Introduction
樹状細胞（DC）は、先天性および適応免疫系の重要なメディエーターです。それらは、一次免疫応答を誘導し、免疫記憶の発達を促進するように機能します。これらの細胞は、抗原捕捉、移動およびT細胞刺激の主な原因であり、したがって、DCの.Manipulation異なる治療するための研究分野の広範囲にわたって、臨床設定で利用できる1とプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）と呼ばれますそのようなHIV 6,7、癌8などの炎症性疾患、自己免疫疾患9、およびアレルギー応答10。 DCはまた、アルコール依存11-14、薬物依存13,15、及びHIV感染および物質乱用16-19の組み合わせに関連するものなどの未知のメカニズムおよび経路を解決するために、薬物乱用の研究に使用されています。これらの継続的な研究と今後の調査研究Inは免疫学の分野は、研究のために非常に重要なDCの試験管内世代で行います。総血単核細胞20の1％ -しかし、彼らは0.1を構成するように、ヒトの血液からのDCの単離に関連するいくつかの困難があります。
現在までに、樹状細胞のインビトロ生成のための十分に確立された方法のいくつかは、22の選別、磁気活性化細胞、蛍光活性化セルソーティングとして単球21,22のプラスチックまたはガラス付着、密度勾配遠心分離23、特定のマーカーに基づく分離で構成され24、デキストラン被覆磁性ナノ粒子25、および完全に自動化された負の細胞選択26を使用して高度に精製された単球の迅速な単離を使用して、CD14 +単球の陽性選択。しかし、選択の最良の方法は、議論の余地が。したがって、DCの生成技術を改善するために、いくつかの方法は、開発されていますこれらの細胞の純度が大きく、末梢血単核細胞（PBMC）27から単離され精製されたCD34 +前駆細胞と単球から分化により増加させることができます。前に述べたように、単球由来樹状細胞（MDDCs）を生成するために広く使用され、人気の方法は、ガラスやプラスチック（接着法）21,22,27に接着する単球の能力を探ることです。付着方法は、複雑な装置の使用を必要としない迅速かつ簡単な方法です。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、および単球過渡操作28を含みます。付着方法に代わる方法としては、特にネガティブ選択26によってPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キットを使用して、総PBMCから単球の磁気分離です。この手順の間、不要な細胞には、四量体による除去の対象とされています抗体複合体とデキストラン被覆磁性粒子。この分離方法の利点は、不要な標識された細胞は、標的細胞が自由に列を必要とすることなく、新たなチューブに注ぎ出しすることができるが、磁石を用いて分離されることです。現在までに、ユニークな細胞集団にラベルを付けることができ、特定のモノクローナル抗体の利用可能性と、磁気分離技術は、単に追加の方法が、免疫学の分野では珍しい細胞の単離の必要はないとなっています。例えば、市販の常磁性MACS-ナノ粒子とソーティングなど磁気細胞などの技術は、研究と臨床応用22,29のための新たなアプローチの開発を促進しました。さらに、単球の接着およびMACS技術方法からDCの生成を比較した最近の調査研究は、単球22,30分離MACSを使用して、より高いDC純度および生存率を示しました。
現在の研究のプレゼント市販のヒト単球濃縮キットを使用してネガティブ選択により付着および2）単球の単離によって1）単球の単離：PBMCから単離した単球からのヒトDCの生成のための2つの方法の間の比較。この研究は、接着方法によって単離された単球と比較した場合、単球を単離するためのネガティブ選択磁気分離手順は、単球の生存率に有意な差を有する単球の最も高い収量を生成することを示す証拠を提供します。ターンでは、7日後、磁気分離によって単離された単球は、MDDCの生存率に影響を与えることなく、有意に高い増殖能と二重陽性（のCD11c + / CD14 +）の表現型を発現する細胞の高い量とMDDCsに分化しました。それは同時に、増殖およびCD11cに分化することができる単球を生成するために、両方の技術の能力を実証するため、全体的に、現在の研究では、+上で参照した以前の研究とは異なり彼らの生存能力を損なうことなく、培養中7日後MDDCs（> 70％）。また、現在のアプローチは、フローサイトメトリーを撮像して異なるのCD11c / CD14 MDDCs集団の初回の特徴付けを提供します。
