Abstract
후근 신경절에서 패치 클램프 연구 (DRGs) 신경 세포는 말초 신경계에 대한 우리의 이해를 증가하고있다. 현재 녹음의 대부분은 대부분의 실험실에 대한 표준 준비입니다 해리 DRG 뉴런에 실시하고 있습니다. 신경 특성 그러나, 해리 뉴런 취득에 사용 된 효소 분해로 인한 축삭 손상에 의해 변경 될 수있다. 기본 감각 뉴런을 둘러싸 위성 아교 세포와 접촉의 손실이 방법의 피할 수없는 결과이기 때문에 또한, 해리 신경 준비는 완벽하게 DRG의 미세 환경을 대표 할 수 없습니다. 이 보고서에서, 패치 클램프 녹음을 위해 기존의 해리 DRG 뉴런을 사용하여 한계를 극복하기 위해 우리는 그대로 DRGs를 준비하고 각각의 기본 감각 뉴런 생체에 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식의 흉내 그대로 DRGs의 빠르고 간단한 준비를 허용그 주변 위성 신경교 세포 기저막과 연관된 DRG 뉴런 유지하여 생체 내 조건. 또한,이 방법은 조작에서 축삭 손상을 방지하며 DRGs 해리 때와 같이 소화 효소. 이 생체 제제는 별도로 차 감각 뉴런과 위성 신경교 세포 사이의 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다.
Introduction
감각은 유기체의 생존과 복지에 필수적이다. 자극의 전달은 일차 감각 신경 세포의 축삭 외주 말단부터 감각 경로에 의존한다. 차 감각 뉴런, 삼차 신경의 중뇌 핵 제외한 삼차 신경절 및 후근 신경절 (DRGs)에 위치하고있다. 그들은 감각 정보 1의 게이트 키퍼 역할을합니다. perikarial 막에서 바로 중추 및 말초 말단에 같은 DRG 뉴런 등 글루타메이트 수용체, TNF 알파 수용체 일과성 수용체 전위 양이온 채널 아과의 V 부재 (1) (TRPV1), 나트륨 채널이 같은 수용체 이온 채널을 표현할 -7. perikarial 막 패치 클램프 녹음은 신경 세포에 걸쳐 이들 수용체 및 채널의 많은 기능 변화를 이해 할 수 있습니다.
패치 클램프 녹음 기술은 스투위한 강력한 도구입니다채널 또는 수용체 연구 다수의 활동 죽는 것은 DRG 뉴런 8-10에이 기술을 적용함으로써 수행되었다. 대부분의 연구에서 DRG는 지느러미 작은 뿌리와 신경절에 척추 신경 주변을 절단하여 제거한다. 닦지 후 신경절 후 다음 기록 이전에 수일 동안 배양 즉시 또는 기록 될 수있다 DRG 뉴런의 해리 될 소화 효소에 배치된다. 불행하게도, DRG 뉴런의 분리는 perikarya에 가까운 필요한 axotomy을 포함한다. 일단 해리와 axotomized, DRG 뉴런은 막 흥분 11, 12에서 표현형의 변화뿐만 아니라 변화를 겪는다. 일반적으로 그들을 둘러싸는 개별 뉴런 perikarya 및 위성 신경교 세포 사이의 접촉의 감소는 이러한 변경 13에 기여할 것으로 예상된다. 뉴런과 위성 신경교 세포 사이의 크로스 토크는 생리 학적 조건에서 필수적이고 patholog 적응 모두 인같은 난치성 통증 14, 15로 이어지는 것과 같은 iCal의 조건. 해리 DRG 제제를 사용하여 신경 교세포와 위성 사이의 상호 작용을 연구하기가 어려울 것이다.
그대로 DRGs, 다른 한편으로는, 생체 상태에 가깝게 제공한다. 지난 몇 년 동안, 우리의 실험뿐만 아니라 다른 그룹은 만성 통증 3-5,11,15-17와 관련된 다양한 조건의 차 감각 뉴런의 변화를 조사하기 위해 성인 쥐에서 그대로 DRGs를 사용하고있다. 이러한 연구에서 사용 된 기술은 어느 정도 성립하지만, 단계별 설명은 아직 출판되지 않았다. 본 원고에서는 그대로 DRGs 및 패치 클램프 녹음에 대한 사용을 준비하는 편리하고 빠른 방법을 설명합니다.
