipetas de registro.
- Añadir 1 mg de colagenasa a 400 l de LCRa, para dar una concentración final de 13 unidades / ml. A continuación, llenar cada pipeta de vidrio con unos 20 l de solución de colagenasa. Almacenarlas pipetas llenas en un congelador C -20 o y utilizarlos dentro de tres semanas.
- Preparar 200 ml de ACSF frío (alrededor de 4 ° C). Para enfriar el LCRa rápidamente colocarlo en un vaso de precipitados, sellar con una envoltura de plástico y colocar en un congelador a -20 ° durante aproximadamente 20 minutos hasta que empiece a congelarse. Colocar el vaso en un baño de hielo y burbujas con Carbógeno durante 10 minutos. Burbuja del 400 ml de ACSF con Carbógeno restante a TA.
- Mientras que el LCRa se está enfriando, cortar el extremo de una pipeta de transferencia de plástico desechable para agrandar la abertura a un diámetro de 5 mm (esto se utiliza para transferir el DRG). Recoge los siguientes instrumentos quirúrgicos: escalpelo (# 15), Mayo rectas y curvas tijeras, bien 2 mm punta gubia, pinzas de Adson (dentada), iris tijeras, tijeras de primavera y dos pinzas finas. Verter la LCRa fría oxigenada en placas de petri de vidrio 3 (Diámetro exterior: 10 cm).
2. Disección DRG
- Anestesiar a una rata (200-220 g) con pe sodiontobarbital (100 mg / kg, ip) y confirme que el nivel de anestesia es adecuada por parte de las pruebas de reflejos pedal y reflejo del parpadeo del ojo.
- Después de verificar que la rata se anestesia, afeitar el área lumbar y una incisión en la piel y el tejido subcutáneo a lo largo de la línea media. Separar los músculos paravertebrales de las apófisis espinosas a nivel L1-S2 utilizando un elevador perióstico fino.
- Use las tijeras curvadas para cortar las apófisis espinosas de L1 a S2. Use tijeras de Mayo rectas para hacer cortes transversales en la columna vertebral, expuesta a aproximadamente L1 y S1 y eliminar este segmento de la columna vertebral, en bloque y rápidamente sumergirlo en ACSF fría (preparado en el paso 1.5) durante 2-3 min. Después de la eliminación de los GRD lumbar, la eutanasia se lleva a cabo por toracotomía bilateral, mientras que la rata es todavía bajo anestesia con pentobarbital de profundidad.
- Enjuague de la sangre de la columna vertebral eliminado y el tejido adjunto y transferir a una placa de Petri con LCRa frío. Tse una gubia fina para quitar las láminas. Cortar la duramadre a lo largo de la línea media con micro tijeras para exponer la médula espinal. Levante con cuidado la médula espinal, y cortar las raíces de los nervios en su punto de entrada en la médula espinal usando tijeras iris, a continuación, retire la médula espinal.
- Transferir la vértebra restante con GRD a la segunda placa de Petri llena de ACSF frío. Identificar la L4 y L5 GRD en función de su posición relativa a los procesos transversales y nervio ciático.
Nota: El mantenimiento del nervio ciático intacta ayudará a identificar L4 y L5 DRG (el nervio ciático se origina en los nervios espinales L4-6). - El uso de fórceps Dumont y las tijeras Noyes para liberar a los GRD de los tejidos conectivos circundantes. Mantenga la raíz del nervio y nervio espinal unido a los GRD.
- Con la pipeta de transferencia para mover los GRD en la tercera placa de Petri para su posterior disección.
- Bajo el microscopio de disección, retirar con cuidado tanto como sea posible de la TH rodea epineuroe DRG.
- Use las tijeras de primavera Noyes para cortar una abertura en la parte dorsal y ventral raíces se unen a la GRD y separan la raíz ventral de la DRG. Utilice Dumont # 5 fórceps con puntas romas para mantener el epineuro, y utilizar otros pinzas finas para hacer rodar la DRG del epineuro.
- Continuar para eliminar la mayor cantidad posible de epineuro adjunta a los GRD utilizando las pinzas finas.
Nota: Un DRG bien diseccionado-es importante para obtener una buena digestión en el siguiente paso.
3. La digestión DRG
- La transferencia de la DRG a la cámara de grabación. Asegúrese de que el lado de DRG donde las raíces nerviosas se originan quede hacia abajo.