DCは免疫学の分野の研究について焦点役割を果たしているので、それらが誘導されている方法を検討し、どのような方法は、 インビトロでそれらを分離し、培養するために使用されている場合要約すると、異なるパラメータを考慮しなければなりません。そこで、本研究では、二つの異なる単球の単離の方法とどのようにこれらの方法は差動で、最終的に、樹状細胞の生存率、増殖、および表現型に影響を与える単球の生存率および収量に影響を与えるの洞察を提供することを目的とします。これらの知見は、免疫学の分野に大きく貢献するとDCの単離、精製、およびキャラクタリゼーションの詳細なプロトコルを提供します。
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Protocol
全体的にヒト血液の研究をレビューし、IRBプロトコル承認＃のIRB-13から0440 FIUの治験審査委員会（IRB）によって承認されています。ヒトロイコパックは、マイアミ、フロリダ州のコミュニティ血液バンクから購入しました。
標準的な密度勾配法によるPBMCの1の単離
- T75フラスコ中の1×リン酸緩衝生理食塩水で血液の1希釈：1を実行します。
- ピペット注意深く15 50mlの遠心分離チューブに密度勾配溶液のmlおよび層 - この傾斜以上希釈血液の（25〜30ミリリットル/チューブ）。
- 1の加速と0の減速で1200×gで20分間遠心します。
- 遠心分離後、新しい50mlの遠心分離チューブに界面層（白血球）を収集し、PBSで2回（1,080×gで3分間）で細胞を洗浄します。毎回上清捨てます。
- 塩化アンモニウム - カリウム溶解（ACK）緩衝液で細胞を治療する（赤血球を溶解するために）。バッファのとで10ミリリットルを追加します。4℃で15分間cubate。
- 、PBSで2回細胞を洗浄1080×gで3分間遠心分離し、上清を毎回捨てます。
- PBMCをを含んでなる、ペレットを保存します。
- 選択した単球の精製方法に進みます。
アドヒアランス法による2.単球精製
- L-グルタミン（300 mg / mlで）を含有する完全な細胞培養培地を準備し、ペニシリン（50 U / ml）を-streptomycin（50μg/ ml）および10％ウシ胎児血清を補充しました。
- PBMCを、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で、完全培地10mlあたり5×10 7細胞の濃度で、T75フラスコ中でそれらを培養することにより、約2時間接着させます。
- インキュベーション後、培養フラスコからの非付着、浮遊細胞を除去し、穏やかにPBSで2回付着細胞を洗浄します。
- ヒト顆粒-MACRを2μl/ mlを添加した完全細胞培養培地中で接着細胞をインキュベート10μg/ mlのストック濃度で保存ophageコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）。
- 培地の半分を変更し、サイトカインごとに48時間を補充します。
- MDDCsへの単球の分化のために7日 - 5許可します。
磁気分離法による3単球の精製
- 標準的な密度勾配技術からのPBMCを収集し、細胞/ mlの濃度でPBS緩衝液中の5 mlのポリスチレンチューブに注ぎ、再懸濁します。
- 、50μlの/ mlの細胞を用いたヒト単球濃縮カクテルを追加し、よく混ぜ、10分間4℃でインキュベートします。
- インキュベーション後、50μlの/ mlの細胞を用いて磁性粒子を追加し、よく混ぜ、5分間4℃でインキュベートします。
- PBS緩衝液を添加することにより、2.5ミリリットルの全体積に細胞懸濁液を起動し、ピペッティングにより2ダウンよく混ぜる - 3回。
- 磁気デバイスにキャップなしでポリスチレンチューブを置き、2 RTで取っておきます。5分。
- インキュベーションの後、連続した1つの動きで、磁石をピックアップし、クリーン50ミリリットルの遠心分離管に目的の精製された単球画分を注ぎます。
- 10μg/ mlのストック濃度で保存されたヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびインターロイキン4（IL-4）を2μl/ mlを補充した完全細胞培養培地中で接着細胞を培養します。
- 48時間ごとに、培地の変更の半分は、新しいメディア（cRPMI中）およびサイトカインで5分間、1080×gでスピンダウンし、再サスペンドペレット。
- MDDCsへの単球の分化のために7日 - 5許可します。
