Abstract
後根神経節（DRG）を切り出し、神経細胞からのパッチクランプ研究は、末梢神経系の我々の理解が高まっています。現在、レコーディングの大部分は、ほとんどの研究室のための標準的な製剤である解離DRGニューロン上で行われています。ニューロンの特性は、しかしながら、解離したニューロンを取得する際に用いられる酵素消化から生じる軸索損傷によって変更することができます。一次感覚ニューロンを取り囲む衛星グリア細胞との接触の損失は、この方法の避けられない結果であるので、解離ニューロン製剤は完全にDRGの微小環境を表すことができません。パッチクランプ記録のために、従来の解離DRGニューロンを使用して制限を克服するために、この報告書では、我々は、ex vivoで 、無傷のDRGを作成し、個々の一次感覚ニューロンにパッチクランプ記録を行う方法について説明します。このアプローチはで模倣、無傷のDRGの高速かつ簡単な製造を可能その周囲の衛星グリア細胞と基底膜に関連したDRGニューロンを維持することにより、インビボ条件。さらに、この方法は、操作からの軸索の損傷を回避し、そのようなDRGを解離するときのように消化酵素。このエクスビボ製剤はさらに、一次感覚ニューロンおよび衛星グリア細胞間の相互作用を研究するために使用することができます。
Introduction
センセーションは、生物の生存と福祉に不可欠です。刺激の伝達は、一次感覚ニューロンからの軸索の末梢終末から始まる感覚経路に依存しています。一次感覚ニューロンは、三叉神経の脳核を除いて、三叉神経節および後根神経節（DRG）内に配置されています。彼らは、感覚情報1のゲートキーパーとして機能します。 perikarial膜では、ちょうど中枢および末梢端子のように、DRGニューロンは、グルタミン酸受容体として、受容体及びイオンチャネルを発現し、TNFアルファ受容体、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）、ナトリウムチャネルなど 2 -7。 perikarial膜のパッチクランプ記録は、ニューロン全体でこれらの受容体およびチャネルの多くの機能的変化を理解することができます。
パッチクランプ記録技術は、STUのための強力なツールです。チャネルもしくは受容体および研究の多くの活動を瀕死はDRGニューロン8-10にこの技術を適用することによって行われています。ほとんどの研究ではDRGは、背側根神経節に近い脊髄神経を切断することによって除去されます。ミンチした後、神経節は、次いで、記録する前に数日間、直ちにまたは培養記録されていてもよいDRGニューロンの解離をもたらす消化酵素に配置されます。残念ながら、DRGニューロンの解離はperikaryonの複数形に近い必要な軸索切断を伴います。いったん分離し、軸索切断し、DRGニューロンは、膜興奮11,12における表現型の変化だけでなく、変化を受けます。通常はそれらを囲む個々のニューロンのperikaryonの複数形及び衛星グリア細胞間の接触の損失は、これらの変化13に貢献する可能性があります。ニューロンと衛星グリア細胞間のクロストークは、生理的条件下において必須とpathologへの適応の両方でありますこのような難治性疼痛14,15につながるものとiCalの条件。解離したDRGの準備を使用して、ニューロンと衛星グリア細胞間の相互作用を研究するために挑戦することになります。
無傷のDRGを、一方、 インビボ条件に近い提供します。過去数年間で、私たちの研究室だけでなく、いくつかの他のグループは、慢性疼痛3-5,11,15-17に関連したさまざまな条件での一次感覚ニューロンの変化を調査するために成体ラットから無傷のDRGを使用しています。これらの研究で使用される技術は多少確立されていますが、ステップバイステップの説明がまだ公開されていません。本原稿では、我々は、無傷のDRGおよびパッチクランプ記録のためのそれらの使用を準備するための便利で高速な方法を記述する。
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Protocol
倫理声明：実験動物のメンテナンスと使用のためのすべての手順は、動物実験にUCSF委員会の規制に適合し、動物使用とケアにNIH規制のガイドラインに従って実施した（文献85から23まで、1996年改訂）。 UCSF制度動物実験委員会は、この研究で使用されるプロトコルを承認しました。
楽器、ソリューションおよび料理の作製
