Abstract
Патч зажим исследования от спинальных ганглиях (КСГ) нейронов увеличили наше понимание периферической нервной системы. В настоящее время большинство записей проводятся на диссоциированных нейронов DRG, который является стандартным для большинства подготовка лабораторий. Нейронные свойства, однако, может быть изменена путем аксонального повреждения в результате ферментативного расщепления, используемой в получении диссоциированных нейронов. Кроме того, диссоциированные нейронные препараты не могут в полной мере представляет микроокружение DRG, так как потеря контакта с спутника глиальных клеток, которые окружают первичные сенсорных нейронов является неизбежным следствием этого метода. Чтобы преодолеть ограничения в использовании обычных диссоциированных нейронов DRG для патч зажим записи, в настоящем докладе мы опишем метод , чтобы подготовить нетронутыми ДРГ и провести патч зажим записи на отдельных первичных сенсорных нейронов бывших естественных условиях. Такой подход позволяет быстро и прямой получение неповрежденных КСГ, имитируя вVivo условия путем поддержания DRG нейроны , связанные с окружающими их спутника глиальных клеток и базальной мембраны. Кроме того, способ позволяет избежать аксонального повреждения от манипуляций и ферментативному перевариванию, например, когда диссоциирует ДРГ. Этот препарат ех естественных условиях дополнительно может быть использован для изучения взаимодействия между первичными сенсорными нейронами и спутниковых глиальных клеток.
Introduction
Ощущение имеет важное значение для выживания организма и хорошего самочувствия. Передача раздражителей зависит от сенсорных путей, начинающихся в периферических окончаниях аксонов из первичных сенсорных нейронов. Первичные сенсорные нейроны, за исключением среднего мозга ядра тройничного нерва, расположены в тройничного ганглиев и ганглиях задних корешков (DRG,). Они служат в качестве хранителей сенсорной информации 1. На perikarial мембране, так же , как в центральных и периферийных терминалов, DRG нейроны экспрессируют рецепторы и ионные каналы, такие как глутаматных рецепторов, TNF альфа - рецепторов, преходящие потенциал рецепторов катиона канала подсемейства V члена 1 (TRPV1), натриевые каналы и т.д. 2 -7. Зажим записи патч этого perikarial мембраны позволяют понять функциональные изменения многих из этих рецепторов и каналов по всему нейрону.
Метод записи патч зажим является мощным инструментом для СТЮумирающих деятельность каналов или рецепторов , а также большое количество исследований было проведено с применением этой техники на DRG нейроны 8-10. В большинстве исследованиях DRG удаляется путем разрезания спинных корешков и спинного нерва близко к ганглии. После того, как мясорубки, ганглий затем помещают в пищеварительные ферменты, которые приводят к диссоциации нейронов DRG, которые затем могут быть записаны непосредственно или культивируют в течение нескольких дней до начала записи. К сожалению, диссоциация нейронов DRG включает в себя необходимую аксотомии близко к perikarya. После того, как диссоциирует и аксотомизированных, DRG нейроны подвергаются фенотипические изменения, а также изменения в мембранной возбудимости 11,12. Потеря контакта между perikarya отдельных нейронов и спутниковых глиальных клеток , которые обычно окружают их, скорее всего , внести свой вклад в эти изменения 13. Перекрестные помехи между нейронами и глиальных клеток спутника является одновременно существенным в физиологических условиях и в адаптации к pathologческие условия , такие как те , что приводит к неразрешимой боли 14,15. Было бы сложно изучить взаимодействие между нейронами и спутниковых глиальных клеток с использованием диссоциированного препарата DRG.
Интактные DRGs, с другой стороны, обеспечивают ближе к условиям , в естественных условиях. За последние несколько лет наша лаборатория, а также некоторые другие группы, использует неповрежденные ДРГ от взрослых крыс , чтобы исследовать изменения первичных сенсорных нейронов в различных состояниях , связанных с хронической болью 3-5,11,15-17. Хотя методы, используемые в этих исследованиях несколько установлено, описание шаг за шагом до сих пор не опубликованы. В данной рукописи, мы описываем удобный и быстрый способ подготовить нетронутыми ДРГ и их применение для патч зажим записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика Заявление: Все процедуры по техническому обслуживанию и использование экспериментальных животных соответствовали правилам UCSF комитетов по научным исследованиям животных и были проведены в соответствии с руководящими принципами правил NIH по использованию и уходу (публикация 85 животных - 23, перераб 1996 ). Institutional Animal Care и использование Комитет UCSF одобрил протоколы, используемые в данном исследовании.