4.トリパンブルー排除生存率アッセイ
注：PBMCを、単球、およびMDDCsの細胞収率および生存率を得るために、この技術を使用してください。
- 標準トリプシン-EDTAを用いてフラスコ及びPBSを用いて細胞ペレットの洗浄を行い、収穫細胞。ペレットの大きさに応じて、再ペレットを溶解するためにPBSの5〜10ミリリットルに懸濁。
- 希釈した細胞ペレットとトリパンブルー試薬の1希釈：マイクロ遠心管では、1を実行します。
- このミックスから、アリコート10μlの細胞計数スライドにし、製造業者のプロトコルに従って自動細胞カウンターを使用して結果を読み取ります。自動細胞カウンターを使用できない場合は、同様の細胞数は、血球計または手動カウンターを使用して可能です。
5. MTTアッセイ
- 96ウェルプレート中の完全培地4×10 4個 /100μlの濃度でプレートの細胞を各ウェルに。細胞が培養液に調整するための24時間を許可します。
- インキュベートし、それぞれ0（0日）、36（3日目）および84（7日目）時間で読み取りを行います。
- 希望のインキュベーションの終了時に、メディアを取り出し、単独で100μlのPBSと交換してください。
- 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド溶液（MTT）（5mg / ml）をdimethを10mlを添加することにより調製しますドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を1gにイルスルホキシド（DMSO）。
- 各ウェルにMTT溶液10μl（5 mg / mlで）を追加し、さらに2時間37℃でインキュベートします。
- インキュベーション後、PBSおよび未変換MTT混合物（黄色液）を含有する上清を除去します。
- 各ウェルにSDS-DMSO溶液100μlを加え、さらに1時間インキュベートします。
- マイクロプレートリーダーを用いて540 nmの吸光度を読みます。
6.細胞表面イメージングフローサイトメトリーによる染色分析
- 精製した単球からの分化の7日後に1.5 mlチューブの適切な数への単球由来樹状細胞の1×10 6細胞のアリコートを分配します。
- 熱不活性化50μlの（HI）ヒト血清を用いてブロッキング細胞による細胞表面染色を開始し、4℃で10分間インキュベートします。
- インキュベーション後、5分間720×gで遠心分離細胞は、上清を捨てます。
- セルPELLEへtは、それぞれの蛍光標識抗体（ 例えば、抗CD11cのまたは抗CD14）を追加し、光から保護し、20分間4℃でインキュベートします。彼らは、補償のために必要とされているので、別々のチューブでは、）は、単一の蛍光色素染色したサンプル/ mlのを準備します。
- インキュベーション後、5分間720×gでPBS緩衝液遠心1mlの各時間で細胞を2回洗浄します。
- 光から保護された細胞を維持、フローサイトメトリー分析のための細胞/ 100μlの濃度でPBS緩衝液中に再懸濁します。
- 生存細胞上にゲートするためには、事前の製造元の指示に従った器具サイトメトリ単一細胞イメージングフローに細胞を取得する各チューブにDAPIの1μlを添加します。
7.統計分析
- 入力スプレッドシート内のすべてのデータ。
- 必要に応じてスチューデントのt検定および/または一方向ANOVAを使用して結果を比較してください。
- p <0.05の場合の差は統計的に有意であると考えてみましょう。
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Representative Results
磁気分離により単球の収量は遵守法による単球の収量に比べて高いです
PBMCおよび単球の分離の分離の日にトリパンブルー排除法により図1の表示PBMCおよび単球細胞数で示されたデータ。磁気分離により単離された単球がPBMCの最大25％を占めながら、平均して、接着方法によって単離された単球は、全PBMCの約6.2％を占めました。統計分析は、磁気分離により得られた単球の割合が著しく高い（≥4倍）であることを明らかにしました。データは少なくとも3回の独立した実験の平均±SDとして表されます。両方の方法（0.0005≤p）を比較する場合、単球の収量の有意な差が認められた検定スチューデントのtを使用して統計分析。