- 人工脳脊髄液（aCSFの）を準備します。
- （溶液調製については表1および2参照 ）10倍低いカチオン溶液500ml、及び10倍重炭酸塩溶液500mlを調製します。 4 O Cで保存し、1ヶ月以内に使用します。
- 重炭酸塩溶液60mlで10倍低いカチオン溶液の60ミリリットルを混合することによって、新鮮なaCSFのの600ミリリットルを準備し、その後、600ミリリットルの最終容量に到達するための脱イオン水480ミリリットルを追加します。バブルaCSFのカーボゲンと使用前に少なくとも10分間（5％O 2及び95％CO 2）。
- キャピラリーガラスからパッチピペットを引き出します。
- 記録ピペットを準備するために、ピペットプラーに薄壁キャピラリーガラスを置きます。
注意：私たちの研究室では、プーラーの次の設定パラメータは、理想的なピペット形状を達成するために使用されている：熱（510）、速度（32）。無傷のDRGの記録のための理想的なピペット形状が低い円錐角を有する緩やかな細いテーパを有するべきであり、これは最高の試行錯誤することによって達成することができます。 - 内部ソリューション（解決策の準備のため、表3を参照）を充填したときのピペットの抵抗は3-5MΩであることを確認してください。ピペット抵抗18を測定する具体的な方法のための軸索ガイドを参照してください。
- 記録ピペットを準備するために、ピペットプラーに薄壁キャピラリーガラスを置きます。
- 13単位/ mlの最終濃度を与えるために、aCSFの400μlにコラゲナーゼの1ミリグラムを追加します。その後、コラゲナーゼ溶液の約20μlの各ガラスピペットを埋めます。格納-20°Cの冷凍庫で満たされたピペットと3週間以内にそれらを使用しています。
- 冷たいaCSFの（約4 Oの C）の200ミリリットルを準備します。それが凍結し始めるまで迅速にaCSFを冷却ビーカーにそれを配置するには、約20分間、-20°Cの冷凍庫にプラスチックラップと場所で密封します。 10分間、カルボゲンで氷浴やバブルにビーカーを置きます。バブルRTでカーボゲンとaCSFの残りの400ミリリットル。
- aCSFの、冷却されている間、5mmの直径の開口部（これはDRGを転送するために使用される）を拡大するためにプラスチック製の使い捨てのトランスファーピペットの端部を切断します。次の手術器具を収集：メス（＃15）、メイヨーは、直線と曲線はさみ、罰金2ミリメートルの先端骨鉗子、Adson（歯付き）鉗子、アイリスはさみ、春のはさみと2細かい鉗子。 3ガラスペトリ皿（さ：10 cm外径）に酸素冷たいaCSFのを注ぎます。
2. DRG解剖
- ナトリウムPEでラット（200〜220グラム）を麻酔ntobarbitalた（100mg / kg、腹腔内）麻酔のレベルがペダル反射し、目の瞬目反射をテストして適切であることを確認してください。
- ラットを麻酔されていることを確認した後、腰部を剃ると正中線に沿って皮膚や皮下組織を切開。細かい骨膜エレベーターを使用して、L1-S2レベルで棘突起から傍脊柱の筋肉を切り離します。
- S2にL1から棘突起をカットする湾曲したハサミを使用してください。 2-3分間（ステップ1.5で調製した）露出した脊柱で約L1とS1における横カットを行い、 一括脊柱のこのセグメントを削除し、すぐに冷たいaCSFの中にそれを沈めるためにまっすぐマヨはさみを使用してください。ラットは深いペントバルビタール麻酔下にある間に腰椎のDRGを除去した後、安楽死は、二国間の開胸術によって行われます。
- 削除された脊柱と付着した組織から血液をオフにフラッシュし、冷たいaCSFのペトリ皿に移します。 U薄層を除去するための細かい骨鉗子をSE。脊髄を露出させるためにmicroscissorsで正中線に沿って硬膜をカット。静かに脊髄を持ち上げ、虹彩のはさみを使用して、脊髄にそのエントリポイントで神経根をカットし、脊髄を除去します。
- 冷たいaCSFので充填された第2のペトリ皿にDRGを持つ残りの椎骨を転送します。横突起と坐骨神経への相対的な位置に基づいて、L4とL5のDRGを特定します。
注：無傷の坐骨神経を維持することは、L4とL5 DRG（坐骨神経がL4-6脊髄神経に由来する）を識別するのに役立ちます。 - 周囲の結合組織からのDRGを解放するためにデュモンの鉗子とノイエスはさみを使用してください。 DRGに取り付けられた神経根や脊髄神経をしてください。