1. Подготовка инструментов, решений и мытья посуды
- Подготовка искусственного спинномозговой жидкости (ACSF).
- Приготовьте 500 мл 10х низкого раствора катионов и 500 мл 10х раствора бикарбоната (см Таблицу 1 и 2 для приготовления раствора). Хранить при температуре 4 ° С и использовать в течение одного месяца.
- Приготовьте 600 мл свежей ACSF путем смешивания 60 мл 10Х низкого раствора катиона с 60 мл раствора бикарбоната, а затем добавляют 480 мл деионизированной воды, чтобы достигнуть конечного объема 600 мл. Пузырькового ACSF с карбогена(5% O 2 и 95% СО 2) в течение по крайней мере , 10 мин перед использованием.
- Потянуть Patch Pipette из капиллярного стекла.
- Поместите тонкостенную капиллярное стекло в пипетку съемник для подготовки записи пипеток.
Примечание: В нашей лаборатории следующие настройки параметров съемника используются для достижения идеальной формы пипетки: тепло (510), скорость (32). Идеальная форма для дозаторов неповрежденной записи DRG должна иметь постепенное стройный гильза с углом конуса низким, и это лучше всего может быть достигнуто путем проб и ошибок. - Убедитесь , что сопротивление пипетки 3-5 МОм при заполнении внутренних решений (см таблицу 3 для приготовления раствора). Пожалуйста , обратитесь к руководству Axon для детального метода измерения сопротивления 18 пипеток.
- Поместите тонкостенную капиллярное стекло в пипетку съемник для подготовки записи пипеток.
- Добавляют 1 мг коллагеназы в 400 мкл ACSF, с получением конечной концентрации 13 ед / мл. Затем заполнить каждую стеклянную пипетку примерно 20 мкл раствора коллагеназы. хранитьзаполненные пипетки в морозильной камере C -20 ° и использовать их в течение трех недель.
- Приготовьте 200 мл холодной ACSF (около 4 ° С). Для охлаждения ACSF быстро поместить его в стакан, печать с полиэтиленовой пленкой и поместите в морозильную камеру C -20 ° в течение приблизительно 20 минут , пока он не начинает замерзать. Стакан помещают в баню со льдом и пузырь с карбогена в течение 10 мин. Пузырь оставшиеся 400 мл ACSF с карбогена при комнатной температуре.
- В то время как ACSF охлаждается, обрежьте пластиковой одноразовой пипетки передачи, чтобы увеличить отверстие диаметром 5 мм (это будет использоваться для передачи DRG). Соберите следующие хирургические инструменты: скальпель (# 15), Mayo прямые и изогнутые ножницы, тонкая 2 мм наконечник костными кусачками, Адсон (зубчатое) пинцеты, ножницы радужной оболочки глаза, пружинные ножницы и два тонких щипцов. Залить холодной насыщенной кислородом ACSF в 3 стеклянные чашки Петри (внешний диаметр: 10 см).
2. DRG Вскрытие
- Обезболить крыса (200-220 г) с полиэтиленовым натрияntobarbital (100 мг / кг, внутрибрюшинно) и убедитесь, что уровень анестезии является адекватным путем тестирования рефлекс педали и рефлекс моргания глаз.
- После проверки того, что крысы под наркозом, брить поясничной области и надрезать кожу и подкожные ткани вдоль средней линии. Отделить спинномозговых мышцы от отростков на уровне L1-S2 с помощью тонкой распатором.
