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Immunology and Infection

Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d'isolement

Published: October 18, 2016 doi: 10.3791/54296
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

Introduction

Les cellules dendritiques (CD) sont des médiateurs essentiels des systèmes immunitaires innées et adaptatives. Ils fonctionnent à induire des réponses immunitaires primaires et faciliter le développement de la mémoire immunologique. Ces cellules sont principalement responsables de capture d' antigène, la migration et la stimulation des cellules T et sont donc appelées cellules comme professionnels présentant l'antigène (CPA) 1 .Manipulation des PED pourraient être utilisés dans un large éventail de domaines de recherche et dans le cadre clinique pour traiter différents des maladies inflammatoires telles que le VIH 6,7, le cancer, les maladies auto - immunes 8, 9 et 10 des réactions allergiques. DC sont également utilisés pour la recherche sur la toxicomanie afin de résoudre des mécanismes et des voies inconnues , tels que ceux associés à la dépendance à l'alcool 11-14, la dépendance aux drogues 13,15, et la combinaison de l' infection et de la substance VIH abus 16-19. Ces études en cours et les futures études de recherche in le domaine de l' immunologie faire dans la production in vitro de DC extrêmement important pour la recherche. Cependant, il existe plusieurs difficultés associées à l' isolement DCs à partir de sang humain comme elles ne constituent que 0,1 à 1% du nombre total de cellules mononucléées du sang 20.

À ce jour, quelques - unes des méthodes bien établies pour la production de CD in vitro consiste en plastique ou en verre adhérence des monocytes 21,22, la densité centrifugation gradient 23, séparation spécifique à base de marqueur tel que magnétique tri cellulaire activé 22, fluorescent tri cellulaire activé 24, sélection positive des monocytes CD14 + à l' aide de nanoparticules magnétiques dextran revêtues 25, et l' isolement rapide des monocytes hautement purifiés à l' aide de la sélection de cellule négative entièrement automatisé 26. Cependant, la meilleure méthode de choix reste controversé. Par conséquent, pour améliorer les techniques de génération de courant continu, plusieurs méthodes ont été mises au point, dans lequella pureté de ces cellules peut être fortement augmentée par la différenciation de cellules progénitrices CD34 + et les monocytes purifiés isolés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) 27. Comme mentionné avant, une méthode largement utilisée et populaire pour générer monocytes des cellules dendritiques dérivées (de MDDCs) est d'explorer la capacité des monocytes à adhérer au verre ou en plastique (méthode d'adhérence) 21,22,27. Le procédé d'adhérence est une méthode simple et rapide qui ne nécessite pas l'utilisation d'un équipement complexe. Cependant, certains inconvénients de ce procédé comprennent la contamination des lymphocytes, une faible flexibilité et de manipulation monocyte transitoire 28. Une méthode alternative à la méthode d'adhérence est l'isolation magnétique des monocytes à partir de PBMC totaux, en particulier avec l'utilisation d'un kit d'enrichissement de monocyte humain, qui est destinée à isoler des monocytes à partir des PBMC par sélection négative 26. Au cours de cette procédure, les cellules indésirables sont ciblées pour l'élimination de tétramèreles complexes d'anticorps et des particules magnétiques revêtues de dextrane. L'avantage de cette méthode d'isolement est que les cellules marquées non désirées sont séparés à l'aide d'un aimant tandis que les cellules cibles peut être versé librement au loin dans un nouveau tube sans qu'il soit nécessaire pour les colonnes. A ce jour, la disponibilité d'anticorps monoclonaux spécifiques qui peuvent étiqueter des populations de cellules uniques, la technique de séparation magnétique est devenue non seulement une méthode supplémentaire, mais une nécessité pour l'isolement de cellules rares dans le domaine de l'immunologie. Par exemple, des techniques telles que la cellule magnétique de tri disponibles dans le commerce avec paramagnétiques MACS-nanoparticules ont facilité le développement de nouvelles approches pour la recherche et les applications cliniques 22,29. En outre, des études récentes comparant génération DC à partir de méthodes monocytes d'adhérence et de la technologie MACS ont démontré une pureté et la viabilité plus élevée DC en utilisant MACS monocytes 22,30 séparés.