- さらに解剖のための第三のペトリ皿にDRGをを移動するために、転送ピペットを使用してください。
- 解剖顕微鏡下で、慎重に神経上膜周囲の目のできるだけ多くを削除電子のDRG。
- 背側と腹側根がDRGに参加し、DRGから前根を分離する開口部をカットするノイス春のはさみを使用してください。神経上膜を保持するためにデュモン位に鈍い先端を有する5ピンセットを使用し、神経上膜からDRGを展開する別の細かい鉗子を使用しています。
- 細かい鉗子を使用したDRGに取り付けられた神経上膜のできるだけ多くを除去するために続けます。
注：よく解剖DRGは、次のステップでは良い消化を得ることが重要です。
3. DRG消化
- 記録チャンバーにDRGを転送します。神経根が顔を下に発信DRGの側面を確認してください。
注：この方法では、ほとんどのニューロンがアクセス可能です。 - DRGを安定させるためにアンカーを使用してください。次の記録リグにテーブルの上に置かれている蠕動ポンプと接続されたプラスチックチューブを通して0.5ml /分の速度で酸素aCSFので灌流DRG。
- 細胞が回復できるようにするために30分間待ちます。 CCDカメラを通して40X対物倍率で赤外線差動インタフェースコントラスト（IR-DIC）光学系の下でDRGの品質を評価します。
注：良いのDRGは、通常、多くのラウンド、よく対比、その表面に衛星グリア細胞に囲まれたニューロンが含まれています。 - DRGの表面の小さな領域を消化。
注：ガラスパッチピペットは、チューブは、気密シールをガラスピペットに取り付けることを可能にする小さなカップリングでピペットホルダ内に配置されています。- 個別小径ゴム管の2枚を通してピペットホルダーへの2つの1ミリリットルのシリンジを接続します。 1ピペットホルダーのいずれかにコラゲナーゼを充填したガラスピペットと空のガラスピペットは、他の一つに入れてください。
- ちょうどDRGの上にピペットを配置するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。その後、顕微鏡の倍率の下で、理想的には（静かにピペットチップの開口部を拡大するために、5-の直径をお互いに対して2ピペットの先端を衝突10ミクロン）。
- 近いDRGの表面に酵素を充填したピペットを移動して、簡単にプランジャーを約0.5mlをずらすことによりホルダーと注射器を接続管を介してコラゲナーゼを含むピペットに正圧を適用します。
注：圧力の下で、ピペットからの酵素の流れが若干酵素アプリケーションのための記号としての役割を果たすことができるのDRGニューロン、間にスペースを拡大します。 - 10〜15分後、残りの神経上膜の破片が観察された場合、破片を離れて吸うために空のピペットに穏やかな負圧を適用します。
注：この方法では、ニューロンおよび周囲の衛星グリア細胞が明確にさらされると、パッチ記録の準備ができて。 - シャープコンテナに2ピペットを捨てます。
4.パッチクランプ記録
- 劣化を防ぐために、氷の上に電極溶液（ 表3参照）を配置します。とガラスパッチピペットを埋めますフィルタリング細胞内液（シリンジフィルター、孔径0.2μmの）とヘッドステージピペットホルダーにピペットを配置します。浴溶液中にピペットを下げる前に、1ミリリットル程度のプランジャを移動させることによって5ミリリットル注射器を介してピペットに優しい正圧を適用します。
注：これは詰まるからピペットを防ぐことができます。 - その後、ソフトウェアで「膜テスト」インターフェイスを開き、アンプのモードつまみを回して、「V-クランプ」モードを選択します。顕微鏡検査で標的ニューロンの近くにピペットを移動します。
注：無傷のDRGの準備では、衛星グリア細胞の薄い層は、各ニューロンをカプセル化します。 - ニューロンと衛星グリア細胞の周囲の層との間の空間の急激な拡大が観察されるまでの衛星グリア細胞層を横断するピペットから正圧を使用してください。 「ディンプル」は、ニューロンに観察されるまで、ニューロンに向かってピペットを動かし続けます。
注：と比較して解離したニューロンからの記録は、正の圧力は、衛星グリア細胞層に浸透し、成功したパッチ適用のための可能性を高めるのに役立つであろう、少し大きくする必要があります。 - 正圧を減らします。次に、穏やかな吸引ギガオームシールを達成します。
注：この方法では、記録の成功率が少なくとも70％です。 - 以前19記載されているように、全細胞記録の設定を取得します。