- Используйте изогнутые ножницы, чтобы вырезать остистые отростки от L1 до S2. Используйте прямые ножницы Майо , чтобы сделать поперечные разрезы на пораженном позвоночнике приблизительно L1 и S1 и удалить этот сегмент позвоночного столба целиком и быстро погрузить его в холодную ACSF (полученного на стадии 1.5) в течение 2-3 мин. После удаления поясничных КСГ, эвтаназия осуществляется двусторонней торакотомии в то время как крысы все еще находится под глубокой анестезией пентобарбиталом.
- Промывка от крови из удаленного позвоночного столба и прикрепленную ткани и переносят в чашку Петри с холодной ACSF. Uсе прекрасный костными кусачками, чтобы удалить пластинки. Разрежьте твердую мозговую оболочку вдоль средней линии с microscissors подвергать спинной мозг. Аккуратно поднимите спинной мозг, и разрезают нервные корни в точке их входа в спинной мозг с помощью ножниц радужной оболочки глаза, а затем удалить спинной мозг.
- Перенесите оставшийся позвонка с ДРГ ко второй чашке Петри заполнены холодной ACSF. Определить L4 и L5 ДРГ в зависимости от их положения относительно поперечных отростков и седалищного нерва.
Примечание: Поддержание седалищного нерва нетронутыми поможет выявить L4 и L5 DRG (седалищный нерв берет свое начало от спинномозговых нервов L4-6). - Используйте Дюмон щипцов и ножниц Нойес, чтобы освободить ДРГ от окружающих соединительных тканей. Держите корень нерва и спинного нерва, прикрепленный к КСГ.
- С помощью пипетки передачи для перемещения ДРГ в третью чашку Петри для дальнейшего рассечения.
- Под микроскопом рассечение, тщательно удалить как можно больше из эпиневрии окружающего гое DRG.
- Используйте пружинные ножницы Нойес, чтобы сократить отверстие, где спинной и брюшные корни присоединиться к DRG и отделить вентральной корень от DRG. Используйте Дюмон # 5 щипцов с тупыми концами, чтобы держать эпиневрии, и использовать другой тонкий пинцет, чтобы катить DRG от эпиневрии.
- Продолжить, чтобы удалить как можно больше из эпиневрии прилагается к КСГ с использованием тонких щипцов.
Примечание: Хорошо расчлененный КСГ важно, чтобы получить хорошее пищеварение в следующем шаге.
3. DRG Переваривание
- Перенести DRG в записи камеры. Убедитесь, что на стороне DRG, где корни берут начало нервные лица вниз.
Примечание: Таким образом, большинство нейронов доступны. - Используйте якорь для стабилизации DRG. Заливать DRG с окисленной ACSF со скоростью 0,5 мл / мин через пластиковых труб, соединенных с использованием перистальтического насоса, который помещается на столе рядом с буровой установки записи.
- Подождите в течение 30 мин, чтобы позволить клеткам восстанавливаться, Оценка качества DRG под действием инфракрасной дифференциальный интерфейс контраста (ИК-ДИК) оптики при 40-кратном увеличении с помощью объективного ПЗС-камеры.
Примечание: Хорошие DRGs обычно содержит много круг, хорошо контрастируют нейроны, окруженные глиальных клеток спутников на ее поверхности. - Дайджест небольшую площадь поверхности DRG.
Примечание: Пипетки стеклянные патч помещают в держатели пипеток, которые являются небольшие муфты, которые позволяют трубы должны быть присоединены к стеклянной пипеткой с герметичной прокладкой.- Индивидуально соединить два 1 мл шприцы держателей пипетки через две части малого диаметра резиновой трубки. Поместите одну стеклянную пипетку, заполненную коллагеназы в один из держателей пипеткой и пустой стеклянной пипетки в другую.
- Используйте микроманипулятор расположить пипеток прямо над DRG. Затем, под микроскопом с увеличением, сталкиваются кончики двух пипеток по отношению друг к другу нежно, чтобы увеличить отверстия пипеток (в идеале диаметром 5-10 мкм).
- Перемещение пипетку, наполненную ферментом близко к поверхности DRG и кратко применять положительное давление на пипетку, содержащую коллагеназу через трубку, соединяющую держатель и шприца, смещая поршень около 0,5 мл.