Nota: En este modo, la mayoría de las neuronas son accesibles. - Utilice un ancla para estabilizar la DRG. Perfuse DRG con oxigenada ACSF a una tasa de 0,5 ml / min a través de tubos de plástico conectado con una bomba peristáltica, que se coloca sobre una mesa al lado del equipo de grabación.
- Esperar 30 min para permitir que las células se recuperaran. Evaluar la calidad de los GRD en virtud de infrarrojos contraste interfaz diferencial (IR-DIC) óptica a 40 aumentos objetivo a través de una cámara CCD.
Nota: Buenas GRD generalmente contiene muchos redonda, bien contrastadas, las neuronas rodeadas por las células gliales de satélite en su superficie. - Digerir una pequeña área de la superficie de la DRG.
Nota: Las pipetas de parche de vidrio se colocan en soportes para pipetas, que son pequeñas acoplamientos que permiten que la tubería que se debe adjuntar a la pipeta de vidrio con un sello hermético.- Individualmente conectar dos jeringas de 1 ml a los soportes para pipetas a través de dos piezas de tubo de goma de diámetro pequeño. Ponga una pipeta de vidrio lleno de colagenasa en uno de los soportes para pipetas y una pipeta de vidrio vacía en el otro.
- Utilice el micromanipulador para posicionar las pipetas justo encima de la DRG. A continuación, bajo un aumento de microscopio, chocan las puntas de dos pipetas de uno contra el otro con suavidad para agrandar las aberturas de las puntas de pipeta (idealmente un diámetro de 5-10 m).
- Mover la pipeta llena de enzima cerca de la superficie de DRG y brevemente aplicar presión positiva a la pipeta que contiene colagenasa a través del tubo de conexión y el soporte de la jeringa desplazando el émbolo alrededor de 0,5 ml.
Nota: Bajo la presión, el flujo de la enzima de la pipeta se agrandar ligeramente el espacio entre las neuronas DRG, que pueden servir como señal para la aplicación de la enzima. - Después de 10 a 15 min, cuando se observa escombros del epineurio restante, aplicar presión negativa suave a la pipeta de vacío para aspirar los escombros.
Nota: En este modo, las neuronas y las células gliales circundantes satélite serán claramente expuestos y listo para la grabación de parche. - Desechar las dos pipetas en el contenedor de objetos punzantes.
4. Patch Clamp Grabaciones
- Coloque la solución de electrodos (véase la Tabla 3) en hielo para evitar la degradación. Llenar la pipeta de vidrio con parchesolución filtrada intracelular (filtro de jeringa, tamaño de poro: 0,2 micras) y colocar la pipeta en el soporte de cabezal de la platina de la pipeta. Aplicar una presión positiva suave para la pipeta a través de una jeringa de 5 ml mediante el desplazamiento del émbolo de aproximadamente 1 ml antes de bajar la pipeta en la solución de baño.
Nota: Esto evita que la pipeta se bloquee. - Seleccione el modo de "V-clamp" girando el botón de modo en el amplificador, a continuación, abra "prueba de membrana" de la interfaz en el software. Mover la pipeta cerca de la neurona diana bajo inspección microscopio.
Nota: En la preparación DRG intacto, una fina capa de células gliales satélite encapsula cada neurona. - Use una presión positiva de la pipeta para atravesar la capa de células gliales satélite hasta un ensanchamiento brusco de espacio entre la neurona y la capa de los alrededores de las células gliales de satélite se observa. Mantener en movimiento la pipeta hacia la neurona hasta que un "hoyuelo" se observa en la neurona.
Nota: En comparación congrabaciones de las neuronas disociadas, la presión positiva tiene que ser un poco más grande, lo que ayuda a penetrar en la capa de células capsulares y aumentar las posibilidades de éxito de parches. - Reducir la presión positiva. A continuación, obtener un sellado giga ohmios con una suave succión.
Nota: Con este método, la tasa de éxito de la grabación es de al menos 70%. - Obtener configuración de células enteras de grabación como se ha descrito previamente 19.
- En pocas palabras, penetrar la membrana celular de las neuronas a través de una corta pero fuerte succión. Como alternativa, utilice la función "zapping" en el amplificador mientras se aplica succión.