- 簡潔には、短いが強い吸引を介して、神経細胞膜を貫通します。吸引が印加されている間に別の方法として、アンプの「ザップ」関数を使用します。
- 全細胞モードが確立されると、アンプの容量と抵抗補償ノブを回すことにより、全セル容量および直列抵抗（Rs）を補償します。
注：Rsは通常5-20MΩです。 - Rsが30MΩよりも、最初は大きければ、セルを放棄します。または録音中に20％以上の変更をRS。また静止膜電位を測定します。静止膜電位がより-50mVでより多くのであれば、セルを放棄します。
- 「膜テスト」ウィンドウを閉じます。アンプのモードつまみを回して「I-クランプノーマル」モードを選択します。
- 、ソフトウェアの「オープンプロトコル」をクリックして選択し、基電流を測定するためのプロトコルをロードします。録音を開始する「記録」をクリックしてください。 100 pAのステップで電流を脱分極の段階的な一連を注入することによって、神経細胞の興奮性を調べるために、入力抵抗と基電流を測定します。
- 再び「オープンプロトコル」をクリックして、膜の閾値を測定するためのプロトコルを選択します。ランプ電流（2000 PA /秒）脱分極500ミリ秒は、ニューロンに注入されます。
- 製造業者の指示に従って記録されたトレースを分析するためにデータ収集および分析ソフトウェア（ 例えば、Clampfit）を使用します。定常状態IVのrelatに基づいて入力抵抗（RIN）を計算するためのソフトウェアを使用して配信過分極電流の間にionship。基電流および膜しきい値の値を測定するためにカーソルを移動します。
注：APを誘導するのに必要な電流の振幅は、基電流として定義され、APを誘導するための最低電圧は、膜閾値として定義されます。
- リガンド誘導電流を記録します。
- 特異的アゴニストでピペットを埋めます。
注：現在のレポートでは、我々はそれぞれグルタミン酸受容体とTRPA1受容体によって媒介される電流を誘導するために、100μMのグルタミン酸および100μMAITCを使用。 - 内部に気泡がないことを確認するピペットを確認してください。ピペットホルダーにピペットを置きます。薬物分配システムに接続されたチューブにピペットホルダーを接続します。
- ニューロンの50ミクロン以内にピペットを移動するためにマニピュレータを使用してください。 1 PSIへの薬物分配システム圧力及び1秒の持続時間を設定します。電圧クランプの記録モードを切り替えて、-70 mVのにクランプ。簡潔には、薬物誘発性電流を記録するために、薬物分配システムを介して圧力を加えます。
- 特異的アゴニストでピペットを埋めます。
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Representative Results
図1は、パッチ記録のために無傷のDRGの製造方法を示している。 図1Aは、椎弓切除後に神経節の暴露と場所を示している。Figure1Bは、脊髄を除去した後に取り付けられた神経根とL3、L4とL5のDRGを示しています。そして、L4と5 DRGを慎重に解剖し、椎骨から解放されます。次に、神経上膜、DRGを囲む透明な膜は、（黄色の矢印、 図1D）で除去されます。神経上膜を分離するための最良の場所は、 図1Dの黒矢印で示すように、背側と腹側根が背側根を残して、神経上膜を剥離した後、前根を除去し、廃棄される。、DRGに参加するサイトであります図1Eに示すように、脊髄神経およびDRG、。コラゲナーゼによる消化は、ニューロンと衛星細胞トンを露出させ、残留神経上膜を除去します帽子は（ 図1F）、それらを囲みます。
DRG準備が完了した後、小径DRGニューロンの興奮性は基電流および膜閾値を測定することによって検査されます。 図2Aに示すように、基電流が260 pAである。 図2Bは、この方法で測定された膜のしきい値を示しています。 APが誘発されるまで、増加する電流で、膜が連続的に脱分極されます。この例では、膜閾値（APが誘発される電位）-11.9 mVです。したがって、ニューロンおよび衛星グリア細胞との間の関係を維持することによって、我々の調製物は、 生体内の状況に近いです。我々の結果に基づいて、小さなDRGニューロンから記録された基電流は約300 pAであり、入力抵抗は451.3±27.3MΩです。両方が示唆している、（150 pAのと635MΩ程度）解離したニューロンからの測定されたものと比較して高くなっていますその解離は、DRGニューロン11の興奮を増加させました。