Les cadeaux de l'étude en coursune comparaison entre les deux procédés pour la production de CD humaines à partir de monocytes isolés à partir de PBMC: 1) l'isolement de monocytes par adhérence et 2) l'isolement de monocytes par sélection négative en utilisant un kit commercial d'enrichissement de monocytes humains. Cette étude fournit des preuves pour montrer que la procédure de sélection de séparation magnétique négatif pour isoler les monocytes génère le plus haut rendement de monocytes avec aucune différence significative dans la viabilité des monocytes par rapport aux monocytes isolés par la méthode d'adhérence. À son tour, au bout de sept jours, les monocytes isolés par séparation magnétique différenciées en MDDCs avec une capacité proliférative significativement plus élevée et plus grande quantité de cellules exprimant positive double (CD11c + / CD14 +) phénotype sans affecter CDMD viabilité. Dans l'ensemble, l'étude actuelle diffère des études antérieures mentionnées ci-dessus car elle démontre la capacité des deux techniques pour générer simultanément des monocytes qui sont capables de proliférer et de se différencier en cd11cMDDCs (> 70%) après sept jours de culture sans compromettre leur viabilité. En outre, l'approche actuelle prévoit la première caractérisation temporelle de CD11c différents / populations CD14 MDDCs par flux d'imagerie cytométrie.

En résumé, étant donné que les PED jouent un rôle central en ce qui concerne la recherche dans le domaine de l' immunologie, des paramètres différents doivent être pris en considération lors de l' examen comment ils sont dérivés et quelles méthodes sont utilisées pour isoler et les cultiver in vitro. Par conséquent, cette étude vise à fournir des indications sur deux méthodes différentes d'isolement des monocytes et comment ces méthodes affectent différemment monocytes la viabilité et le rendement peut éventuellement affecter la viabilité des cellules dendritiques, la prolifération et le phénotype. Ces résultats contribueront grandement au domaine de l'immunologie et fournira un protocole détaillé de DC isolement, la purification et la caractérisation.

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Protocol

Des études globales de sang humain ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel (IRB) de CRF, protocole IRB approbation # IRB-13-0440. leukopaks humains ont été achetés auprès de la banque de sang de la communauté à Miami, Floride.

1. Isolement des PBMC par gradient de densité standard Technique

  1. Effectuer une dilution 1: 1 de sang avec une solution saline 1x-tamponnée au phosphate dans un flacon T75.
  2. Introduire à la pipette 15 ml d'une solution à gradient de densité dans 50 ml de tubes de centrifugeuse et soigneusement couche (25 - 30 ml / tube) du sang dilué sur ce gradient.
  3. Centrifuger pendant 20 min à 1200 x g avec une accélération et une décélération de 1 à 0.
  4. Après centrifugation, recueillir la couche d'interface (globules blancs) dans un nouveau tube centrifuge de 50 ml et laver les cellules deux fois dans du PBS (3 min à 1.080 xg). Rejeter le surnageant à chaque fois.
  5. Traiter les cellules avec du chlorure d'ammonium et de potassium de lyse (ACK) du tampon (pour lyser les globules rouges). Ajouter 10 ml de tampon et encubate pendant 15 min à 4 ° C.
  6. Laver les cellules deux fois avec PBS, centrifuger 3 min à 1.080 xg et jeter le surnageant à chaque fois.
  7. Enregistrer le culot, qui contiendra les CMSP.
  8. Procéder à la méthode de purification des monocytes de choix.

2. monocytes Purification par adhésion Méthode

  1. Préparer un milieu de culture cellulaire complet contenant de la L-glutamine (300 mg / ml) et additionné de pénicilline (50 U / ml) -streptomycin (50 pg / ml) et 10% de sérum bovin foetal.
  2. Permettre d'adhérer PBMC pendant environ 2 heures en les cultivant dans un flacon T75 à une concentration de 5 x 10 7 cellules par 10 ml de milieu complet à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.
  3. Après incubation, éliminer les cellules flottantes non adhérentes du flacon de culture et laver délicatement les cellules adhérentes deux fois avec PBS.
  4. Incuber les cellules adhérentes dans du milieu complet de culture cellulaire supplémenté avec 2 ul / ml de granulocytes humain macr-ophage facteur de stimulation des colonies (GM-CSF) et l'interleukine 4 (IL-4) stocké à une concentration stock de 10 pg / ml.
  5. Changer la moitié du milieu et de reconstituer toutes les cytokines 48 h.
  6. Autoriser 5 - 7 jours pour la différenciation des monocytes en MDDCs.

