Abstract
从背根神经节膜片钳研究（病种付费）神经元增加了我们周围神经系统的理解。目前，大部分的录音是在解离的DRG神经元，这是大多数实验室标准制剂进行。神经元特性，然而，可以通过从在获取解离的神经元使用的酶消化所得轴索损伤改变。另外，解离的神经元制剂不能完全代表DRG的微环境，因为与环绕初级感觉神经元卫星细胞接触的损失是这种方法的不可避免的结果。为了克服在使用传统的分离DRG神经元膜片钳记录，本报告中的局限性，我们描述编写完整的按病种付费和个人的初级感觉神经元在体外进行膜片钳记录的方法。这种方法可以完整的DRG的快速和简单的准备， 在模仿体内通过保持与周围卫星细胞和基底膜相关的背根神经节的条件。此外，该方法从操作避免性轴索损伤和酶消化这种游离病种付费时。此体外制剂可以附加地用于研究初级感觉神经元和卫星细胞之间的相互作用。
Introduction
感觉是一个有机体的生存和健康的基石。刺激的传输依赖于起始于从初级感觉神经元轴突的周神经末梢的感觉通路。初级感觉神经元，与三叉神经的脑核外，位于三叉神经节和背根神经节（背根节）。他们担任的感官信息1看门人。在perikarial膜，正如在中央和外围终端，DRG神经元表达的受体和离子通道，例如谷氨酸受体，TNFα的受体，瞬时受体电位阳离子通道亚家族V部件1（TRPV1），钠通道等 2 -7。在perikarial膜的膜片钳记录可以理解许多这些受体和渠道遍布神经细胞的功能变化。
膜片钳记录技术是STU一个强大的工具垂死的通道或受体和大量的研究活动已被应用在背根神经节8-10这项技术进行的。在大多数研究中，DRG通过切割背侧支根和脊神经靠近神经节除去。切碎后，将神经节然后被放置在导致DRG神经元，然后可记录之前立即或培养记录数天的分解酶。不幸的是，DRG神经元的解离涉及接近胞体的必要干切断。一旦分离和金黄地鼠，DRG神经元发生在膜兴奋11,12的表型变化以及变化。通常围绕它们单个神经元的胞体和卫星细胞之间的接触的损失是可能有助于这些变化13。神经元和卫星细胞之间的串扰是生理条件缺一不可，并在适应patholog的iCal条件如那些导致顽固性疼痛14,15。这将是具有挑战性的，研究使用解离的DRG制备神经元和卫星细胞之间的相互作用。
完好的DRG，另一方面，提供接近体内条件。在过去的几年里，我们的实验室，以及一些其他基团，一直使用从成年大鼠完整的DRG以调查在慢性疼痛3-5,11,15-17相关联的不同条件的初级感觉神经元的变化。虽然在这些研究中所使用的技术是有些建立，步骤一步描述尚未公布。在本手稿中，我们描述了一个方便，快捷的方式准备完整的按病种付费和他们的膜片钳记录使用。
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Protocol
伦理声明：维护和使用实验动物的所有程序符合UCSF委员会对动物研究的法规，按照美国国立卫生研究院的规定动物使用和保养（出版85的指导方针进行了 - 23日，1996年修订）。加州大学旧金山分校的机构动物护理和使用委员会批准在这项研究中所使用的协议。
1.仪器，解决方案和准备餐具
- 准备人工脑脊液（学联）。
- 制备500毫升10×低阳离子溶液，和500毫升的10倍的碳酸氢盐溶液（ 见表1和2的溶液制剂）。保存在4℃，使用一个月内。
- 通过将60毫升的10倍低的阳离子溶液用60ml碳酸氢钠溶液制备600毫升新鲜脑脊液中，然后添加480毫升去离子水以达到600毫升最终体积。泡泡学联与卡波（5％O 2和95％的CO 2），用于在使用前至少10分钟。
- 从玻璃毛细管拉补丁吸管。
- 将薄壁毛细玻璃成吸管拉马准备录音移液器。