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Protocol
윤리 정책 : 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 모든 절차는 동물 연구에서 UCSF위원회의 규정을 따른다 동물 사용 및 관리 (출판 (85)에 NIH 규정의 지침에 따라 수행되었다 - 23 1996 개정 ). UCSF 기관 동물 관리 및 사용위원회는이 연구에서 사용 된 프로토콜을 승인했다.
악기, 솔루션 및 요리 1. 준비
- 인공 뇌척수액 (ACSF)를 준비합니다.
- 배 낮은 양이온 용액 500 ㎖, 10 배 수소 나트륨 용액 (용액의 조제 표 1 및 2 참조) 500㎖의 준비. 1 개월 이내에 4 O를 C 및 사용에 보관하십시오.
- 중탄산 나트륨 용액 60 ㎖로 10 배 낮은 양이온 용액 60ml를 혼합하여 신선한 ACSF 600 ml를 준비하고 600 mL의 최종 부피에 도달 탈 이온수 480 ml에 추가한다. 버블 ACSF carbogen와사용하기 전에 적어도 10 분 동안 (5 % O 2, 95 % CO 2).
- 모세관 유리에서 패치 피펫을 당깁니다.
- 기록 피펫을 준비하는 피펫 풀러에 얇은 벽으로 둘러싸인 모세관 유리를 놓습니다.
연구실에서, 풀러 다음의 설정 파라미터가 이상적인 피펫 형상을 달성하는 데 사용된다 : 주 열 (510), 속도 (32). DRG 그대로 기록 용 피펫 이상적인 형상은 낮은 원뿔 각도 점진적가는 테이퍼 있어야하고, 이것은 가장 시행 착오에 의해 달성 될 수있다. - 내부 솔루션 (솔루션 준비를위한 표 3 참조)으로 가득 때 피펫의 저항이 3-5 MΩ 있는지 확인합니다. 피펫 저항 (18)을 측정하는 자세한 방법에 대해 축삭 설명서를 참조하십시오.
- 기록 피펫을 준비하는 피펫 풀러에 얇은 벽으로 둘러싸인 모세관 유리를 놓습니다.
- 13 단위 / ㎖의 최종 농도를 수득하기 ACSF 400 μL로게나 1 ㎎을 추가. 그리고 콜라겐 용액 20 ㎕를 각각 유리 피펫을 입력합니다. 저장-20 O를 C의 냉장고에 채워진 피펫 3 주 내에서 사용합니다.
- 차가운 ACSF (약 4 O를 C) 200 ㎖를 준비합니다. 이 동결 시작할 때까지 빠르게 ACSF를 냉각 비커에 배치하려면 약 20 분 동안 -20 O를 C 냉장고에 플라스틱 포장과 장소에 밀봉. 10 분 동안 carbogen와 얼음 욕조와 거품 비커를 놓습니다. 거품은 실온에서 carbogen와 ACSF의 400 ml의 나머지.
- ACSF 냉각되는 동안, 5mm 직경의 개구 (이것은 DRG를 전송하는 데 사용된다) 확대 플라스틱 일회용 전달 피펫의 끝을 잘라. 다음과 같은 수술 도구를 수집 메스 (# 15), 메이요는 직선과 곡선 가위, 미세 2mm 팁 rongeur, Adson (톱니) 집게, 홍채 가위, 스프링 가위와 두 개의 미세 집게. 3 유리 페트리 접시에 산소 차가운 ACSF (: 10cm 외경)을 따르십시오.
2. DRG 해부
- 나트륨 체육와 쥐 (200~220g)을 마취ntobarbital (100 ㎎ / ㎏, IP) 및 마취의 수준이 페달 반사와 눈 깜박임 반사를 테스트하여 적절한 지 확인합니다.
- 쥐가 마취되어 있는지 확인한 후, 요추 영역을 면도하고, 중간 선을 따라 피부와 피하 조직을 절개. 좋은 골막 엘리베이터를 사용하여 L1-S2 수준에서 가시 돌기의 척추 주위 근육을 분리합니다.
- S2에 L1에서 가시 돌기를 잘라 곡선 가위를 사용합니다. 2 ~ 3 분 (단계 1.5에서 준비) 노출 된 척추 약 L1 및 S1에서 가로 인하하고 일괄 척추의이 세그먼트를 제거하고 빨리 감기 ACSF로 잠수함 똑바로 메이요 가위를 사용합니다. 래트 깊은 펜토 바르 비탈 마취하에있는 동안 척추 DRGs의 제거 후, 안락사는 양자 개흉술 의해 수행된다.