1 "> 単球の単離順守によって、および磁気分離によって単球生存率に影響を与えません ：「キープtogether.withinページを= FO」_content上記の二つの異なる技術によって、単球の単離後、生存率アッセイが使用される方法は、細胞傷害性および細胞の生存率に影響を与えなかったことを確認するために実施しました。 図2の表示のいずれかの付着方法によって、または磁気分離により単離し、生存単球の割合の平均で提示されたデータ。生存細胞は、単離の日に、トリパンブルー排除法を用いて計数しました。 2つの分離レベルの方法の間の単球のパーセント生存率を比較すると、両群間の差は統計的に有意ではなかったことを明らかにしました。また、密着性により単離し、生存単球の割合の平均は1.66±91.75パーセントであった、生存単球の割合の平均はMAGNにより単離しETIC分離は2.75±87.4パーセントでした。これらの生存率データは、少なくとも3つの独立した実験から評価しました。統計的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定しました。
磁気分離によって分離された単球由来の細胞は、遵守方法によって獲得された単球由来の細胞と比較して細胞増殖の有意な増加を示します
MTTは、細胞増殖を測定するための比色アッセイを用いました。生細胞における、MTTの黄色テトラゾール色を容易に分光光度計を用いて測定された紫色のホルマザンに還元されます。 0.22±0.02 対磁気方式：0.38±0、図3に示すデータは、0日目の吸光度の増加（付着法により測定される単球の分離の両方のプロセスは、7日の期間にわたり、より高い細胞増殖をもたらすことを実証します0.02）、3日目（密着法：0.28±0.02、磁気法：0.55±0.05）と7日目（密着法：0.36±0.01、磁気= 0.66±0.006）。しかし、XTTアッセイとは異なり（データは示していない）、MTTアッセイは、0日目（P = 0.003）、3日目に付着法によって取得された単球からMDDCsに比べ磁気分離によって単離した単球からMDDCsの細胞増殖の有意な増加を明らかにしました（P = 0.006）、および7日目（P = 0.002）。細胞増殖は0日と3（P = 0.003）との間に有意差があることが判明し、そして0日および単球からMDDCsのグループ内の7た（p <0.001）との間で磁気分離により精製しました。また、密着性（P = 0.008）により精製した単球からMDDCsで0日目と7日目の間の細胞増殖の有意な差が観察されました。 MTTアッセイは、3つの異なる実験から得られたMDDCsを用いて行きました。統計的有意性は、wは≦0.05 ANOVA及びスチューデントのt検定、Pを用いて決定しました有意であるとみなされるように統計的有意差が認められなかった場合を除き、そしてp値は、グラフ上で指摘されています。
CD11cおよびCD14細胞表面染色によりMDDCsのキャラクタリゼーション
IL-4およびGM-CSFで7日間単球を培養した後、密着性および磁気分離法によって単離された単球から得られたMDDCsを図4に特徴付けられた。特性評価は、両方の方法で低シングルCD14 + / CD11c-表現型または純粋に単球集団を明らかにし、磁気= 79％±19対0.0と高合計のCD11c +表現型、密着性= 72％±11±磁気= 1％対1.0±= 1％遵守しかし、総CD14 +集団をさらに分析したところ、高収量があったが、磁気分離との両方の方法でのCD11cおよびCD14のための二重陽性細胞二重陽性のCD11cおよびCD14の高い数を与えます人口接着方法に比べ、密着性= 49％の磁気に対し±7 = 73％±、MDDCsの磁気分離、正のCD11cおよびCD14陰性集団を介した二重陽性表現型を有するMDDCsの高い収量が高かったた15が、接着方法で、 図4Bで±7、各個別のマーカーの平均蛍光強度（MFI）はゲーテッド集団に見て、CD14 +集団におけるCD14の高輝度を示した= 6％の磁気に対し±7遵守= 23％、両方の同等の強度二重陽性集団およびCD11c +およびCD14-集団において高のCD11c強度ののCD11cおよびCD14。磁気分離は、まだ単球マーカー（CD14）を落としていないMDDCsを区別初期段階であってもよいのCD11c + / CD14 +細胞のより高い割合を与えるにもかかわらず、要約すると、付着方法は、のCD11c + / CD14-のより高い割合を与えますMDDC人口の分化後期であってもよいです。 ADDITでイオンは、DAPI染色は、生存率の結果を確認し、特性評価を生MDDCsで行った保証するために行われました。 DAPIネガティブ/生きている細胞の割合（磁気= 67±1対遵守= 76±7）は、両方の方法を確認する2つの方法の間に有意差はなかっある文化の中で7日後にMDDCsの生存率には影響しません。