注：在我们的实验室中，拉马以下设置参数来达到理想的吸管状：热（510），速度（32）。为完整DRG记录了理想吸管形状应具有低的锥角逐渐细长锥形的，这最好通过试验和错误来达到。 - 确保该吸管的电阻为3-5兆欧时填充有内部溶液（见溶液制备表3）。请参考轴突指南测量吸液管电阻18的详细方法。
- 将薄壁毛细玻璃成吸管拉马准备录音移液器。
- 1毫克胶原酶添加到400μl的脑脊液的，得到的13单位/ ml的最终浓度。然后填写与约20微升胶原溶液各玻璃吸管。商店在-20℃下冷冻填充移液管和三周内使用它们。
- 制得200毫升冷学联（约4℃）的。为了冷却学联迅速将其放入烧杯中，用密封在-20℃下冷冻保鲜膜和地点约20分钟，直到它开始冻结。放置在冰浴中和气泡与卡波金的烧杯10分钟。泡在室温其余400毫升学联与卡波。
- 而脑脊液被冷却，切一次性塑料移液管的端部以放大的开口到一个直径为5毫米（这将被用于传输DRG）。收集以下手术器械：手术刀（＃15），梅奥直，弯剪，精2毫米尖咬骨钳，斜角肌挤压（齿）镊子，虹膜剪，弹簧剪刀和两个细镊子。倾含氧冷脑脊液成3玻璃培养皿（外径：10厘米）。
2. DRG解剖
- 麻醉大鼠（200-220 g）在PE钠ntobarbital（100毫克/千克，IP）并确认麻醉水平是通过测试脚蹬反射和眨眼反射足够。
- 验证将大鼠麻醉后，刮胡子腰部区域和切开沿中线的皮肤和皮下组织。从分离的L1-S2级棘突用细骨膜椎旁肌。
- 用弯剪从L1棘突削减到S2。使用直梅奥剪刀尽在暴露脊柱约为L1和S1横向切口，取出脊柱的这一部分整块并迅速淹没到冷学联（步骤1.5准备），2-3分钟。在排除腰病种付费的，安乐死是通过双边开胸进行，而老鼠仍然是深戊巴比妥麻醉下。
- 冲洗掉从去除脊柱的血液和连接的组织，并转移到陪替氏培养皿用冷脑脊液。 ü瑟细咬骨钳去除薄层。切割沿中线硬膜与microscissors以暴露脊髓。轻轻抬起脊髓，并使用虹膜剪脊髓切断神经根在他们的切入点，然后取出脊髓。
- 转移与按病种付费其余椎骨充满冷学联第二培养皿。识别L4和根据它们的相对位置，以横突和坐骨神经L5的DRG。
注：维护坐骨神经完好无损将有助于确定L4和L5 DRG（坐骨神经从L4-6脊神经起源）。 - 使用杜蒙钳和剪刀诺伊斯从周围结缔组织释放病种付费。保持神经根和脊髓神经连接到病种付费。
- 用移液管的病种进入第三培养皿进一步解剖。
- 根据解剖显微镜，小心地取出尽可能的周围神经外膜的第ËDRG。
- 使用诺伊斯弹簧剪刀剪一开口，其中背部和腹部的根加入DRG，并从DRG分离神经前根。使用杜蒙＃5镊子钝头举行外膜，并用另一细镊子从滚神经外膜的DRG。
- 继续尽可能的外膜去除附着使用细镊子病种付费。
注意：良好的解剖DRG重要的是要获得在下一步骤良好的消化。
3. DRG消化
- 转移DRG到记录室中。使DRG，其中神经根起源的面孔下来肯定的一面。
注意：以这种方式，大部分神经元访问。 - 使用锚来稳定DRG。灌流DRG含氧脑脊液在通过用蠕动泵，它被放置在一个表旁边的记录钻机相连的塑料管以0.5ml / min的速率。
- 等待30分钟，以使细胞恢复。通过CCD摄像机评估DRG的红外下差分接口对比在40倍物镜放大倍率的质量（IR-DIC）光学元件。
注：按病种付费好通常包含很多轮，以及对比，神经元卫星细胞在其表面所包围。 - 消化的DRG的表面的一个小区域。
注意：玻璃补丁移液器置于吸移管座，这是小接头允许管被附连到玻璃吸管与一个气密密封。- 通过个别小口径橡胶管的两片连接两个1毫升注射器移液器持有人。把充满胶原酶入吸管持有者之一和一个空玻璃吸管成其他一一玻璃吸管。