- 상기 제거 된 척추의 혈액 및 장착 된 조직을 세척 차가운 ACSF와 페트리 접시에 전송합니다. 유엽층을 제거하는 미세 rongeur을 SE는. 척수를 노출 microscissors와 정중선을 따라 뇌경막을 잘라. 조심스럽게 척수를 들어, 홍채 가위를 사용하여 척수에서 자신의 엔트리 포인트에 신경 뿌리를 절단 한 후 척수를 제거합니다.
- 차가운 ACSF 가득 번째 페트리 접시에 DRGs에 남아있는 척추를 전송합니다. L4 및 횡 프로세스 및 좌골 신경에 상대적인 위치에 따라 L5 DRGs를 확인합니다.
참고 : 그대로 좌골 신경을 유지하는 L4와 L5 DRG를 (좌골 신경이 L4-6 척추 신경에서 유래)를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. - 주변의 결합 조직에서 DRGs를 무료로 뒤몽의 집게와 노이스 가위를 사용합니다. DRGs에 부착 된 신경근과 척수 신경을 유지합니다.
- 더 해부에 대한 세 번째 페트리 접시에 DRGs를 이동 전송 피펫을 사용합니다.
- 해부 현미경 신중 epineurium 주변 번째의 최대한 제거전자 DRG.
- 지느러미와 복부 뿌리는 DRG에 가입하고 DRG에서 복부 루트를 분리 개구부를 잘라 노이스 스프링 가위를 사용합니다. epineurium를 개최 뒤몽 #에게 무딘 팁 5 집게를 사용하고 epineurium에서 DRG 롤 다른 미세 집게를 사용합니다.
- 미세 집게를 사용 DRGs에 많은 epineurium의 가능한 연결 제거를 계속합니다.
참고 잘 해부 DRG 다음 단계에서 좋은 소화를 획득하는 것이 중요하다.
3. DRG 소화
- 상기 기록 챔버로 이동 DRG. 신경 뿌리가 아래로 얼굴을 기원 DRG의 확인 측을 확인합니다.
주 : 이러한 방식으로, 대부분의 신경 세포가 접근 가능하다. - DRG을 안정 앵커를 사용합니다. 녹화 장비 옆 테이블에 배치 된 연동 식 펌프와 연결 플라스틱 관을 통해 0.5 ㎖ / 분의 속도로 관류 산화 된 ACSF DRG.
- 세포가 복구 할 수 있도록 30 분 동안 기다린. CCD 카메라를 통해 40X 대물 배율 적외선 차동 인터페이스 콘트라스트 아래 DRG 품질 (IR-DIC) 광학 평가.
참고 : 좋은 DRGs는 일반적으로 많은 라운드, 잘 대조, 그 표면에 위성 아교 세포에 의해 둘러싸여 신경 세포가 포함되어 있습니다. - DRG 표면의 작은 영역 다이제스트.
주 : 유리 패치 피펫 튜브는 밀폐형으로 유리 피펫에 부착 될 수 있도록 작은 커플 링되어 피펫 홀더에 배치된다.- 개별적으로 작은 직경의 고무 튜브의 두 조각을 통해 피펫 홀더에 두 1ml를 주사기를 연결합니다. 피펫 홀더 중 하나를 다른 하나에 빈 유리 피펫으로 콜라게나 가득 한 유리 피펫을 넣습니다.
- 바로 DRG 위의 피펫을 배치하기 위해 미세 조작기를 사용합니다. 그런 다음, 현미경 배율에 따라, 5- 이상적으로 직경 피펫 팁 (의 개구부를 확대 조심스럽게 서로에 대해 두 피펫의 팁을 충돌10 μm의).
- 홀더 및 플런저에게 약 0.5 ml의 변위에 의해 주사기를 연결하는 튜브를 통해 피펫 포함 된 콜라게나 제에 긍정적 인 압력을 간단히 가까운 DRG의 표면에 효소로 가득 피펫을 이동합니다.