この準備では、我々はまた、グルタミン酸受容体とそれぞれ一過性受容体電位陽イオンチャネル部材A1（TRPA1）のためのアゴニストであるグルタミン酸とアリルイソチオシアネート（AITC）によって誘発される内向き電流を測定しました。これらのリガンドによって誘発される内向き電流の振幅は、神経細胞に分布する受容体の数が反映されます。 図3（a）は、グルタミン酸の1秒のパフアプリケーション（1 mM）のによって誘導された小径DRGニューロンにおける内向き電流を示しています。グルタミン酸は、DRGのグルタミン酸受容体によって媒介される電流を確認主としてNMDA受容体アンタゴニストAPVおよびAMPA /カイニン酸受容体アンタゴニストCNQX（データは示していない）の同時適用によって遮断することができる内向き電流（198 PA）を、誘導しますニューロン。このデータは、DRGニューロン上の機能グルタミン酸受容体があることを確立しました。ね図3（b）に示すウロンは、アリルイソチオシアネート（AITC、100μM）、選択的なTRPA1アゴニストの1秒のパフアプリケーションによって誘発される内向き電流（260 PA）を示しました。内向き電流は、選択TRPA1アンタゴニストによってブロックされた電流を確認10μMのHC 030031（データは示さず）、TRPA1受容体によって媒介されるとDRGニューロンのTRPA1受容体の存在を確立しました。
図1： 無傷のDRGの調製 （A）椎弓切除後の脊髄の暴露とのDRGのセグメンテーション。右から左への矢印は、それぞれL3-5のDRGを示しています。スケールバー= 1 cmです。脊髄を除去した後、L3、L4、およびL5 DRGをおよび取り付けられた神経根の（B）暴露。矢印は右から左にL3、L4、L5とのDRGをを示しています。スケールバー= 1 cmです。 （C）インタ脊髄から解剖された後に取り付けられた神経根付きのCTのDRG。矢印は右から左へL4とL5のDRGを示しています。スケールバー= 1 cmです。 （D）添付の神経上膜で無傷のDRG。この絵では、神経上膜はそのままで、黄色の矢印は、デュモン鉗子によって保持された半透明の神経上膜を示しています。黒い矢印は、神経上膜を剥離するための良い出発点としての役割を果たす後根および前根、によって形成された接合を示しています。スケールバー= 1ミリメートル。 （E）神経上膜と前根後に取り付けられた後根と同じDRGは削除されました。スケールバー= 1ミリメートル。コラゲナーゼによる消化以下のDRGの（F）赤外線顕微鏡画像。中小ニューロンが表示されます。衛星グリア細胞（黄色の矢印）は、ニューロン（アスタリスク）を囲む表示されます。ピペットへの赤い矢印ポイント。 =10μmのスケールバー。 （G）録音機器構成。黒い矢印は目を示しています電子ピペットホルダー。左の1が薬剤充填したピペットを保持しており、記録ピペットが右側にあります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2： 電流クランプモード （A）基電流における神経細胞の興奮性の測定は、DRGニューロン（上パネル）への電流の一連を注入することによって測定しました。下部パネルの矢印で示すように活動電位を誘導することができる最低の電流強度を、基電流として定義されます。このニューロンのための基電流は300 pAです。 （B）。膜閾値は、ランプ電流を注入することによって測定しました。上のパネルの破線によって標識として活動電位が誘発される電位は、膜の閾値として定義されます。このニューロンのための膜しきい値は-11.9 mVである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：小DRGニューロンにおけるリガンド誘導性の電流 1秒間グルタミン酸（1 mM）のか、アリルイソチオシアネート（TRPA1アゴニスト、AITC、100μM）のパフ・アプリケーションによって誘導される電流。どちらのアゴニストは、小DRGニューロン上のグルタミン酸受容体とTRPA1受容体の存在を示唆し、内向き電流を誘導しました。グルタミン酸アプリケーション198 PA（A）の内向き電流を誘導し、AITC 260 PA（B）の内向き電流を誘発しました。ニューロンは-70 mVのにクランプされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 </ P>