- 使用显微操作的移液管的位置就在上面的DRG。然后，在显微镜下放大，相互碰撞轻轻2移液器的尖端放大枪头（理想的情况下，直径为5-的开口10微米）。
- 移动填充有酶移液器靠近DRG的表面，并简要通过管连接支架和通过移动柱塞约0.5ml注射器施加正压到含有吸管胶原酶。
注意：在压力下，酶的从吸管该流程将略有放大DRG神经元，其可作为标志酶的应用之间的空间。 - 后10至15分钟，观察到剩下的外膜的碎片时，施加轻柔负压空吸管吸走的碎屑。
注意：在这种方式中，神经元和周围卫星细胞会清楚暴露并准备补丁记录。 - 丢弃这两个吸管放入锐器容器。
4.膜片钳记录
- 放置电极溶液（ 见表3）在冰上，以防止降解。装满玻璃的补丁吸管过滤细胞内溶液（注射器过滤器，孔径：0.2微米），并放置在探头吸管保持器吸管。通过降低吸移管到浴溶液中之前位移约1ml柱塞施加到吸管轻柔正压通过5毫升注射器。
注意：这可以防止吸移管从被堵塞。 - 选择将模式旋钮放大器上的“V-钳”模式，然后在软件中打开“膜测试”接口。靠拢在显微镜下检查目标神经元的吸管。
注意：在完整的DRG制备，卫星细胞的薄层封装每个神经。 - 使用从吸管正压遍历卫星细胞层直至神经元和卫星细胞的周围层之间空间的突然放大观察。继续前进对神经元的吸管，直到“酒窝”是在神经元观察到。
注：与比较从解除关联神经元的录音，正压需要是稍微大，这将有助于穿透卫星细胞层和增加成功的修补的机会。 - 降低正压力。其次，实现了千兆欧姆密封，轻轻吸气。
注意：在此方法中，记录的成功率是至少70％。 - 如前面19所描述获得全细胞记录的配置。
- 简单地说，通过一个简短而强劲吸力穿透神经细胞膜。可替代地，当施加抽吸使用放大器上的“扎普”功能。
- 一旦全细胞模式被建立，通过在放大器转动电容和电阻补偿旋钮补偿全细胞电容和串联电阻（Rs）。
注：RS通常是5-20MΩ。 - 摒弃细胞如果Rs最初是大于30兆欧;或Rs中的记录过程中超过20％的变化。也测量静息膜电位;放弃的小区，如果静息膜电位是超过-50毫伏。
- 关闭“膜测试”窗口。通过转动模式旋钮放大器选择“我钳位正常”模式。
- 点击“开放协议”的软件，选择并加载协议用于测量rheobase。点击“记录”开始录制。测量输入电阻和rheobase通过注入分级系列在100 Pa的步骤去极化电流检查神经元兴奋性。
- 再次单击“开放协议”，并选择用于测量膜门槛的协议。一个500毫秒的去极化电流斜坡（2,000 PA / S）将被注入到神经元。
- 使用数据采集和分析软件（ 例如 Clampfit）根据制造商的说明来分析所记录的痕迹。使用该软件的稳态IV RELAT的基础上计算的输入电阻值（R in）交付的超极化电流时ionship。移动光标来衡量rheobase和膜的阈值。
注意：以诱导该AP所需的电流的幅度被定义为rheobase，以及用于诱导的AP的最低电压被定义为膜的阈值。
- 记录的配体诱导电流。
- 填与特异性激动剂吸管。
注意：在当前的报告中，我们使用100μM的谷氨酸和100μMAITC诱导分别由谷氨酸受体和TRPA1受体介导的电流。 - 检查吸管，以确保里面没有气泡。放置在移液管固定器的吸移管。吸管保持器连接与连接到药物分配系统的管。
- 使用操纵器中的神经元的50微米移动吸移管。设置药物分配系统的压力为1磅和持续时间为1秒。切换记录模式到电压钳，和在-70mV夹紧。简要地通过药物分配系统施加压力来记录一个药物诱导的电流。
- 填与特异性激动剂吸管。
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Representative Results