磁気分離によって 図1 単球の収率が付着法による単球の収量と比較して高くなっている。〜単球の25％は、磁気分離法を用いて得られた、一方の単球の約6.2％が付着法を用いてPBMCから単離しました。データは少なくとも3回の独立した実験の平均±SDとして表されます。両方の方法を比較した場合、スチューデントt検定を用いて統計的分析は、単球の収量の有意差を示しました。（P = 0。00005）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
接着によっておよび磁気分離によって 図2. 単球の単離は、単球生存率に影響を与えません。遵守により単離し、生存単球の割合の平均は1.66±91.75パーセントであったと磁気分離により単離し、生存単球の割合の平均は87.4パーセント±ました2.75。データは、少なくとも3つの独立した実験の生存細胞の平均±SD百分率として表されます。両方の精製方法を比較した場合、有意な差は細胞生存率では観察されなかった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
磁気分離によって分離された単球由来 図3. 細胞が順守法による単球を買収由来の細胞と比較して細胞増殖の有意な増加を示す。吸光度の有意な増加は、両方の3日目と7日目に両方の方法についても観察された値を比較した場合両方の方法（0.05≤p）を比較する際に加えて、0日目のそのそれぞれの対照に対して、ANOVAおよびスチューデントのt検定はまた、MTT取り込みの吸光度の有意な差が認められました。データは、3つの独立した実験の平均±SDとして表現されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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異なる集団（単セルのゲートアウト％）を表すのCD11cおよびCD14細胞表面染色。A）バーグラフによりMDDCsの 図4. キャラクタリゼーション 。まず、DAPI-（生きている）細胞は、全単一細胞からゲートしました。その後、CD14 + / CD11c-、のCD11c +、のCD11c + / CD14 +およびCD11c + / CD14-はDAPI-（生きている）集団からゲートしました。 CD11c +集団2領域のCD11c + / CD14 +およびCD11c + / CD14-の合計です。B）細胞のすべての部分集団でのCD11cおよびCD14の両方の平均蛍光強度（MFI）の値を示す代表的グラフである。C）標識された細胞の代表的な散布図磁気および付着方法の両方のためにDAPI陰性（生きている）細胞集団にゲートのCD11c-APCおよびCD14-APCcy7と。ゲート細胞の各サブ母集団に属する（散布図に青色で選択）単一細胞の代表的な画像ギャラリー、のCD11c + / CD14-（オレンジ色にゲーティング）、のCD11c + / CD14 +（赤）、およびCD14 +（）紫色でゲートさ。単一細胞の画像ギャラリーでは、赤い色は、APCと黄色の色で標識したCD11cはAPCcy7で標識されたCD14を表します。散布図では、集団ゲートに選ばれた色がランダムであり、実際の細胞画像に相関関係はありません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
単離したヒト血液からMDDCsを生成する既知の難しさに基づいて、本研究はMDDCsを生成するための2つのよく確立された方法の総合的な比較を提供することを目的としました。比較第一の方法は、ガラスやプラスチック（接着法）21,22,27に接着する単球の能力を活用することによってMDDCsを生成するための十分に確立された伝統的な方法です。付着方法は、迅速かつ費用効果的であり、複雑な装置の使用を必要としません。しかし、この方法のいくつかの欠点は、リンパ球汚染、低柔軟性、単球過渡操作22,30,31が含まれます。比較して第二の別の方法は、ネガティブ選択によりPBMCから単球を単離するために設計されたヒト単球濃縮キット26を使用して、全末梢血単核細胞（PBMC）からの単球の磁気分離です。この分離方法の利点は、不要な細胞であります標識した標的細胞を自由に列を必要とせずに直接抗体で細胞を標的とすることなく、新たなチューブに注ぎ出している間に磁石を用いて分離されます。