주 : 압력하에 피펫으로부터 효소의 흐름이 약간 효소 애플리케이션 기호로서 기능 할 수 DRG 뉴런 사이의 공간이 확대된다. - 10 분 15 후, 나머지 epineurium의 파편이 관찰 될 때, 파편을 멀리 빨아 빈 피펫에 부드러운 음의 압력을 적용합니다.
주 :이 방법에서, 신경 세포와 주변 위성 신경교 세포가 분명히 노출되는 패치 녹음 준비. - 날카로운 물건 용기에 두 피펫을 폐기하십시오.
4. 패치 클램프 녹음
- 열화를 방지하는 얼음 전극 액 (표 3 참조)를 배치했다. 으로 유리 패치 피펫을 기입필터링 된 세포 용액 (주사기 필터, 기공 크기 : 0.2 μm의)와 headstage 피펫 홀더에 피펫을 배치합니다. 목욕 솔루션에 피펫을 낮추는 전에 1 ml의에 대한 플런저를 변위에 의해 5 ML의 주사기를 통해 피펫에 부드러운 긍정적 인 압력을 적용합니다.
참고 :이 차단되는 것을 피펫을 방지 할 수 있습니다. - 다음 소프트웨어의 "막 테스트"인터페이스를 열고 앰프 모드 노브를 돌려 "V-클램프"모드를 선택합니다. 현미경 검사에서 대상 신경 세포에 가까운 피펫을 이동합니다.
주 : 그대로 DRG 제제에서, 위성 신경교 세포의 박층 각 뉴런을 캡슐화한다. - 관찰 뉴런과 위성 신경교 세포의 주변 층과의 거리가 갑자기 확대까지 위성 신경교 세포 층을 통과 할 피펫으로부터 정압을 사용한다. 는 "보조개는"신경 세포에서 관찰 될 때까지 신경 세포를 향해 피펫을 이동하십시오.
참고 :와 비교해리 된 뉴런에서 녹화는 양압 위성 신경교 세포 층을 관통하고 성공적인 패치에 대한 가능성을 향상시키는 데 도움이되는, 약간 클 필요가있다. - 긍정적 인 압력을 줄일 수 있습니다. 다음으로, 부드러운 흡입과 기가 옴 밀봉을 얻을 수 있습니다.
주 :이 방법에서는, 기록의 성공 확률은 70 % 이상이다. - 이전 19 설명 된대로 전체 셀 기록 구성을 얻습니다.
- 간략하게, 짧지 만 강하고, 흡입을 통해 신경 세포막을 관통. 흡입이인가 된 상태에서 대안 적으로, 상기 증폭기의 "겠"기능을 사용한다.
- 전체 셀 모드로 설정되면, 증폭기의 용량과 저항을 보상 손잡이를 돌려 전체 셀 용량과 직렬 저항 (RS)을 보상한다.
참고 : 루피는 일반적으로 5 ~ 20 MΩ입니다. - 중계국 처음 30 MΩ 이상이면 세포 포기; 녹화 중 20 % 이상 또는 루피 변경됩니다. 또한휴지 막 전위를 측정; 휴지 막 전위는 -50 MV 이상이면 세포를 포기.
- 은 "멤브레인 테스트"창을 닫습니다. 앰프의 모드 노브를 돌려 "I-클램프 정상"모드를 선택합니다.
- 소프트웨어의 "개방형 프로토콜"을 클릭하여 선택하고 rheobase 측정을위한 프로토콜을로드합니다. 녹음을 시작합니다 "기록"을 클릭합니다. 입력 저항을 측정하고 100 펜실바니아 단계로 전류를 탈분극의 등급 시리즈를 주입하여 신경 세포의 흥분을 검토 rheobase.
- 다시 "개방형 프로토콜"을 클릭하고 막 임계 값을 측정하기위한 프로토콜을 선택합니다. 램프 전류 (2000 PA / S)를 탈분극 500 밀리 뉴런에 주입한다.
- 제조업체의 지침에 따라 기록 된 흔적을 분석하는 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 (예 : Clampfit)를 사용합니다. 정상 상태의 IV relat에 기초하여 상기 입력 저항 (린)를 계산하는 소프트웨어를 사용하여전달 된 hyperpolarizing 전류 동안 ionship. rheobase 멤브레인 임계 값을 측정하기 위해 커서를 이동합니다.
주 : AP를 유도하는데 필요한 전류의 진폭이 rheobase로 정의되고, AP 유도 가장 낮은 전압이 임계 막으로서 정의된다.