图1显示了制备完整的DRG补丁记录的过程。 图1A示出椎板切除。 图1b后神经节的曝光和位置表示的L3，L4和L5的DRG以除去脊髓后附的神经根。然后L4和5的DRG仔细解剖并从椎骨释放。接着，将神经外膜，围绕DRG的透明膜被去除（黄色箭头， 图1D）。到神经外膜分离的最佳位置是通过那里的背侧和腹侧根部加入在DRG的部位，由图1D中的黑箭头所示。剥离外膜之后，将前根被除去并弃去，留下的背侧支根，脊神经和背根神经节中， 如图1E所示。消化胶原酶去除残留的外膜，暴露神经元和卫星细胞Ť帽子包围他们（ 图1F）。
完成DRG制备后，小直径的DRG神经元的兴奋性是通过测量rheobase和膜阈检查。 如图2A所示，rheobase是260 pA的。 图2B示出用该方法测得的膜的阈值。随着增加的电流，该膜连续地去极化直到一AP诱发。在本实施例的膜的阈值（在该AP上诱发电位）为-11.9毫伏。因此，通过保持神经元和卫星细胞之间的关系，我们的制备更接近的体内状况。根据我们的结果，从小DRG神经元记录在rheobase是约300 pA的，和输入电阻是451.3±27.3兆欧。两者都高于那些分离测量神经元（约150 pA及635MΩ）相比，这该离解增加DRG神经元11的兴奋性。
与此制剂中，我们还测定由谷氨酸和烯丙基异硫氰酸酯（AITC）诱导的向内的电流，这对于谷氨酸受体和分别瞬时受体电位阳离子通道构件A1（TRPA1）激动剂。由这些配体诱导的内向电流的幅度将反映分布于神经元的受体的数量。 图3A示出了在由谷氨酸的1秒粉扑应用（1毫米）诱导的一小直径的DRG神经元的向内的电流。谷氨酸诱导的内向电流（198帕），它可以在很大程度上阻止由NMDA受体拮抗剂APV和AMPA /红藻氨酸盐受体拮抗剂CNQX（数据未示出）的共施用，确认当前是通过在DRG谷氨酸受体介导的神经元。这个数据证实，有上DRG神经元功能的谷氨酸受体。网元在图3B所示uron表明通过异硫氰酸烯丙酯（AITC，100μM），选择性TRPA1激动剂1秒粉扑应用诱导的内向电流（260帕）。 （数据未显示）的向内的电流阻断选择性TRPA1拮抗剂10μM的HC 030031，证实了电流通过TRPA1受体介导，并建立TRPA1受体在DRG神经元的存在。
图1： 按病种付费的完整的制备 （A）椎板切除术后脊髓背根节和的分割曝光。从右到左箭头分别指示L3-5病种付费。比例尺= 1厘米。 （B）中除去脊髓后L3，L4和L5的DRG和所附神经根的接触。箭头指示由右至左L3，L4和L5的DRG。比例尺= 1厘米。 （C）英塔按病种付费的CT与脊髓被解剖后，连接神经根。箭头指示由右至左L4和L5的DRG。比例尺= 1厘米。 （D）完整DRG附带神经外膜。在这张照片中，外膜是完好的，并且在黄色箭头示出了由杜蒙钳保持半透明外膜。黑色箭头表示通过背根和前根，这是一个很好的起点，剥离神经外膜形成的交界处。比例尺= 1毫米。 （ 五 ）同一DRG的神经外膜和前根后附背根已被删除。比例尺= 1毫米。下面用胶原酶消化DRG的（F）红外显微镜图像。小型和中型的神经元是可见的。一个卫星细胞（黄色箭头）是可见的周围神经元（星号）。红色箭头指向移液管。比例尺= 10微米。 （G）录音设备的配置。黑色箭头指示次Ë吸管持有人。左边一人持有毒品充满吸管，并记录电极是在右边。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 神经元兴奋性的在电流钳模式 （A）的 Rheobase 测定是通过注射一系列的电流的进入DRG神经元（上面板）进行测定。