かかわらず（磁気分離対付着）単球の単離方法の、両方の手順の後に、プロトコル内の重要なステップの一つは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）で単球のin vitro刺激し、インターロイキン4（ IL-4）、MDDCsを生成するために必要とされます。これは、抗原の取り込みおよび未熟MDDCs 32の処理能力の特性を損なうことなく血単核細胞からMDDCsを生成するための一般的かつ十分に確立されたプロトコルです。一般的にDCのin vitroでの生成のために使用される技術の主要な制限の1つは、単球などの前駆細胞の低い収率です。上記報告したように、接着方法によって単離された単球は、総Pの約6.2％を占めましたBMC、磁気分離により単離した単球がPBMCの最大25％を占めました。総血単核細胞20の1％ - DCはわずか0.1を構成している10％31 -文献によると、単球の正常成人の差動白血球数が2であるために及びます。そのため、磁気分離後に得られた単球の高い収率（〜25％）が細胞集団と不要な細胞に結合する抗体および/または磁性粒子の欠如の不純物が原因である可能性があります。
分離された単球の高い収率および純度を達成するために、プロトコル内のすべての重要なステップは、慎重に従わなければなりません。標準的な密度勾配遠心分離による血液からのPBMCの単離の間に、いくつかの重要なステップがあります。まず、ピペッティングし、注意深く50ml遠心チューブに密度勾配液の上に血の階層化は厳しくピペッティングすることは、このソリューションと血液の混合を引き起こす可能性がありますので、練習が必要なステップです、これを単離することは困難である弱いPBMC層をもたらすことができる、または、PBMCを有する赤血球の完全な混合物をもたらすことができます。この工程では、血液の明確に定義された層と異なるPBMC層を有するようにピペットの一定の比較的遅い流れを維持することが重要です。第二に、加速1および減速0と次のステップで遠心分離が非常に重要です。これらの設定は、最初の遠心分離工程のために使用されていない場合、それは不規則密度勾配溶液と血液の混合につながると血液成分の残りの部分からのPBMCを分離しません。 ACKとのより長いインキュベーションは、赤血球と一緒に実行可能なPBMCの減少につながることができますので、 - （15分10）第三に、もはや最適化された時間より用のバッファを溶解塩化アンモニウムカリウム（ACK）でのPBMCをインキュベートすることが重要です。また、ACKのインキュベーション後にPBS洗浄を行うことも重要です。しかし、赤血球は、最初で溶解されていない場合ACKのステップと、彼らはまだ洗浄の後に表示されるように継続し、ACKの溶解の別のラウンドを強くお勧めします。
白血球細胞の単離後、単球を生成するための接着方法を実行するときに心に留めておくべきいくつかの重要なステップがあります。浮遊リンパ球の存在が少ない単球が接着させることができ、また、より低いMDDCの純度をもたらすことができるので、まず、PBMCをインキュベーションの2時間後の浮遊リンパ球を洗浄することは非常に重要です。なお、これらの洗浄工程は、重要な過剰かつ過酷な洗浄です（推奨よりも多く、 すなわち 、2回）より低い単球の収率で得られた、あまりにも接着性単球を洗浄引き起こす可能性があります。サイトカインはMDDCsへの単球の分化に関与しているので、第二に、完全培地およびサイトカインで細胞をインキュベートすることが重要です。加えて、 48時間ごとに培地を交換し、サイトカインを補充することは、細胞の分化および生存のために重要です。メディアを変えながら、浮動MDDCsを保存し、分化の過程の間に表面から切り離すことができますいくつかのMDDCsがあるので、新鮮な培地およびサイトカインと一緒に文化に戻ってそれらを返すことも重要です。単球が、推奨濃度で播種取り付けられ、成長するために、彼らは細胞の接触にセルを必要とするので、近接して配置されていること、それはまた、重要なことを確認します。単球を生成するために、磁気分離法を行う場合には、良好な収率および単球の高純度を得るために、いくつかの重要なステップがあります。まず、メーカーが推奨する細胞濃度を維持するために重要です。それは低い収率および低い純度につながる可能性として、磁石に置かれたときポリスチレンチューブを乱さないことも重要です。上記のように、この技術は、他のCの存在に関連することができる接着方法に比べて有意に高い単球収率（ 図1）に導きますells。細胞は、フローサイトメトリーによって特徴付けられたときまた、磁気方法は、他の細胞の存在と相関し得る二重陽性細胞（CD11C + / CD14 +）、高い割合を示しているか、また、MDDCの異なる段階の存在が原因である可能性があり分化。