3. monocytes Purification par la méthode de séparation magnétique

  1. Collecter des PBMC à partir de la technique à gradient de densité standard, verser dans un tube en polystyrène de 5 ml et remettre en suspension dans du tampon PBS à une concentration de cellules / ml.
  2. Ajouter un cocktail d'enrichissement de monocytes humains en utilisant des cellules de 50 ul / ml, bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 10 min.
  3. Après incubation, ajouter des particules magnétiques en utilisant des cellules de 50 ul / ml, bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 5 min.
  4. Apportez suspension cellulaire jusqu'à un volume total de 2,5 ml en ajoutant du tampon PBS, bien mélanger par pipetage de haut en bas 2 - 3 fois.
  5. Placer le tube de polystyrène sans bouchon dans le dispositif magnétique et mettre de côté à température ambiante pendant 20,5 min.
  6. Après incubation et dans un mouvement continu, ramasser l'aimant et verser la fraction purifiée souhaitée de monocytes dans un 50 ml tube de centrifugation propre.
  7. Incuber les cellules adhérentes dans du milieu complet de culture cellulaire supplémenté avec 2 ul / ml de facteur de stimulation de colonies (GM-CSF), de granulocytes-macrophages humains et d'interleukine 4 (IL-4) stocké à une concentration stock de 10 pg / ml.
  8. Chaque 48 heures, changer la moitié du milieu, tourner vers le bas à 1.080 xg pendant 5 min et remettre en suspension culot avec les nouveaux médias (cRPMI) et des cytokines.
  9. Autoriser 5 - 7 jours pour la différenciation des monocytes en MDDCs.

4. L'exclusion au bleu Trypan dosage de viabilité

Remarque: Utilisez cette technique pour obtenir un rendement cellulaire et la viabilité des CMSP, monocytes et MDDCs.

  1. la récolte des cellules à l'aide de type trypsine-EDTA et d'effectuer des lavages des flacons et le culot de cellules en utilisant du PBS. En fonction de la taille de la pastille, remettre en suspension dans 5 à 10 ml de PBS pour dissoudre la pastille.
  2. Dans un tube de micro-centrifugeuse, effectuer une dilution 1: 1 de réactif bleu trypan avec culot cellulaire dilué.
  3. A partir de ce mélange, aliquote de 10 ul dans une cellule de comptage diapositive et lire les résultats en utilisant un compteur de cellules automatisé selon le protocole du fabricant. Si un compteur de cellules automatisé ne sont pas disponibles, une numération cellulaire similaire est possible en utilisant un hémocytomètre ou d'un compteur manuel.

5. Dosage MTT

  1. Cellules de la plaque à une concentration de 4 x 10 4/100 pi de milieu complet par puits dans une plaque à 96 puits. Autoriser 24 h pour les cellules de s'adapter à la culture.
  2. Incuber et effectuer des lectures à 0 (jour 0), 36 (jour 3) et 84 (jour 7) h respectivement.
  3. A la fin de l'incubation désiré, retirer le support et le remplacer par 100 ul de PBS seul.
  4. Préparer l'acide 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-solution diphényl tétrazolium (MTT) (5 mg / ml) en ajoutant 10 ml d'dimethyl (DMSO) à 1 g de dodécylsulfate de sodium (SDS).
  5. Ajouter 10 ul (5 mg / ml) de solution de MTT à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 2 heures supplémentaires.
  6. Après incubation, retirer surnageants contenant du PBS et le mélange de MTT non converti (solution jaune-couleur).
  7. Ajouter 100 pi de solution de SDS-DMSO dans chaque puits et incuber pendant une heure supplémentaire.
  8. Lire l'absorbance à 540 nm en utilisant un lecteur de microplaques.

6. surface cellulaire Coloration Analyse par imagerie cytométrie de flux

  1. Au bout de 7 jours de différenciation des monocytes purifiés, distribuer des aliquotes 1x10 6 cellules des cellules dendritiques dérivées de monocytes dans le nombre approprié de tubes de 1,5 ml.
  2. Commencer la coloration de la surface cellulaire par les cellules de blocage à l'aide de 50 pi de inactivé à la chaleur (HI) dans le sérum humain, on incube à 4 ° C pendant 10 min.
  3. Après incubation, les cellules de centrifugation à 720 g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant.
  4. Pour cellule pellet, ajouter des anticorps conjugués à un fluorochrome respectifs (par exemple, anti-CD11c ou anti-CD14) et incuber à 4 ° C pendant 20 minutes à l' abri de la lumière. Dans des tubes séparés, préparer un seul fluorochrome tachée échantillons / ml), car ils sont nécessaires à une indemnisation.
  5. Après incubation, laver les cellules deux fois dans 1 ml de tampon PBS et centrifuger à chaque fois à 720 xg pendant 5 min.
  6. Maintien de cellules protégées de la lumière, remettre en suspension dans du tampon PBS à une concentration de cellules / 100 ul pour analyse par cytométrie en flux.
  7. Afin de grille sur des cellules viables, ajouter 1 pi de DAPI à chaque tube avant d'acquérir les cellules sur le seul flux d'imagerie cellulaire instrument de cytométrie en suivant les instructions du fabricant.