| 10倍の低カチオン株式の2リットル | |||
| 最終濃度（mM）の | 成分 | MW | 重量（g） |
| 3 | 塩化カリウム | 74.6 | |
| 11 | グルコース | 180.2 | |
| 123 | NaClを | 58.4 | |
| 1.25 | NaH 2 PO 4 *のH 2 O | 138 | |
| 1 | MgCl 2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| 2 | CaCl 2・2H 2 O | 147 | |
表1
| 10倍の重炭酸塩株式の1リットル | |||
| 最終濃度（mM）の | 成分 | MW | 重量（g） |
| 26 | NaHCO 3 | 84.01 | 21.84 |
表2
| 細胞内液の100ミリリットル | |||
| 濃度（mM）の | 成分 | MW | グラム |
| 130 | KGluconate | 234.24 | |
| 10 | 塩化カリウム | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238.3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCl 2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| 注：KOHでpHを7.4に調整し、260への浸透圧 - スクロースおよび蒸留水で280ミリオスモル。すぐに使用する前に、2 mMのをMgATP、0.5mMののNa 2 GTPおよびフィルタを追加します。 | |||
表3
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Discussion
私たちは、パッチクランプ研究のための全体のDRGを調製するための方法を報告しています。理想的な試料を調製するためのいくつかの重要な要素があります。第一に、添付の背側根でのDRGを分析することが重要です。その後、神経上膜は、ニューロンへの損傷を回避しながら慎重に除去する必要があります。最終的に、ニューロンおよびその周囲の衛星グリア細胞が露出するように、残りの結合組織を消化することが必要です。ここで説明する方法を用いて調製成体ラットから無傷のDRGは、6〜8時間の良好な生存率を維持し、安定している期間中に記録することができます。彼らは、ニューロンまたは衛星グリア細胞のパッチクランプ記録を含むDRGを、多くの異なる研究のために使用される、またはDRGニューロンの応答を誘発することができます。
解剖手順の間、すぐにDRGを解剖し、神経細胞の代謝を遅くするために、低温（4 O℃）でそれを維持することが重要であるので、その生存能力を維持しています。 Tの間に彼のDRGの解剖、1は、背側またはのDRGを入力脊髄神経を伸ばし避けるべきです。この準備のもう一つの重要なステップは、DRGの周囲の神経上膜の除去です。神経上膜が浸透することは困難であるため、DRG上に残っている任意の神経上膜は、ニューロンに到達するパッチピペットを防ぐことができます。コラゲナーゼの適用は成功準備のための重要なステップです。コラゲナーゼは、成功したパッチ適用のために重要であるどちらも、残りの神経上膜を消化すると同時に、細胞の表面をきれいにします。組織の過剰消化を回避するために、3つの要因が考慮される必要があります。まず、コラゲナーゼは、いくつかの異なる形態で提供されます。私たちの推薦のための材料の表を参照して、現在使用されている1は、このように過剰消化を回避し、強力なしかし穏やかです。第二に、酵素は、記録領域を超えた酵素の分散を避けるために軽い圧力で供給されるべきです。我々は、0.5ミリリットルを適用することから生じる圧力を発見しました1ミリリットル注射器のうちIRは十分です。第三に、コラゲナーゼのための最高の濃度範囲は10から13単位/ mlからです。より低い濃度が不必要に長い消化時間を必要とする一方で、より高い濃度は、過消化と組織のより速い劣化につながる可能性があります。私たちの経験では、13単位/ mlと約15分で最高の結果を生み出す消化時間の濃度。酵素を適用した後、DRGを取り巻く残りの神経上膜が緩んべきであり、穏やかな吸引離れてクリアすることができます。コラゲナーゼは、従って、一旦酵素溶液をアリコートに分け、3週間以内に使用すべきで希釈し、凍結 - 解凍サイクルを繰り返すことが敏感です。