- 리간드 유도 전류를 기록한다.
- 특정 효능과 피펫을 입력합니다.
참고 : 현재 보고서에서, 우리는 각각의 글루타메이트 수용체 및 TRPA1 수용체에 의해 매개되는 전류를 유도하기 위해 100 μM 글루타메이트 100 μM AITC을 사용했다. - 내부에 기포가 없는지 확인하기 위해 피펫을 확인합니다. 피펫 홀더에 피펫을 배치합니다. 약물 분배 시스템에 연결된 튜브 피펫 홀더를 연결한다.
- 신경 세포의 50 μm의 내에서 피펫을 이동 조작을 사용합니다. 한 PSI에 약물 분배 시스템 압력 및 1 초의 지속 기간을 설정한다. 전압 클램프로 촬영 모드를 전환하고 -70 MV에 클램프. 간단히 약물 - 유도 전류를 기록하는 약물 분배 시스템을 통해 압력을 적용한다.
- 특정 효능과 피펫을 입력합니다.
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Representative Results
그림 1은 패치 기록에 그대로 DRG를 준비하는 과정을 보여줍니다. 그림 1A는 추궁 절제술. Figure1B 후 신경의 노출 위치와 척수를 제거한 후 부착 된 신경 뿌리와 L3, L4와 L5 DRGs를 보여줍니다를 보여줍니다. 그리고 L4, 5 DRGs 신중하게 해부하고 척추에서 해방됩니다. 다음에, epineurium 상기 DRG를 둘러싼 투명 막 (노란 화살표도 1D)을 제거한다. epineurium을 분리하는 가장 좋은 위치는 지느러미와 복부 뿌리는 DRG에 참여 사이트를 통해 그림 1D에서 검은 색 화살표로 표시된 바와 같이,. epineurium을 박리 한 후, 복부 루트는 지느러미 작은 뿌리를 떠나, 제거 및 폐기 도 1E에 도시 된 바와 같이, 척추 신경 DRG. 콜라게나 소화 뉴런과 위성 셀 t 노출 잔류 epineurium 삭제모자 (그림 1 층)을 둘러싸고 있습니다.
DRG 준비를 완료 한 후, 작은 직경 DRG 뉴런의 흥분성이 rheobase 멤브레인 임계 값을 측정하여 검사된다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, rheobase 260 펜실바니아.도 2B는 이러한 방법으로 측정 된, 막 임계치를 도시한다. 액세스 포인트가 유발 될 때까지 증가하는 전류 멤브레인 연속 탈 분극된다. 이 예에서, 임계 막 (AP가 유발되는 전위) -11.9 (MV)이다. 따라서, 뉴런과 위성 신경교 세포의 관계를 유지함으로써, 우리는 제제의 생체 내 상황에 가깝다. 이러한 결과에 기초하여, 소형 DRG 뉴론에서 기록 rheobase 약 300 pA를하고, 입력 저항은 451.3 ± 27.3 MΩ이다. 모두 높은 제안, (150 PA와 635 MΩ의 주위에) 해리 신경 세포에서 측정과 비교된다그 해리는 DRG 뉴런 (11)의 흥분성을 증가했다.
이 준비, 우리는 또한 글루타메이트 수용체 각각 일시적인 수용체 잠재적 인 양이온 채널 부재 A1 (TRPA1)에 대한 작용제이다 글루타메이트 알릴 이소 티오 시아 네이트 (AITC)에 의해 유도 된 안쪽으로 전류를 측정 하였다. 이들 리간드에 의해 유도되는 내부 전류의 진폭. 신경 분포 수용체의 수를 반영 3a는 글루타메이트의 1 초 퍼프 애플리케이션 (1 ㎜)에 의한 작은 직경 DRG 뉴런의 안쪽 전류를 나타낸다 것이다. 글루타메이트는 DRG에 글루타메이트 수용체에 의해 매개되는 전류를 확인 크게 NMDA 수용체 길항제 APV와 AMPA / 발생한 kainate 수용체 길항제 CNQX (데이터는 도시하지 않음)의 협력 애플리케이션에 의해 차단 될 수있는 내측 전류 (198 씩), 유도 뉴런. 이 데이터는 DRG 뉴론에서 글루타메이트 수용체 기능이 있음을 세웠다. 북동도 3b에 도시 uron는 알릴 이소 티오 시아 네이트 (AITC, 100 μM), 선택적 TRPA1 작용제의 1 초 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 안쪽으로 전류 (260 씩) 보여 주었다. 내향 전류가 선택적 길항제 TRPA1 10 μM의 HC 030,031 의해 차단 된 전류를 확인하고, (데이터 미도시) TRPA1 수용체에 의해 매개 및 DRG 뉴런에 TRPA1 수용체의 존재를 확립 하였다.