7. Analyse statistique

  1. Entrée toutes les données dans une feuille de calcul.
  2. Comparer les résultats en utilisant le test t de l'étudiant et / ou un ANOVA selon le cas.
  3. Envisager des différences statistiquement significatives si p <0,05.

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Representative Results

Monocyte Rendement par séparation magnétique est plus élevé par rapport à monocytes Rendement par adhésion Méthode

Les données présentées sur la Figure 1 affichage CMSP et le nombre de cellules de monocytes par la méthode d'exclusion au bleu Trypan à jour de l' isolement des CMSP et la séparation des monocytes. En moyenne, les monocytes isolés par le procédé d'adhérence représentaient environ 6,2 pour cent du total des PBMC pendant monocytes isolés par séparation magnétique représenté jusqu'à 25 pour cent des CMSP. L'analyse statistique a montré que le pourcentage des monocytes produites par séparation magnétique étaient significativement plus élevées (≥ 4 fois). Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type d'au moins trois expériences indépendantes. Une analyse statistique par t de l' étudiant -test a montré une différence significative du rendement des monocytes lorsque l'on compare les deux méthodes (p ≤ 0,0005).

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Monocyte Isolation par respect et par séparation magnétique Ne pas affecter monocytes Viabilité

Après l'isolement des monocytes par les deux techniques différentes décrites ci-dessus, des essais de viabilité ont été réalisées pour s'assurer que les méthodes utilisées ne sont pas cytotoxiques et affecter la viabilité des cellules. Les données présentées dans la figure 2 présentent la moyenne de la pour cent des monocytes viables isolées par une ou l' autre méthode d'adhérence ou par séparation magnétique. Les cellules viables ont été comptées en utilisant le procédé d'exclusion au bleu Trypan à jour de l'isolement. On compare la viabilité des monocytes pour cent entre les deux méthodes d'isolement ont révélé que la différence entre les deux groupes était statistiquement non significatif. En outre, la moyenne des monocytes viables pour cent des isolées par adhérence était de 91,75% ± 1,66 et la moyenne des monocytes viables pour cent de magn isolé parla séparation étique était de 87,4% ± 2,75. Ces données de viabilité ont été évaluées à partir d'au moins trois expériences indépendantes. La signification statistique a été déterminée en utilisant le test t de l'étudiant.

Les cellules dérivées de monocytes isolés par séparation magnétique montrent une augmentation significative de la prolifération des cellules par rapport aux cellules dérivées de monocytes acquises par adhésion Méthode

MTT a été utilisé comme un dosage colorimétrique pour mesurer la prolifération cellulaire. Dans les cellules vivantes, la couleur jaune tétrazole de MTT est réduit en formazan pourpre, qui est facilement mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre. Les données présentées sur la figure 3 montrent que les deux procédés d'isolement de monocytes entraînent une plus grande prolifération cellulaire pendant une période de 7 jours comme mesuré par une augmentation de l'absorbance à jour 0 (méthode d'adhérence: 0,22 ± 0,02 vs méthode magnétique: 0,38 ± 0.02), Jour méthode 3 (adhésion: 0,28 ± 0,02, méthode magnétique: méthode 0,55 ± 0,05) et le jour 7 (adhésion: 0,36 ± 0,01, magnétique = 0,66 ± 0,006). Cependant, contrairement à l'essai XTT (données non représentées), le test MTT a révélé une augmentation significative de la prolifération cellulaire de MDDCs à partir de monocytes isolés par séparation magnétique par rapport à MDDCs à partir de monocytes acquises par la méthode d'adhérence au jour 0 (p = 0,003), jour 3 (p = 0,006) et au jour 7 (p = 0,002). La prolifération cellulaire a également été trouvé significativement différente entre les jours 0 et 3 (p = 0,003) et entre les jours 0 et 7 (p <0,001) dans le groupe de MDDCs à partir de monocytes purifiés par séparation magnétique. En outre, une différence significative dans la prolifération cellulaire entre le jour 0 et le jour 7 dans MDDCs de monocytes purifiés par adhérence (p = 0,008) a été observée. essai MTT a été effectué en utilisant MDDCs acquises à partir de trois expériences différentes. La signification statistique a été déterminée en utilisant des tests ANOVA et le test t de Student, p ≤ 0,05 wcomme considéré comme significatif, et les valeurs de p sont notés sur le graphique, sauf si aucune signification statistique n'a été trouvé.