- Una vez que se establece un modo de células enteras, compensar la capacitancia de célula entera y la resistencia en serie (Rs) girando las perillas de capacitancia y la resistencia de compensación en el amplificador.
Nota: Rs es normalmente 5-20 mO. - Abandonar la celda si Rs es inicialmente mayor que 30 mO; o RS cambia en más de 20% durante la grabación. tambiénmedir el potencial de membrana en reposo; abandonar una celda si el potencial de membrana en reposo es más de -50 mV.
- Cierre la ventana "Prueba de membrana". Elegir el modo "I-pinza normal" girando el botón de modo en el amplificador.
- Haga clic en "protocolo abierto" en el software, seleccionar y cargar el protocolo para medir reobase. Haga clic en "Grabar" para iniciar la grabación. Medir la resistencia de entrada y reobase para examinar la excitabilidad neuronal mediante la inyección de una serie graduada de despolarizante corrientes en pasos de 100 pA.
- Haga clic en "protocolo abierto" de nuevo y seleccione el protocolo para la medición del umbral de la membrana. A 500 ms despolarizantes actual rampa (2.000 pA / s) se inyectarán a la neurona.
- Utilice la adquisición de datos y el software de análisis (por ejemplo Clampfit) para analizar las huellas registradas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice el software para calcular la resistencia de entrada (Rin) sobre la base de la rela-IV en estado estacionarioionship durante las corrientes de hiperpolarización entregados. Mover el cursor para medir el valor de reobase y la membrana de umbral.
Nota: La amplitud de la corriente requerida para inducir la AP se define como la reobase, y la tensión más baja para la inducción de AP se define como umbral de membrana.
- Registrar las corrientes inducida por el ligando.
- Llenar una pipeta con los agonistas específicos.
Nota: En el presente informe, hemos utilizado 100 M y 100 M de glutamato AITC para inducir las corrientes mediadas por los receptores de glutamato y los receptores de TRPA1 respectivamente. - Compruebe la pipeta para asegurarse de que no haya burbujas de aire en su interior. Coloque la pipeta en el soporte de la pipeta. Conectar el soporte de pipeta con un tubo conectado a un sistema de distribución de drogas.
- Utilice el manipulador para mover la pipeta dentro de 50 micras de la neurona. Ajuste la presión del sistema de dispensación de medicamentos a 1 psi y la duración a 1 seg. Cambiar el modo de grabación de fijación de voltaje, y la abrazadera a -70 mV. Brevemente aplicar la presión a través del sistema de dispensación de medicamentos para grabar una corriente inducida por fármacos.
- Llenar una pipeta con los agonistas específicos.
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Representative Results
La Figura 1 muestra el proceso de preparación de DRG intacta para la grabación de parche. La Figura 1A muestra la exposición y la ubicación de los ganglios después de la laminectomía. Figure1B muestra GRD L3, L4 y L5 con las raíces de los nervios unidos después de la eliminación de la médula espinal. A continuación, L4 y 5 GRD se diseccionaron cuidadosamente y liberados de las vértebras. A continuación, el epineurio, una membrana transparente que rodea el DRG, se retira (flecha amarilla, la Figura 1D). El mejor lugar para separar el epineurio es a través del sitio en el que las raíces dorsales y ventrales se unen en el DRG, como se indica por la flecha negro en la Figura 1D. Después de despegar la epineurio, la raíz ventral se retira y desecha, dejando las raicillas dorsal , nervio espinal y DRG, como se muestra en la Figura 1E. La digestión con colagenasa elimina el epineurio residual, la exposición de las neuronas y las células satélite tsombrero de los rodean (Figura 1F).
Después de completar la preparación DRG, la excitabilidad de las neuronas DRG pequeño diámetro se examinó midiendo el umbral reobase y la membrana. Como se muestra en la Figura 2A, la reobase es 260 pA. La Figura 2B muestra el umbral de la membrana se mide con este método. Con el aumento de la corriente, la membrana se despolariza de forma continua hasta que un AP es evocado. En este ejemplo, el umbral de membrana (el potencial al que se evoca la AP) es -11,9 mV. Por lo tanto, mediante el mantenimiento de la relación entre las neuronas y las células gliales de satélite, nuestra preparación está más cerca de la situación in vivo. En base a los resultados, la reobase grabado de pequeñas neuronas DRG es de alrededor de 300 Pa, y la resistencia de entrada es 451,3 ± 27,3 mO. Ambos son mayores en comparación con los medidos desde las neuronas disociadas (alrededor de 150 Pa y 635 mO), lo que sugiereque la disociación aumenta la excitabilidad de las neuronas DRG 11.