最低的电流强度，其可以诱导动作电位，被定义为rheobase，通过在下部面板的箭头所示。这个神经元的rheobase为300 pA的。 （B）。膜阈通过注射斜坡电流测量。的潜力，当一个动作电位诱发，被定义为膜的阈值，通过在上面板中的虚线标示。这个神经元细胞膜的阈值为-11.9毫伏。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：在小DRG神经元配体诱导电流为1秒诱发谷氨酸粉扑应用（1毫米）或烯丙基异硫氰酸酯（TRPA1受体激动剂，AITC，100μM）电流。这两种受体激动剂引起的内向电流，这表明谷氨酸受体和受体TRPA1的小背根神经元的存在。谷氨酸诱导应用198 PA（A）的内向电流，并诱发AITC 260 PA（B）的内向电流。神经元是在-70 mV的钳制。 请点击此处查看该图的放大版本。 </ P>
| 2升10倍低阳离子股票 | |||
| 最终浓度（MM） | 零件 | MW | 重量（g） |
| 3 | 氯化钾 | 74.6 | |
| 11 | 葡萄糖 | 180.2 | |
| 123 | 氯化钠 | 58.4 | |
| 1.25 | 和 NaH 2 PO 4 * H 2 O | 138 | |
| 1 | 氯化镁2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| 2 | 氯化钙2 * 2H 2 O | 147 | |
表格1
| 1升10倍碳酸氢库存 | |||
| 最终浓度（MM） | 零件 | MW | 重量（g） |
| 26 | 碳酸氢钠 | 84.01 | 21.84 |
表2
| 100毫升细胞内液 | |||
| 浓度（mM） | 零件 | MW | G |
| 130 | KGluconate | 234.24 | |
| 10 | 氯化钾 | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238.3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | 氯化镁2 * 6H 2 O | 203.3 | |
| 注意：调节pH至7.4，用KOH，和摩尔渗透压浓度至260 - 280毫渗透摩尔浓度与蔗糖和蒸馏水。立即使用前加入2毫米MgATP，0.5毫米的 Na 2 GTP和过滤器。 | |||
表3
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Discussion
我们报告准备膜片钳研究整个病种付费的方法。有用于制备理想的检体的几个关键要素。首先，与附后根解剖的DRG是重要的。在此之后，神经外膜需要避免对神经元损害，同时要小心除去。最后，以暴露的神经元和其周围卫星细胞，有必要以消化剩余的结缔组织。从这里所描述的方法制备的成年大鼠完整的DRG将保持良好的生存力为6至8小时，并且可以在该期间稳定地记录。它们可用于诊断相关组的许多不同的研究包括对神经元或卫星神经胶质细胞，或DRG神经元的诱发反应膜片钳记录。