Caractérisation des MDDCs par CD11c et CD14 de surface cellulaire Coloration

Après la culture des monocytes pendant sept jours avec IL-4 et GM-CSF, MDDCs obtenus à partir de monocytes isolés par des méthodes d'adhérence et d' isolement magnétique ont été caractérisés à la figure 4. La caractérisation a révélé unique faible CD14 + / CD11c- phénotype ou d'une population purement monocytaire dans les deux méthodes, adhésion = 1% ± 1,0 par rapport magnétique = 1% ± 0,0 et élevée CD11c totale + phénotype, adhésion = 72% ± 11 contre magnétique = 79% ± 19. Toutefois, lorsque le CD14 totale + population a été analysée plus loin, il y avait un rendement élevé cellules doubles positives pour CD11c et CD14 dans les deux méthodes avec séparation magnétique donnant un plus grand nombre de CD11c et CD14 positif doublepopulation par rapport à la méthode d'adhérence, l'adhérence = 49% ± 7 par rapport magnétique = 73% ± 15. Bien que, il y avait un rendement plus élevé de MDDCs avec double phénotype positif par séparation magnétique, le CD11c positif et CD14 population négative de MDDCs était plus élevé dans la méthode d'adhérence; adhésion = 23% ± 7 par rapport magnétique = 6% ± 7. Sur la figure 4B, l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) de chaque marqueur individuel ont été examiné dans la population fermée et montré une forte intensité de CD14 en CD14 + population, intensité équivalente à la fois CD11c et CD14 dans la population positive double et de haute intensité de CD11c dans CD11c + et la population CD14-. En résumé, même si l'isolement magnétique donne un pourcentage plus élevé de CD11c + / CD14 + cellules, qui peuvent être MDDCs de stade différencié précoce qui n'a pas encore baissé le marqueur monocytaire (CD14), la méthode d'adhérence donne un pourcentage plus élevé de CD11c + / CD14-, qui peut être une étape tardive différenciée population CDMD. Dans Addition, coloration DAPI a été effectuée pour confirmer les résultats de viabilité et d'assurer la caractérisation a été réalisée sur MDDCs en direct. Le pour cent de DAPI / négatif des cellules vivantes (adhérence = 76 ± 7 par rapport magnétique = 67 ± 1) ne sont pas significativement différentes entre les deux méthodes confirmant les deux méthodes ne portent pas atteinte à la viabilité des MDDCs après sept jours de culture.