Con esta preparación, también medimos las corrientes hacia el interior inducida por el glutamato y el isotiocianato de alilo (AITC), que son agonistas para receptores de glutamato y el potencial receptor transitorio miembro de canal catiónico A1 (TRPA1) respectivamente. La amplitud de corrientes hacia el interior inducida por estos ligandos reflejará el número de los receptores distribuidos en las neuronas. La Figura 3A muestra una corriente hacia el interior en una pequeña neurona DRG diámetro inducida por una aplicación de hojaldre 1 seg de glutamato (1 mM). El glutamato induce una corriente hacia el interior (198 pA), que puede ser en gran parte bloqueada por co-aplicación de la APV antagonista del receptor de NMDA y el antagonista del receptor AMPA / kainato CNQX (datos no presentados), lo que confirma la corriente está mediada por los receptores de glutamato en el DRG neuronas. Estos datos establecido que existen receptores de glutamato funcionales en las neuronas DRG. el neUron se ilustra en la Figura 3B mostró corrientes hacia el interior (260 Pa) inducidos por la aplicación de hojaldre 1 seg de isotiocianato de alilo (AITC, 100 M), un agonista selectivo TRPA1. La corriente de entrada estaba bloqueada por el antagonista selectivo TRPA1 10 HC M 030031 (datos no mostrados), lo que confirma las corrientes fue mediada por los receptores TRPA1 y establece la presencia de receptores en las neuronas DRG TRPA1.
Figura 1: Preparación de los GRD intactos (a) la exposición de la médula espinal después de la laminectomía y la segmentación de los GRD.. Las flechas de derecha a izquierda indican L3-5 GRD respectivamente. Barra de escala = 1 cm. (B) La exposición de L3, L4, y L5 GRD y las raíces de los nervios unidos después de la eliminación de la médula espinal. Las flechas indican los GRD L3, L4, L5 y de derecha a izquierda. Barra de escala = 1 cm. (C) IntaGRD ct con raíces nerviosas adjuntos después de haber sido diseccionado de la médula espinal. Las flechas indican L4 y L5 GRD de derecha a izquierda. Barra de escala = 1 cm. (D) DRG intacto con epineuro adjunto. En esta imagen, el epineuro está intacto, y la flecha amarilla muestra el epineuro semitransparente en poder de unas pinzas Dumont. La flecha de color negro indica el cruce formado por la raíz dorsal y ventral de la raíz, que sirve como un buen punto de partida para pelar la epineuro. Barra de escala = 1 mm. (E) El mismo DRG con la raíz dorsal adjunta después de la epineuro y la raíz ventral se han eliminado. Barra de escala = 1 mm. Imágenes de microscopio (F) de infrarrojos de DRG después de la digestión con colagenasa. neuronas pequeñas y medianas son visibles. Un células capsulares (flecha amarilla) es visible que rodea una neurona (asterisco). La flecha roja a la pipeta. Barra de escala = 10 micras. (G) la configuración del equipo de grabación. Las flechas negras indican THsoportes para pipetas e. El de la izquierda sostiene la pipeta llena de drogas, y la pipeta de grabación está a la derecha. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. La medición de la excitabilidad neuronal en Current Clamp Mode (A) Reobase se midió mediante la inyección de una serie de corrientes en la neurona DRG (panel superior). La intensidad de corriente más bajo, lo que puede inducir un potencial de acción, se define como reobase, como se indica por la flecha en el panel inferior. La reobase para esta neurona es 300 pA. (B). El umbral de la membrana se midió mediante la inyección de una corriente de rampa. El potencial, cuando se evoca un potencial de acción, se define como umbral de membrana, como marcado por la línea discontinua en el panel superior.El umbral de membrana para esta neurona es -11.9 mV. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Corrientes inducida por el ligando en los pequeños DRG neuronas Corrientes inducidas por la aplicación bocanada de glutamato (1 mM) o isotiocianato de alilo (agonista TRPA1, AITC, 100 mM) durante 1 segundo.. Ambos agonistas inducen corrientes hacia el interior, lo que sugiere la presencia de los receptores de glutamato y receptores TRPA1 en pequeñas neuronas DRG. Aplicación glutamato induce una corriente hacia el interior de 198 pA (A), y AITC induce una corriente hacia el interior de 260 pA (B). Las neuronas se sujetan a -70 mV. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ P>