Примечание: Под давлением, поток фермента из пипетки будет слегка увеличить пространство между DRG нейроны, которые могут служить в качестве знака для применения фермента. - После того, как от 10 до 15 мин, когда наблюдается обломков оставшихся эпиневрии, нежный отрицательное давление на пустой пипетки отсасывать мусор.
Примечание: Таким образом, нейроны и окружающие их глиальные клетки спутников будут явно выставлены и готов к записи патч. - Откажитесь от двух пипеток в контейнер для острых предметов.
4. Патч Зажимные Записи
- Поместите раствор электрода (см Таблицу 3) на льду для предотвращения деградации. Заполните стеклянный патч пипетки сфильтруется внутриклеточный раствор (шприц-фильтр, размер пор: 0,2 мкм) и помещают пипеткой в держателе headstage пипеткой. Нанесите нежную положительное давление на пипетку через 5 мл шприца путем перемещения плунжера около 1 мл перед опусканием пипетку в раствор ванны.
Примечание: Это предотвращает пипетку от забивания. - Выберите режим "V-зажим", повернув ручку режима на усилителе, а затем открыть "тест-пленочного" интерфейс в программном обеспечении. Переместите пипетку близко к мишени нейрон под микроскопом инспекции.
Примечание: В неповрежденной препарата DRG, тонкий слой спутника глиальных клеток инкапсулирует каждый нейрон. - Используйте положительное давление из пипетки, чтобы пройти через слой спутник глиальных клеток до тех пор, внезапное расширение пространства между нейроном и окружающим слоем глиальных клеток спутников наблюдается. Продолжайте двигаться пипеткой в сторону нейроном до тех пор, "ямочки" наблюдается на нейрон.
Примечание: По сравнению сзаписи из диссоциированного нейронов, положительное давление должно быть немного больше, который поможет проникнуть в слой спутника глиальных клеток и увеличить шансы на успех заплат. - Снижение положительного давления. Затем достичь Giga Ом уплотнение с нежным всасыванием.
Примечание: При использовании этого метода вероятность успеха записи составляет не менее 70%. - Получить конфигурацию записи целой клетки , как описано выше 19.
- Вкратце, проникают через мембрану клеток нейрон через короткий, но сильный всасывания. В качестве альтернативы, используйте функцию "ZAP" на усилителе во время всасывания применяется.
- После того, как режим целая клетка устанавливается, компенсирует цельноклеточная емкость и последовательное сопротивление (Rs) путем поворота емкости и компенсации сопротивления ручки на усилителе.
Примечание: РТС, как правило, 5-20 МОм. - Покиньте клетку, если Rs первоначально превышает 30 МОм; или Rs изменяется более чем на 20% во время записи. Такжеизмерить мембранный потенциал покоя; отказаться от клетки, если мембранный потенциал покоя больше, чем -50 мВ.
- Закройте окно "Мембрана тест". Выберите режим "I-зажим нормально", повернув ручку режима на усилителе.
- Нажмите кнопку "открытый протокол" в программном обеспечении, выбрать и загрузить протокол для измерения реобазы. Нажмите кнопку "запись", чтобы начать запись. Измерьте входное сопротивление и реобазы изучить нейронную возбудимость путем введения ступенчатого ряда деполяризующими токов с шагом 100 мкА.
- Нажмите кнопку "открытый протокол" снова и выберите протокол для измерения порога мембраны. A 500 мс деполяризующие рампой тока (2000 пА / сек) будет закачиваться в нейроне.
- С помощью сбора данных и программного обеспечения для анализа (например , Clampfit) для анализа записанных следов в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте программное обеспечение для расчета входного сопротивления (Rin) на основе стационарного IV RELATionship во время гиперполяризационных токов доставленных. Перемещение курсора для измерения значения для реобазы и мембранного порога.
Примечание: Амплитуда тока, необходимого для индукции AP определяется как реобазе, и самое низкое напряжение для индукции AP определяется как порог мембраны.
- Запись Лиганд наведенных токов.
- Заполните пипетку с конкретными агонистов.