Figure 1
Figure 1. Rendement Monocyte par séparation magnétique est plus élevée par rapport à Monocyte Rendement par adhérence Méthode. Environ 6,2% des monocytes ont été isolés à partir de PBMC en utilisant la méthode d'adhérence alors que ~ 25% de monocytes ont été obtenus en utilisant le procédé de séparation magnétique. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type d'au moins trois expériences indépendantes. test t de l'étudiant en utilisant une analyse statistique a montré une différence significative du rendement monocytaire lorsque l'on compare les deux méthodes(p = 0. 00005). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. monocytes Isolation par respect et par séparation magnétique n'affectent monocytes Viabilité. La moyenne des pour cent des monocytes viables isolées par adhérence était 91,75% ± 1,66 et la moyenne des pour cent des monocytes viables isolées par séparation magnétique était de 87,4% ± 2.75. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type pourcentage de cellules viables d'au moins trois expériences indépendantes. Aucune différence significative n'a été observée dans la viabilité cellulaire lorsque l'on compare les deux méthodes de purification. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Les cellules dérivées de monocytes isolés par séparation magnétique montrent une augmentation significative de la prolifération des cellules par rapport aux cellules dérivées de monocytes acquise par adhésion Méthode. Une augmentation significative de l'absorbance a été observée pour les deux méthodes à la fois le jour 3 et le jour 7 lorsque l'on compare les valeurs par rapport à ses commandes respectives jour 0. en outre, ANOVA et test t de l'étudiant a également montré une différence significative de l'absorbance de l'absorption du MTT lorsque l'on compare les deux méthodes (p ≤ 0,05). Les données sont exprimées en moyenne ± écart - type de trois expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. Caractérisation des MDDCs par CD11c et CD14 Coloration de surface cellulaire. Graphique A) Bar représentant les différentes populations (% gated hors des cellules simples). Tout d'abord, DAPI- cellules (vivants) ont été bloqués à partir de cellules individuelles totales. Puis, CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + et CD11c + / CD14- ont été bloqués à partir de DAPI- (vivant) population. CD11c + population est la somme des deux régions CD11c + / CD14 + et CD11c + / CD14-. B) des graphiques représentatifs montrant l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) des valeurs pour les deux CD11c et CD14 dans chaque sous - population de cellules. C) Les diagrammes de dispersion représentant des cellules marquées avec CD11c-APC et CD14-APCcy7 gated sur DAPI négatif (vivant) population de cellules pour les deux méthodes magnétiques et d'adhérence. Galerie d'images représentant des cellules individuelles (sélectionné en bleu dans les diagrammes de dispersion) appartenant à chaque sous-population de cellules, CD11c + / CD14- (fermée en orange), CD11c + / CD14 + (gateden rouge), et CD14 + (fermée en violet). Dans la galerie d'images de cellules individuelles, la couleur rouge représente CD11c marqué avec APC et la couleur jaune représente CD14 marqué avec APCcy7. Dans les diagrammes de dispersion, les couleurs choisies à la porte les populations sont aléatoires et ne correspondent pas aux images de cellules réelles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Sur la base des difficultés connues d'isolement et de générer MDDCs de sang humain, la présente étude vise à fournir une comparaison détaillée des deux méthodes bien établies pour la génération de MDDCs. La première méthode comparée est une méthode traditionnelle bien établie pour générer MDDCs en exploitant la capacité des monocytes à adhérer au verre ou en plastique (méthode d'adhérence) 21,22,27. La méthode d'adhésion est rapide et rentable, et ne nécessite pas l'utilisation d'équipements complexes. Cependant, certains inconvénients de ce procédé comprennent la contamination des lymphocytes, une faible flexibilité, monocytes transitoire manipulation 22,30,31. La seconde méthode est comparé l'isolation magnétique de monocytes du nombre total de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en utilisant un kit d'enrichissement de monocytes humains 26 qui est conçue pour isoler les monocytes à partir des PBMC par sélection négative. L'avantage de cette méthode d'isolement est que les cellules indésirablessont marqués et séparés à l'aide d'un aimant, tandis que les cellules cibles sont librement décante dans un nouveau tube sans qu'il soit nécessaire de colonnes et sans cibler directement les cellules avec les anticorps. Quelle que soit la méthode d'isolement des monocytes (adhérente vs. séparation magnétique), après que les deux procédures, l' une des étapes critiques dans le protocole est la stimulation in vitro de monocytes avec granulocytes facteur macrophage colony-stimulating (GM-CSF) et l' interleukine-4 ( IL-4), qui sont nécessaires pour générer MDDCs. Ceci est un protocole commun et bien établie pour générer MDDCs à partir de cellules mononucléaires du sang sans compromettre la capture de l' antigène et la capacité de traitement caractéristique de MDDCs immatures 32. L' une des principales limites des techniques couramment utilisées pour la génération in vitro de DC est le faible rendement des cellules précurseurs tels que les monocytes. Comme indiqué ci-dessus, monocytes isolés par la méthode d'adhérence représentaient environ 6,2 pour cent du total PCMO, tandis que les monocytes isolés par séparation magnétique a représenté jusqu'à 25 pour cent des CMSP. Selon la littérature, les gammes pour nombre de globules blancs du sang différentiel chez les adultes normaux pour les monocytes est de 2 - 10% 31 tandis que les PED ne représentent que 0.1 - 1% du nombre total de cellules mononucléées du sang 20. Par conséquent, le rendement élevé de monocytes (~ 25%) obtenu après séparation magnétique pourrait être due à des impuretés de la population cellulaire et l'absence d'anticorps et / ou des particules magnétiques se liant aux cellules non désirées.