在解剖过程中，它可以快速解剖DRG，并保持它在低温（4℃），以减缓神经元代谢是非常重要的，并因此保持其可行性。在t他按病种付费的解剖，应避免伸展背部和脊柱神经进入病种付费。在此制备的另一个关键步骤是去除包围DRG神经外膜的。由于神经外膜难以穿透，残留在DRG任何外膜将防止补丁移液器到达神经元。胶原酶的应用是成功的准备的重要一步。胶原酶将消化剩余的外膜，并在同一时间清洗细胞的表面上，这两者都是成功的修补的关键。以避免组织的过度消化，需要考虑三个因素。首先，胶原酶有几种不同的形式;见材料为我们的推荐表，目前所使用的是有效的，但温柔，从而避免过度消化。第二，酶应在光压力被传递到避免超出记录区域的酶的分散。我们已发现，从施加加入0.5ml一个产生的压力IR输出的1ml注射器的是足够的。第三，对于胶原酶最好的浓度范围是从10-13单位/ ml。较高浓度可能会导致过度消化和组织的较快降解，而较低的浓度涉及的不必要的长的消化时间。根据我们的经验，13单位/ ml的浓度和消化时间约15分钟产生最好的结果。施加酶后包围DRG剩余外膜应该变得松散，并且可清掉轻柔的吸力。胶原酶是重复冻融循环敏感，因此，一旦稀释酶溶液应分为等分并在3周内使用。
小张和同事们首次从完整的DRG描述膜片钳记录的方法。这具有的优点在于所述的DRG更容易他们使用的大鼠，然而，非常年轻（10-15天产后）20至准备给予它们具有较薄的外延neurium并且它们具有增加的存活力。的DRG从新生大鼠，但是，具有的缺点是蛋白质和离子通道像TRPV1和NaV1.8的表达从这些成年大鼠21,22的不同。此外，行为和药理研究成年大鼠通常进行的。因而记录在这里详述的方法允许使成年动物电生理和行为之间的相关性。作为制剂使用完整背根神经节的进行膜片钳记录离体最近已增加15-17,23,24和一些研究体内录音25使用。大多数体外的录音通过培养整个DRG成酶合剂周边30-60分钟暴露DRG神经元。虽然这种方法产生更多的神经元，它具有过度消化在浅层神经元的风险。我们的方法通过目测来监测前减少过度消化的可能性消化的帐篷也使用Ma 等人 在体内的记录25的方法。
与离解的DRG神经元相比，完整的DRG制剂的优点之一来源于神经元和卫星细胞（ 图1）的保存。这不是在常规制剂使用解离的DRG神经元的情况下。卫星细胞形成包围单个DRG神经元的屏障，并且它们的存在是为维持这些神经元13的生理环境至关重要。如在结果指出由该制备神经元的电生理特性是指从利用解离细胞研究中所获得的不同。
其中该制剂中最有趣的未来发展方向是调查DRG神经元和卫星细胞之间的串扰。神经损伤后，例如，卫星细胞已被Ť所示Ø发生塑性变化，这是密切相关的随之而来13-15,26痛苦的行为。卫星细胞的完整的病种付费保存，将使我们能够确定递质受体，如谷氨酸受体，或ATP受体是否存在对卫星细胞以及它们是如何应对的神经元活动改变。通过贴敷卫星细胞并同时刺激神经元中，卫星细胞可以作为生物传感器，并显示是否有来自附近的神经递质释放。此外，完整的DRG准备既保持传入和传出神经根。这通过添加刺激轴突进入或与抽吸电极，这将是一个更好地模拟体内情况离开神经元的可能性大大地扩展了实验范围。
有当前准备一些限制。阻挡由卫星GLI形成的存在人的细胞，使得它更难以给贴片的神经元和一个应该知道它可能限制药物到达神经元的浓度。因此，为了获得在我们的制剂中的神经元，以保持在正压下的移液管，以帮助穿透卫星细胞层是重要的。另一个限制是，背根和脊髓神经有以剖析出DRG进行切割。因此，它是不可能离开轴突完全完好无损。然而，剩下的轴突的存在下，应考虑，作为外周或中枢的轴突可能不被夹持到相同的电压胞体中，当电压钳中进行，可能导致潜在的记录错误或干扰。也为了得到神经元的良好的曝光，温和消化用胶原酶是必要的，尽管这可以用经验来控制，这是不可能完全保护神经元免于暴露于消化酶。与传统D相比，issociated DRG神经元，但是，整体的DRG更快以制备（约30分钟），可以在许多应用中，并在体内条件密切模仿使用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