張らは、無傷のDRGからパッチクランプ記録のための方法を記述した最初の。それらが使用されるラットは、しかしながら、20（10-15日生後）非常若かったDRGを、彼らは薄いエピを有することを考える準備が容易であるという利点を有していますneuriumと、彼らは増加生存能力を持っています。新生児ラット由来のDRGを、しかし、TRPV1およびNaV1.8様タンパク質とイオンチャネルの発現が成体ラット21,22のものとは異なるという欠点を持っています。また、行動的および薬理学的研究は、通常、成体ラットで実施されています。したがって、ここでは詳細な記録方法は、成体動物における電気生理学と行動との相関関係を作ることができます。 ex vivoでのパッチクランプ記録を行うための準備として、無傷の後根神経節の使用は、最近15-17,23,24を増加し、いくつかの研究は、 インビボ記録 25 に使用しました。 ex vivoでの録音のほとんどは、約30〜60分のための酵素カクテルに全体DRGをインキュベートすることにより、DRGニューロンを公開します。この方法は多くの神経細胞を生成するが、それは過剰消化表面層におけるニューロンの危険性を有しています。我々の方法は、exを監視するために目視検査を使用して、過剰消化の可能性を最小限に抑えます消化の10トン、また、in vivoでの録音25マーらが使用した方法。
解離したDRGニューロンと比較して、無傷のDRG調製物の利点の一つは、ニューロンと衛星グリア細胞の両方の保存（ 図1）から来ます。これは、解離したDRGニューロンを用いた従来の製剤のケースではありません。衛星グリア細胞は、個々のDRGニューロンを囲むバリアを形成し、それらの存在は、これらのニューロン13の生理的な環境を維持するために不可欠です。結果で述べたように、この手段により調製ニューロンの電気生理学的特性は、解離した細胞を用いた研究により得られたものとは異なります。
この準備のための最も興味深い今後の方向性の一つは、DRGニューロンと衛星グリア細胞間のクロストークを検討することです。神経損傷後、例えば、衛星グリア細胞は、Tが示されていますO 13-15,26をすさまじい痛み行動に密接に関連しているプラスチック製の変化を受けます。無傷のDRGにおける衛星グリア細胞の保存は、送信機のようなグルタミン酸受容体などの受容体、またはATP受容体が衛星グリア細胞上に存在するかどうか、およびそれらが神経活動の変化にどのように応答するかを決定することが可能となります。衛星グリア細胞にパッチを適用すると同時に、神経細胞を刺激することによって、衛星グリア細胞は、生体センサとして機能し、近くのニューロンからの伝達物質の放出があるかどうかを示すことができます。さらに、無傷のDRGの準備は、求心性と遠心性神経根の両方を保持します。これは、大幅にin vivoでの状況をよりよく模倣されるであろう、吸引電極と神経細胞に入るか出る軸索を刺激する可能性を追加することで、実験的な範囲を拡大します。
現在の準備にはいくつかの制限があります。衛星GLIによって形成された障壁の存在アル細胞は、パッチのニューロンにそれがより困難になり、一つは、それが神経細胞に到達する薬物の濃度を制限する可能性があることに注意してください。したがって、我々の調製においてニューロンへのアクセスを獲得することは、衛星グリア細胞層を貫通助けるために陽圧下でピペットを維持することが重要です。別の制限は、後根や脊髄神経がDRGを解剖するためにカットしなければならないことです。したがって、完全に無傷の軸索を残すことは不可能です。末梢または中枢軸索は電圧クランプを行う際の潜在的な記録エラーや干渉を引き起こす可能性ソーマ、同じ電圧にクランプされないことがありますようにしかし、残りの軸索の存在が、考慮すべきです。また、神経細胞の良好な露出を得るために、コラゲナーゼと穏やかな消化が必要であり、これは経験を制御することができるが、完全に消化酵素への曝露からニューロンを保護することは不可能です。従来のDと比較してissociated DRGニューロンは、しかしながら、全体のDRGが（30分の周囲）を調製するために高速であり、多くのアプリケーションおよびインビボ条件下で厳密に模倣して使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
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