かかわらず、収率および純度のin vitro MDDC世代のもう一つの重要な側面は、生存および増殖MDDCsを生成する能力です。現在の研究は、培養中の7日間、細胞の代謝活性の増加によって示されるように、両方の精製方法は、MDDCs（ 図3）の増殖を誘導することを実証する証拠を提供します。また、磁気分離により精製単球からMDDCsの発生は、増殖の有意に高い率が密着（ 図3）により精製単球から生成さMDDCsに比較を示しました。これらの知見は、Gを示す先行研究と一致していますCD34 +細胞からのDCのenerationが原因ヒトの血液27、33における増殖DC前駆細胞の存在に対する増殖過程です。しかし、単球も増殖34,35の証拠なしのDCに分化することができることを実証論争の知見があります。 DCのin vitroでの生成についての論争とDCを前駆体を増殖するから、または単球の分化から生成されているかどうかについてのがたくさんあることを指摘することが適切です。例えば、接着性末梢血細胞からのDCのインビトロ産生はまた、GM-CSF 27への曝露後に増殖することができる前駆細胞を濃縮することが示されており、DCの収率はの存在下で誘導されることを実証する証拠もありますGM-CSFおよびIL-4は、単球33の起動回数を超えて拡張することができません。全体的に、現在の研究では、月の増殖に増加を示しています7日までに> 70％のCD11c +表現型を有する総MDDCs人口につながる文化の中でocytic細胞（遵守= 19±= 79％の磁気対72％±11）。より高い二重陽性表現型（遵守= 49％で、さらに表現型解析を行ったところ、有意ではないものの、磁気分離法によって単離された単球がMDDCsをもたらしたことを磁気= 73％に対し±7のCD11c + / CD14 +指摘する関連性があります±15のCD11c + / CD14 +）の接着によって単離された単球が高く、単一の陽性表現型（遵守= 23％、6％=磁気±7のCD11c + / CD14-）対±7のCD11c + / CD14-とMDDCsをもたらしました。高い単一の陽性表現型を持つMDDCsは分化の後期段階下にあってもよい一方で、より高い二重陽性表現型（のCD11c + / CD14 +）を持つMDDCsは、分化の初期段階下にあってもよいです。
要約すると、本研究では、ネガティブ選択磁気分離ということを支持する証拠を提供しprocedur接着方法によって単離された単球と比較した場合、単球を分離する電子は、単球の生存率に有意な差を有する単球の最も高い収量を生成します。ターンでは、7日後、磁気分離によって単離された単球は、MDDCの生存率に影響を与えることなく、有意に高い増殖能と二重陽性（のCD11c + / CD14 +）の表現型を発現する細胞の高い量とMDDCsに分化しました。両方の方法を比較すると、両方の方法は> 70％のCD11c + MDDCsが得られたので、調査結果は、同時に文化の中で7日後のCD11c + MDDCsに（ 図3）を 、増殖および分化することができる単球（ 図4）を生成するための両方の技術の能力を実証しています。しかし、成熟マーカーを見て、さらに分析が完全に機能MDDC集団を特徴付けるために有用であろう。結論として、両方の方法は、CD11cの+ MDDCsおよびプロブの単離のための有利な代替物であります研究用途のために十分な収率をIDEとも将来の臨床応用に有用であり得ます。ラボは現在、MDDCの表現型および機能を変更するためにこれらの物質の特に能力で、アルコール乱用および先天性免疫システム上の他の乱用物質の影響を研究するためにMDDCsの世代に焦点を当てています。したがって、現在の研究では、MDDCの特性評価のベースラインを提供し、薬物乱用のコンテキストで単球由来樹状細胞機能を媒介する分子メカニズムを解明するために、さらなる実験を続行する能力を強化します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at RT |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al.
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O.
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