Pour obtenir un rendement élevé et la pureté des monocytes isolés, toutes les étapes critiques du protocole devraient être suivies attentivement. Pendant l'isolement des PBMC à partir de sang par la norme centrifugation à gradient de densité, il y a quelques étapes critiques. Tout d'abord, pipetage et soigneusement marcottage de sang sur une solution de gradient de densité en tubes de 50 ml de centrifugation est une étape qui exige de la pratique depuis pipetage durement peut provoquer le mélange de cette solution et de sang,qui peut conduire à une couche faible PBMC qui est difficile à isoler, ou il peut entraîner dans le mélange complet des globules rouges avec CMSP. Dans cette étape, il est important de maintenir un débit constant et relativement lent de pipetage pour avoir une couche bien défini de sang, et une couche distincte de PBMC. En second lieu, la centrifugation dans l'étape suivante avec une accélération et une décélération 1 0 est très critique. Si ces paramètres ne sont pas utilisés pour la première étape de centrifugation, cela conduira à un mélange du sang avec la solution de gradient de densité de manière irrégulière et ne se sépare pas les PBMC du reste des composants du sang. En troisième lieu, il est important de laisser incuber les PBMC avec ammoniacal de chlorure de potassium (ACK) du tampon de lyse pour ne plus que le temps optimisé (10 - 15 min) car une incubation plus longue avec accusé de réception peut conduire à une réduction des PBMC viables avec des globules rouges . En outre, il est également important d'effectuer les lavages PBS après ACK incubation. Cependant, si les globules rouges ne sont pas lysées par le premierACK pas et ils continuent à apparaître après des lavages, une autre série de ACK lytique est fortement recommandé.

Après isolement de globules blancs, il y a quelques étapes essentielles à garder à l'esprit lors de l'exécution de la méthode d'adhérence pour générer monocytes. Tout d'abord, le lavage au large des lymphocytes flottants après deux heures de CMSP incubation est très important car la présence de lymphocytes flottants peut causer moins monocytes à adhérer et peut également entraîner une baisse de pureté CDMD. Bien que ces étapes de lavage sont critiques, et un lavage excessif dure (plus recommandée, soit deux fois) peut provoquer une élimination par lavage des monocytes adhérents trop, ce qui entraîne un rendement monocytaire inférieur. En second lieu, l'incubation des cellules avec du milieu complet et les cytokines est essentielle car les cytokines sont responsables de la différenciation des monocytes en MDDCs. En outre, changer de support et de reconstituer les cytokines toutes les 48 heures est important pour la différenciation et la survie des cellules. En changeant les médias, il est également crucial pour sauver les MDDCs flottantes et les retourner dans la culture avec un milieu frais et des cytokines car il existe des MDDCs qui peuvent se détacher de la surface pendant le processus de différenciation. Il est également important de faire en sorte que les monocytes sont ensemencées à la concentration recommandée, attachés et étroitement espacés parce qu'ils ont besoin cellule à contact cellulaire afin de se développer. Lors de l'exécution du procédé de séparation magnétique pour générer monocytes, il y a quelques étapes essentielles afin d'obtenir un bon rendement et une grande pureté de monocytes. Tout d'abord, il est indispensable de maintenir la concentration cellulaire recommandée par le fabricant. Il est également important de ne pas perturber le tube de polystyrène lorsqu'elle est placée dans l'aimant, car il peut conduire à une moindre rendement et une pureté moindre. Tel que présenté ci - dessus, cette technique conduit à un rendement significativement plus élevé de monocytes (figure 1) par rapport à la méthode d'adhérence, qui peut être liée à la présence d' un autre caunes. En outre, lorsque les cellules ont été caractérisées par cytométrie en flux, le procédé magnétique présente un pourcentage plus élevé de cellules positives doubles (CD11c + / CD14 + de), qui peut corréler avec la présence d'autres cellules ou peut également être due à la présence des différentes étapes de CDMD différenciation.