Примечание: В текущем отчете мы использовали 100 мкМ глютамата и 100 мкМ AITC для индукции токов, опосредованных рецепторов глутамата и TRPA1 рецепторов соответственно. - Проверьте пипетку, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха внутри. Поместите пипетку в держатель пипетки. Подключение держатель пипетки с трубкой, соединенной с дозирующей системы лекарственного средства.
- С помощью манипулятора для перемещения пипетку в течение 50 мкм нейроне. Установите давление раздаточную систему лекарственного средства до 1 фунтов на квадратный дюйм и продолжительность до 1 сек. Включите режим записи на зажим напряжения, и зажим при -70 мВ, Кратко прикладывают давление с помощью дозирующей системы лекарственного средства для регистрации тока медикаментозный.
- Заполните пипетку с конкретными агонистов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан процесс подготовки неповрежденную DRG для записи патча. Рисунок 1А показывает экспозицию и расположение ганглиев после ламинэктомии. Figure1B показывает L3, L4 и L5 ДРГ с корешками прикрепленными после удаления спинного мозга. Тогда L4 и 5 DRGs тщательно разрезаны и освобождены от позвонков. Далее, эпиневрий, прозрачная мембрана , окружающая DRG, удаляется (желтая стрелка, рис 1D). Лучшее место , чтобы отделить эпиневрии через сайт , где спинной и брюшной корни присоединиться в DRG, как обозначено черной стрелкой на рис 1D. После того, как отшелушивающим эпиневрии, вентральный корень и удаляют, оставляя спинной корешки спинального нерва и DRG, как показано на рисунке 1E. Переваривание с коллагеназы удаляет остаточный эпиневрии, обнажая нейроны и сателлитные клетки тшляпа окружают их (рисунок 1F).
После завершения подготовки DRG, возбудимость малого диаметра DRG нейрон рассматривается путем измерения порога реобазы и мембраны. Как показано на фигуре 2А, реобаза составляет 260 пА. Фигура 2В показывает порог мембраны , измеренный с помощью этого метода. С увеличением силы тока, мембрана непрерывно деполяризованы до АР не вызывается. В этом примере порог мембрана (потенциал, при котором точка доступа вызывается) составляет -11,9 мВ. Поэтому, поддерживая связь между нейронами и глиальных клеток спутников, наша подготовка ближе к ситуации в естественных условиях. На основании полученных результатов, реобаза записанные от маленьких нейронов DRG составляет около 300 пА, а входное сопротивление составляет 451,3 ± 27,3 МОм. Оба выше по сравнению с теми, измеряется от диссоциированных нейронов (около 150 мкА и 635 МОм), предполагая,что диссоциация увеличилась возбудимость нейронов DRG 11.
С помощью этого препарата, мы также измерили внутренние токи, индуцированные глутаматом и аллилизотиоцианата (AITC), которые являются агонистами рецепторов глутамата и переходных рецепторов потенциального члена катиона канала A1 (TRPA1) соответственно. Амплитуда внутренние токи , индуцированные этими лигандами будет отражать количество рецепторов , распределенных в нейронах. На фиг.3А показан внутренний ток в небольшом DRG диаметра нейроне , индуцированного слоеного применения в 1 сек глутамата (1 мМ). Глутамат индуцировали входящего тока (198 Па), который может быть в значительной степени блокирован путем совместного применения NMDA-антагонист рецептора APV и антагонист рецептора АМРА / каинатные CNQX (данные не показаны), что подтверждает ток опосредуется глутаматных рецепторов на DRG нейронов. Эти данные установлено, что имеются функциональные глутаматных рецепторов на DRG нейроны. пеuron показано на фигуре 3В показал внутренние токи (260 Pa) , индуцированные 1 сек слоеного применения аллилизотиоцианата (AITC, 100 мкМ), селективный агонист TRPA1. Внутренний ток был заблокирован селективного антагониста TRPA1 10 мкМ HC 030031 (данные не показаны), подтверждающие токи опосредовано TRPA1 рецепторами и устанавливает наличие TRPA1 рецепторов на DRG нейроны.