그림 1 : 그대로 DRGs의 제조 후궁 절제술 후 척수 및 DRGs의 분할의 (A) 노출.. 오른쪽에서 왼쪽으로 화살표는 각각 L3-5 DRGs를 나타냅니다. 스케일 바 = 1cm. 척수 제거한 후 L3, L4 및 L5 DRGs 및 첨부 신경근의 (B) 노출. 화살표는 오른쪽에서 왼쪽으로 L3, L4와 L5의 DRGs를 나타냅니다. 스케일 바 = 1cm. (C) 인타척수에서 해부 후 부착 신경 뿌리와 코네티컷 DRGs. 화살표는 오른쪽에서 왼쪽으로 L4와 L5 DRGs를 나타냅니다. 스케일 바 = 1cm. (D) 부착 epineurium와 본래 DRG. 이 그림에서, epineurium은 그대로이고, 노란색 화살표는 뒤몽의 집게에 의해 개최 반투명 epineurium을 보여줍니다. 검은 색 화살표는 epineurium을 벗겨 수있는 좋은 출발점 역할 등의 루트 및 복부 루트에 의해 형성된 접합을 나타냅니다. 스케일 바 = 1mm. (E)를 epineurium 및 복부 루트 후 부착 된 지느러미 루트와 같은 DRG가 제거되었습니다. 스케일 바 = 1mm. 콜라게나 제와 소화 다음 DRG의 (F) 적외선 현미경 이미지. 중소 규모 뉴런 볼 수 있습니다. 위성 아교 세포 (노란색 화살표)는 신경 세포 (별표)를 둘러싼 볼 수 있습니다. 피펫에 빨간색 화살표를 가리 킵니다. 스케일 바는 10 μm의 =. (G) 녹화 장비 구성. 검은 색 화살표는 일 표시전자 피펫 홀더. 왼쪽 하나는 약물 채워진 피펫을 보유하고, 기록 피펫이 오른쪽에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 전류 클램프 모드 (A)에서 Rheobase 신경 흥분성의 측정은 DRG 뉴런 (상단 패널)로 전류의 연속 주입하여 측정 하였다. 하판의 화살표 방향으로 활동 전위를 유도 할 수있는 낮은 전류 강도는, rheobase로 정의된다. 이 신경 세포의 rheobase 300 pA에 있습니다. (B). 막 임계치는 램프 전류를 주입하여 측정 하였다. 활동 전위를 유발 때 상판에 점선으로 표시된 바와 같이 전위가, 임계 막으로서 정의된다.이 신경 세포의 막 임계 값이 -11.9 MV입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 작은 DRG 뉴런에 리간드 유도 된 전류를 1 초 동안 글루타메이트의 퍼프 응용 프로그램 (1 ㎜) 또는 알릴 이소 티오 시아 네이트 (TRPA1 작용제, AITC, 100 μM)에 의해 유도 전류.. 두 작용제 소형 DRG 뉴론에서 글루타메이트 수용체 및 TRPA1 수용체의 존재를 시사 전류 내측 유도. 글루타메이트 애플리케이션 198 펜실베니아 (A)의 내부 전류를 유도하고, AITC 260 펜실베니아 (B)의 내부 전류를 유도. 뉴런은 -70 MV에 고정되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </ P>
| 10 배 낮은 양이온 재고 2 리터 | |||
| 최종 농도 (mM)을 | 구성 요소 | MW | 중량 (g) |
| 삼 | KCl을 | 74.6 | |
| (11) | 포도당 | 180.2 | |
| (123) | 염화나트륨 | 58.4 | |
| 1.25 | 의 NaH 2 PO 4 *의 H 2 O | (138) | |
| 1 | 의 MgCl 2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| 이 | CaCl2를 * 2H 2 O | 147 | |
1 번 테이블
| 10 배 중탄산 재고 1 리터 | |||