Un autre aspect important de la production in vitro CDMD quel que soit le rendement et la pureté est la capacité de générer MDDCs viables et prolifératives. L'étude actuelle fournit des preuves démontrant que les deux méthodes de purification induisent la prolifération des MDDCs (figure 3) comme indiqué par l'augmentation de l' activité métabolique cellulaire pendant sept jours en culture. En outre, la génération de MDDCs à partir de monocytes purifiés par séparation magnétique a montré un taux de prolifération significativement supérieur à comparer MDDCs générées à partir de monocytes purifiés par adhérence (figure 3). Ces résultats sont conformes à la littérature antérieure montrant que gGÉNÉRATION des DC à partir de cellules CD34 + est un processus de prolifération due à la présence de progéniteurs DC prolifératifs dans le sang humain 27, 33. Cependant, il y a des résultats controversés démontrant que les monocytes peuvent également se différencier en DC sans aucune preuve de la prolifération 34,35. Il est pertinent de souligner qu'il y a beaucoup de controverse au sujet de la génération in vitro de PED et quant à savoir si les PED sont générées à partir de précurseurs proliférants ou de la différenciation des monocytes. Par exemple, la production in vitro de DC à partir de cellules périphériques adhérentes du sang ont été montré pour enrichir aussi pour les cellules progénitrices qui sont capables de proliférer après une exposition à GM-CSF 27 et il y a aussi des preuves démontrant que le rendement des PED dérivé en présence de GM-CSF et l' IL-4 ne peuvent pas être étendus au - delà du nombre de monocytes à partir de 33. Dans l'ensemble, l'étude actuelle démontre une augmentation de la prolifération de moncellules ocytic dans la culture que de sept jours se traduisent par une population de MDDCs totale avec> 70% CD11c + phénotype (adhérence = 72% ± 11 contre magnétique = 79% ± 19). Il est pertinent de souligner que, lorsque plus d'une analyse phénotypique a été réalisée, bien que non significatif, les monocytes isolés par la méthode de séparation magnétique entraîné MDDCs avec un phénotype positif à double supérieur (adhésion = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + par rapport magnétique = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +), tandis que les monocytes isolés par adhérence ont donné lieu à MDDCs avec un phénotype plus positif unique (adhérence = 23% ± 7 CD11c + / CD14- par rapport magnétique = 6% ± 7 CD11c + / CD14-). MDDCs avec un phénotype positif à double supérieur (CD11c + / CD14 +) peuvent être sous premiers stades de la différenciation en MDDCs avec un phénotype positif unique supérieur peuvent être sous les stades tardifs de la différenciation.

En résumé, cette étude fournit des preuves à l'appui que la sélection négative séparation magnétique procedure pour isoler des monocytes génère le rendement le plus élevé de monocytes avec aucune différence significative de viabilité monocytes par rapport aux monocytes isolés par la méthode d'adhérence. À son tour, au bout de sept jours, les monocytes isolés par séparation magnétique différenciées en MDDCs avec une capacité proliférative significativement plus élevée et plus grande quantité de cellules exprimant positive double (CD11c + / CD14 +) phénotype sans affecter CDMD viabilité. Lorsque l'on compare les deux procédés, les résultats ont démontré la capacité de ces deux techniques pour générer simultanément des monocytes qui sont capables de proliférer (figure 3) et de différentiation (figure 4) dans cd11c MDDCs au bout de sept jours dans la culture , puisque les deux méthodes ont produit> 70% cd11c MDDCs . Cependant, une analyse plus approfondie à la recherche au niveau des marqueurs de maturation peut se révéler utile pour caractériser complètement la population fonctionnelle CDMD. En conclusion, les deux méthodes sont des alternatives avantageuses pour l'isolement de cd11c MDDCs et provide un rendement suffisant pour les applications de recherche et peut même être utile pour des applications cliniques futures. Le laboratoire se concentre actuellement sur la génération de MDDCs pour étudier les effets de l'abus d'alcool et d'autres substances d'abus sur le système immunitaire inné, en particulier la capacité de ces substances à modifier CDMD phénotype et la fonction. Par conséquent, la présente étude fournira une base de CDMD caractérisation et d'améliorer la capacité de procéder à une expérimentation plus poussée afin d'élucider les mécanismes moléculaires de médiation fonction des cellules dendritiques dérivées de monocytes dans le contexte de la toxicomanie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 Must be used at RT
Phosphate-buffered saline (PBS) Life Technologies 10010-023
ACK Lysing buffer Quality Biological 118-156-101
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
RoboSep buffer StemCell 20104
EasySep Human monocyte enrichment kit StemCell 19059
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0101
FITC-Dextran Sigma Aldrich FD4-100MG
Trypan blue stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Synergy 2 multi-mode reader Biotek 7131000
XTT Sodium salt bioreagent (XTT) Sigma Aldrich X4626-100MG
Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) Sigma Aldrich D8418-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma Aldrich m5655-500MG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0302
Phenazine Methosulfate (DMSO) Sigma Aldrich P9626-1G
Inactivated (HI) Human Serum Chemicon S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer BD Accuri 653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer EMD Millipore 100300

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Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d&#39;isolement
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Figueroa, G., Parira, T., Laverde, A., Casteleiro, G., El-Mabhouh, A., Nair, M., Agudelo, M. Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols. J. Vis. Exp. (116), e54296, doi:10.3791/54296 (2016).

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