Рисунок 1: Получение интактных КСГ (А) Облучение спинного мозга после ламинэктомии и сегментации КСГ.. Стрелки справа налево показывают L3-5 ДРГ соответственно. Шкала бар = 1 см. (В) Экспонирование L3, L4, L5 и DRG , и прилагаемым нервных корешков после удаления спинного мозга. Стрелки указывают L3, L4, L5 и ДРГ справа налево. Шкала бар = 1 см. (C) ИнтаCT DRGs с нервными корешками, прикрепленных после того, как рассекали от спинного мозга. Стрелки показывают L4 и L5 ДРГ справа налево. Шкала бар = 1 см. (D) неповрежденными DRG с эпиневрии прилагается. В этой картине, эпиневрий цела, а желтая стрелка показывает полупрозрачный эпиневрии, занимаемые щипцами Дюмон. Черная стрелка указывает на соединение, образованное дорзального корешка и вентральной корень, который служит хорошей отправной точкой для шелушиться эпиневрии. Шкала бар = 1 мм. (Е) Та же КСГ с дорсальной корня прилагается после эпиневрии и вентральных корешков были удалены. Шкала бар = 1 мм. Микроскопе (F) инфракрасную DRG после расщепления коллагеназой. Малые и средние нейроны являются видимыми. Спутник глиальных клеток (желтая стрелка) видна окружающая нейрон (звездочка). Красная стрелка указывает на пипетку. Шкала бар = 10 мкм. (G) конфигурации оборудования записи. Черные стрелки указывают на гое держатели пипеток. Левая держит наркотиков заполнены пипетку, и запись пипетки справа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
На рисунке 2:. Измерение возбудимости нейронов в токовыми клещами режим работы (А) реобазе измеряли путем введения ряда токов в DRG нейроне (верхняя панель). Наименьшая интенсивность тока, что может вызвать потенциал действия, определяется как реобазе, как обозначено стрелкой на нижней панели. Реобаза для этого нейроне составляет 300 пА. (В). Пороговое мембраны измеряют путем инжекции тока рампы. Потенциал, когда потенциал действия вызывается, определяется как порог мембраны, как меченый пунктирной линией в верхней панели.Пороговое мембрана для этого нейрон -11,9 мВ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Лиганд наведенные токи в малых DRG нейронах Токи , индуцируемые слоеного применения глутамата (1 мМ) или аллилизотиоцианата (TRPA1 агониста, AITC, 100 мкМ) в течение 1 сек.. Оба агонисты индуцированных токов внутрь, предполагая присутствие глутаматных рецепторов и рецепторов TRPA1 на малых нейронов DRG. Применение Глутамат индуцировали внутренний ток 198 мкА (А), и AITC индуцировали внутренний ток 260 мкА (B). Нейроны зажимается при -70 мВ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этого рисунка. </ Р>
| 2 литра 10x низкой катионной складе | |||
| Конечная концентрация (мМ) | Компонент | МВт | Вес (г) |
| 3 | KCl | 74,6 | |
| 11 | глюкоза | 180,2 | |
| 123 | NaCl | 58,4 | |
| 1,25 | NaH 2 PO 4 * H 2 O | 138 | |
| 1 | MgCl 2 * 6H 2 O | 203,3 | |
| 2 | CaCl 2 * 2H 2 O | 147 | |
Таблица 1
| 1 литр 10x бикарбоната запаса | |||
| Конечная концентрация (мМ) | Компонент | МВт | Вес (г) |
| 26 | NaHCO 3 | 84.01 | 21.84 |
Таблица 2
| 100 мл раствора внутриклеточного | |||
| Концентрация (мМ) | Компонент | МВт | г |
| 130 | KGluconate | 234.24 | |
| 10 | KCl | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCl 2 * 6H 2 O | 203,3 | |
| Примечания: Регулировка рН до 7,4 с помощью KOH, и осмолярности до 260 - 280 мОсм с сахарозой и дистиллированной водой. Добавить 2 мМ MgATP, 0,5 мМ Na 2 ГТФ и фильтр перед немедленного использования. | |||
Таблица 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