| 최종 농도 (mM)을 | 구성 요소 | MW | 중량 (g) |
| (26) | 의 NaHCO3 | 84.01 | 21.84 |
표 2
| 세포 내 용액을 100 ml의 | |||
| 농도 (mM)을 | 구성 요소 | MW | 지 |
| (130) | KGluconate | 234.24 | |
| (10) | KCl을 | 74.55 | |
| (10) | HEPES | 238.3 | |
| (10) EGTA | |||
| 이 | 의 MgCl 2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| 참고 : - 자당과 증류수로 280 mOsm 260 KOH와 7.4의 pH 및 삼투압을 조절합니다. 즉시 사용하기 전에 2 mM의 MgATP, 0.5 밀리미터 나 2 GTP 및 필터를 추가합니다. | |||
표 3
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Discussion
우리는 패치 클램프 연구 전체 DRGs을 제조하는 방법을보고한다. 이상적인 표본을 준비하기위한 몇 가지 핵심 요소가 있습니다. 첫째, 부착 등의 뿌리와 DRGs를 해부하는 것이 중요하다. 그 후, epineurium은 신경의 손상을 방지하면서 조심스럽게 제거해야한다. 마지막으로, 신경 세포 및 그 주변 위성 신경교 세포를 노출 시키도록, 상기 나머지 결합 조직을 소화 할 필요가있다. 여기에 기술 된 방법으로 제조 성인 쥐 그대로 DRGs는 6~8 시간 동안 좋은 생존율을 유지하고 안정 기간 동안 기록 할 수있다. 이들은 뉴런 또는 위성 신경교 세포, 또는 DRG 뉴런 유발 된 반응에 대한 패치 클램프 기록을 포함 DRGs 다양한 연구에 사용될 수있다.
절개 과정 동안, 신속 DRG 해부 및 신경 대사 느린 저온 (4 입출력 C)로 유지하는 것이 중요하고, 따라서 그의 생존을 유지한다. t 중DRGs의 그 해부, 하나는 등의 스트레칭 피해야한다 또는 척수 신경은 DRGs를 입력. 이 준비의 또 다른 중요한 단계는 DRG를 둘러싼 epineurium의 제거이다. epineurium 침투하는 것이 곤란하기 때문에, DRG에 남아있는 epineurium은 뉴런 도달 패치 피펫을 방지한다. 콜라게나 제의 적용은 성공적인 준비를위한 중요한 단계입니다. 콜라게나 나머지 epineurium 다이제스트 성공적인 패치에 중요한 두 가지 모두 동시에 세포의 표면을 세정한다. 조직의 오버 소화를 방지하기 위해 세 가지 요소가 고려 될 필요가있다. 첫째, 콜라게나 제는 여러 가지 형태로 제공; 투자 의견 재료의 표를 참조, 현재 사용되는 따라서 오버 소화를 방지 강력하지만 부드러운. 둘째, 효소는 기록 영역을 넘어 효소의 분산을 방지하기 위해 저압에서 전달되어야한다. 우리는 0.5 ml의 적용에서 발생되는 압력을 발견했다의 1ml를 주사기 중 적외선은 충분하다. 셋째, 콜라게나 제에 대한 최선의 농도 범위는 10 내지 13 단위 / ㎖로한다. 낮은 농도가 불필요하게 긴 소화 시간을 포함하면서 높은 농도는 오버 소화와 조직의 빠른 저하 될 수 있습니다. 우리의 경험에 의하면, ml를 13 단위 /의 농도와 소화 시간은 약 15 분 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 효소를 적용한 후 DRG를 둘러싼 나머지 epineurium이 느슨해지면, 멀리 부드러운 흡입으로 해제 할 수 있습니다. 콜라게나 따라서 일단 효소 용액을 분취 량으로 나누어 3 주 이내에 사용해야 희석하고, 동결 - 해동 사이클을 반복하여 민감하다.