| 2 litros de 10x bajo catiónico | |||
| Concentración final (mM) | Componente | MW | Peso (g) |
| 3 | KCl | 74.6 | |
| 11 | Glucosa | 180.2 | |
| 123 | NaCl | 58.4 | |
| 1.25 | NaH 2 PO 4 * H2O | 138 | |
| 1 | MgCl 2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| 2 | CaCl 2 * 2H 2 O | 147 | |
tabla 1
| 1 litro de bicarbonato de 10x | |||
| Concentración final (mM) | Componente | MW | Peso (g) |
| 26 | NaHCO3 | 84.01 | 21.84 |
Tabla 2
| 100 ml de solución intracelular | |||
| Concentración (mM) | Componente | MW | gramo |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | KCl | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCl 2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| Notas: ajustar el pH a 7,4 con KOH, y la osmolaridad de 260 a 280 mOsm con sacarosa y agua destilada. Añadir MgATP 2 mM, 0,5 mM Na 2 GTP y el filtro antes de su uso inmediato. | |||
Tabla 3
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Discussion
Se presenta un método para preparar GRD enteros para los estudios de pinzamiento zonal. Hay varios elementos clave para la preparación de un espécimen ideales. En primer lugar, es importante para diseccionar los GRD con raíces dorsales conectados. Después de eso, el epineurio necesita ser eliminado cuidadosamente y evitar daños en las neuronas. Por último, para exponer las neuronas y sus células gliales circundantes satélite, es necesario para digerir el tejido conectivo restante. GRD intactos de ratas adultas preparados con el método descrito aquí serán mantener una buena viabilidad durante 6 a 8 horas y puede ser registrado de forma estable durante ese período. Se pueden utilizar para muchos estudios diferentes de los GRD incluyendo patch clamp grabaciones en las neuronas o células gliales satélite, o respuestas evocadas de neuronas DRG.
Durante el procedimiento de disección, es importante para diseccionar rápidamente el DRG y mantenerlo a una temperatura baja (4 ° C) para ralentizar el metabolismo neuronal y por lo tanto mantiene su viabilidad. Durante tque la disección de los GRD, hay que evitar ampliar el dorsal o nervios espinales entrar en los GRD. Otro paso clave en esta preparación es la eliminación de la epineurio rodea el DRG. Desde el epineuro es difícil de penetrar, cualquier epineuro restante en el DRG evitará que las pipetas de parche llegue a las neuronas. Aplicación de la colagenasa es un paso importante para el éxito de los preparativos. La colagenasa digerirá el epineurio restante y limpiar la superficie de las células al mismo tiempo, ambos de los cuales son críticos para la aplicación de parches éxito. Para evitar un exceso de la digestión del tejido, tres factores deben tenerse en cuenta. En primer lugar, la colagenasa viene en varias formas diferentes; ver la Tabla de Materiales para nuestra recomendación, la que se utiliza actualmente es potente pero suave, evitando así el exceso de digestión. En segundo lugar, la enzima debe ser entregado a una ligera presión para evitar la dispersión de la enzima más allá del área de grabación. Hemos encontrado que la presión producida a partir de la aplicación de 0,5 ml de unair fuera de una jeringa de 1 ml de es suficiente. En tercer lugar, el mejor rango de concentración para la colagenasa es de 10-13 unidades / ml. Concentraciones más altas pueden conducir a la digestión sobre-y una degradación más rápida de los tejidos, mientras que las concentraciones más bajas implica un tiempo de digestión innecesariamente largo. En nuestra experiencia, una concentración de 13 unidades / ml y un tiempo de digestión de alrededor de 15 minutos produce los mejores resultados. Después de aplicar la enzima epineuro restante que rodea el DRG debe aflojarse, y puede ser disipado con una suave succión. La colagenasa es sensible a repetir ciclos de congelación-descongelación, por lo tanto, una vez diluida la solución de enzima debe ser dividida en partes alícuotas y se utiliza dentro de 3 semanas.