장과 동료들은 그대로 DRGs에서 패치 클램프 녹음하는 방법을 설명하는 첫번째이었다. DRGs 쉽게되는 이점을 갖는다는 사용 래트 그러나 매우 어릴 (10 ~ 15 일 산후) (20)은 얇은 에피가 주어진 준비 할neurium 그들은 증가 가능성을 가지고있다. DRGs 신생아 래트에서, 그러나, 단백질 TRPV1 NaV1.8와 같은 이온 채널의 발현은 성체 래트 (21, 22)과 다를 단점을 가지고있다. 또한, 행동 및 약리 연구는 일반적으로 성인 쥐에서 실시하고 있습니다. 따라서 여기에 설명 된 기록 방법은 성인 동물에서 전기 생리학 및 동작 사이의 상관을 허용한다. 제제로서 그대로 후근 신경절의 사용은 생체 최근 15-17,23,24을 증가하고, 일부 연구는 생체 내 기록 (25)에 사용한 패치 클램프 기록을 수행한다. 생체 녹음의 대부분은 약 30 ~ 60 분 동안 효소 칵테일로 전체 DRG를 배양하여 DRG 뉴런을 노출. 이 방법은 더 많은 신경을 생산하고 있지만, 그것은 오버 소화 표면층에서 뉴런의 위험이 있습니다. 우리의 방법은 예를 모니터링 육안을 이용하여 과도한 분해의 가능성을 최소화소화의 텐트 또한 생체 내 녹음 25 마 등으로 사용되는 방법.
해리 DRG 뉴런과 비교하여 본래 DRG 제제의 장점 중 하나는 뉴런과 위성 신경교 세포 (도 1) 모두의 보존에서 온다. 이 해리 DRG 신경 세포를 사용하는 통상적 인 제제의 경우가 아니다. 위성 교세포 개별 DRG 신경 세포를 둘러싸는 장벽을 형성하고, 이들의 존재는 이들 뉴런 (13)의 생리 학적 환경을 유지하는데 필수적이다. 결과에서 언급 한 바와 같이이에 의해 제조 된 신경 세포의 전기 생리 특성은 해리 세포를 이용한 연구에 의해 얻어진 다를 의미한다.
이 제조를위한 가장 흥미있는 미래 방향 중 한 DRG 뉴런과 위성 신경교 세포 사이의 크로스 토크를 조사하는 것이다. 신경 손상 후, 예를 들면, 위성 신경교 세포 t 나타났다오 밀접하게 13-15,26을 계속된다 고통 동작과 관련된 플라스틱 변화를 겪는다. 본래 DRGs 위성 신경교 세포의 보존은, 예 글루타메이트 수용체로서 송신기 수용체 또는 ATP 수용체 위성 아교 세포에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 사용되며, 그들이 어떻게 반응 신경 세포 활성도의 변화. 위성 신경교 세포 패치 동시에 신경 세포를 자극하여, 위성 신경교 세포 생물학적 센서로서 작용하고, 주변 신경에서 송신기 분리가 있는지 여부를 표시 할 수있다. 또한, 그대로 DRG 준비는 구 심성 및 원심성 신경 뿌리를 모두 유지합니다. 이것은 크게 축삭 자극 들어가거나 생체 내 상황을 더 잘 모방 될 흡인 전극과 뉴런을 종료 할 가능성을 추가 실험 범위를 확장한다.
현재 준비에 몇 가지 제한이 있습니다. 위성 GLI 의해 형성된 장벽의 존재알 세포 패치 뉴런을 더욱 어렵게 만들고 하나는 신경 세포에 도달하는 약물의 농도가 제한 될 수 있음을 인식해야한다. 따라서, 위성 교세포 층을 관통 돕기 위해 포지티브 압력하에 피펫을 유지하는 것이 중요하다 우리 제조에서 뉴런에 액세스한다. 또 다른 제한은 등쪽 뿌리 척수 신경은 DRG를 해부하기 위해 절단 될 필요가 있다는 것이다. 따라서, 완전히 그대로 축삭을 떠날 수 없다. 말초 또는 중추 축삭은 전압 클램프가 수행 될 때, 기록 가능한 에러 또는 간섭을 일으킬 수 소마과 동일한 전압 값으로 고정되지 않을 그러나 나머지 엑손의 존재를 고려하여야한다. 또한, 뉴런의 좋은 노광을 얻기 위해, 콜라게나 제와 부드러운 소화가 필요하고, 이는 환경을 제어 할 수 있지만, 완전히 소화 효소에 노출 뉴런을 보호하는 것은 불가능하다. 기존의 D와 비교issociated DRG 뉴런 그러나, 전체가 DRGs (약 30 분)을 제조 빠르며 많은 애플리케이션과 생체 조건에서 밀접하게 모방하여 사용할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
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