Zhang y sus colegas fueron los primeros en describir un método para la grabación de patch clamp de GRD intactas. Las ratas se utilizan, sin embargo, eran muy jóvenes (10-15 días después del parto) 20, que tiene la ventaja de que los GRD son más fáciles de preparar dado que tienen un epi más delgadaneurium y tienen un aumento de la viabilidad. GRD de ratas neonatales, sin embargo, tienen la desventaja de que la expresión de proteínas y canales iónicos como TRPV1 y NaV1.8 difieren de las de las ratas adultas 21,22. Además, los estudios de comportamiento y farmacológicos se realizan normalmente en ratas adultas. Así, el método de registro detallado aquí permite hacer una correlación entre la electrofisiología y comportamiento en los animales adultos. El uso de intacta ganglios de raíz dorsal como una preparación para realizar grabaciones de patch clamp ex vivo ha aumentado recientemente 15-17,23,24, y algunos estudios han utilizado en las grabaciones in vivo 25. La mayoría de las grabaciones ex vivo exponga las neuronas DRG por incubación de toda la DRG en cóctel de enzimas por alrededor de 30 a 60 min. Mientras que este método produce más neuronas, que tiene un riesgo de sobre-digestión de las neuronas en las capas superficiales. Nuestro método minimiza la posibilidad de sobre-digestión mediante el uso de la inspección visual para controlar la extienda de campaña de la digestión, un método también utilizado por Ma et al para las grabaciones en vivo 25.
En comparación con las neuronas de DRG disociadas, una de las ventajas de la preparación DRG intacta proviene de la preservación de las neuronas y células gliales satélite (Figura 1). Este no es el caso en las preparaciones convencionales que utiliza las neuronas DRG disociadas. Satélite células gliales forma una barrera que rodea las neuronas DRG individuales, y su presencia es esencial para mantener el entorno fisiológico de estas neuronas 13. Como se observó en los resultados de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas preparadas por este medio difieren de los obtenidos por los estudios que utilizan células disociadas.
Una de las direcciones futuras de mayor interés para esta preparación es investigar la diafonía entre las neuronas DRG y células gliales satélite. Después de la lesión del nervio, por ejemplo, células gliales satélite han demostrado to someterse a cambios plásticos, que están estrechamente relacionados con el comportamiento del dolor que sobreviene 13-15,26. La preservación de las células gliales satélite en los GRD intactos, nos permitirá determinar si los receptores del transmisor como el receptor de glutamato, o receptores de ATP están presentes en las células gliales satélite y cómo responden a los cambios en la actividad neuronal. Por parches células gliales satélite y la estimulación de la neurona de forma simultánea, las células gliales por satélite puede actuar como un sensor biológico y mostrar si existe la liberación del transmisor de las neuronas cercanas. Además, la preparación DRG intacta mantiene tanto aferente y eferente raíces nerviosas. Esto amplía en gran medida el ámbito de aplicación experimental mediante la adición de la posibilidad de la estimulación de los axones entrar o salir de las neuronas con electrodos de succión, lo que sería una mejor imitador de la situación in vivo.
Hay algunas limitaciones a la preparación actual. La existencia de la barrera formada por gli satélitelas células de Al, hace que sea más difícil para las neuronas de parche y uno debe ser consciente de que puede limitar la concentración de drogas que llegan a las neuronas. Por lo tanto, para obtener acceso a la neurona en nuestra preparación es importante para mantener la pipeta bajo presión positiva para ayudar a penetrar satélite capa de células gliales. Otra limitación es que las raíces dorsales y los nervios espinales tienen que ser cortados con el fin de diseccionar el GRD. Por lo tanto, es imposible que salir del axón totalmente intacto. Sin embargo, la presencia del axón restante se debe considerar, como los axones periféricos o centrales no pueden ser anclada en el mismo voltaje que el soma, lo que podría causar error potencial grabación o interferencia cuando se lleva a cabo de fijación de voltaje. También con el fin de obtener una buena exposición de las neuronas, la digestión suave con colagenasa es necesario y aunque esto puede ser controlado con la experiencia, es imposible proteger completamente las neuronas de la exposición a la enzima de digestión. En comparación con d convencionalneuronas issociated DRG, sin embargo, los GRD enteros son más rápidos de preparar (alrededor de 30 min), se pueden utilizar en muchas aplicaciones y se asemeja mucho a las condiciones in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
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