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Immunology and Infection

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Published: October 18, 2016 doi: 10.3791/54296
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

Introduction

Dendritische Zellen (DCs) sind wesentliche Vermittler der angeborenen und adaptiven Immunsystem. Sie funktionieren auf primäre Immunantworten induzieren und die Entwicklung von immunologischen Gedächtnisses erleichtern. Diese Zellen sind in erster Linie verantwortlich für die Antigen - capture, Migration und T - Zell - Stimulation und werden daher als professionelle Antigen präsentierende Zellen bezeichnet (APCs) 1 .Manipulation von DCs in einer Vielzahl von Forschungsfeldern und im klinischen Umfeld verwendet werden könnte , anders zu behandeln Entzündungserkrankungen wie HIV 6,7, Krebs 8, Autoimmunerkrankungen 9 und allergische Reaktionen 10. DCs sind auch für Drogenmissbrauch Forschung eingesetzt, um unbekannte Mechanismen und Wege zu lösen , wie sie im Zusammenhang mit Alkoholabhängigkeit 11-14, Drogenabhängigkeit 13,15, und die Kombination von HIV - Infektionen und Drogenmissbrauch 16-19. Diese laufenden Studien und zukünftige Studien in auf dem Gebiet der Immunologie machen in vitro Generierung von DCs extrem wichtig für die Forschung. Es gibt jedoch einige Schwierigkeiten , die mit DCs aus humanem Blut zu isolieren , da sie nur 0,1 bilden - 1% der gesamten mononuklearen Blutzellen 20.

Bis heute sind einige der gut etablierten Methoden zur Erzeugung von DCs in vitro besteht aus Kunststoff oder Glas , Adhäsion von Monozyten 21,22, Dichtegradientenzentrifugation 23, spezifischer Marker basierend Trennung wie magnetische aktivierte Zellsortierung 22, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung 24, positive Selektion von CD14 + Monozyten Dextran-beschichteten magnetischen Nanopartikel 25 verwenden und schnelle Isolierung von hoch gereinigten Monozyten vollautomatisierte negativen Zellselektion 26 verwendet wird . Allerdings bleibt die beste Methode der Wahl umstritten. Daher DC Erzeugungstechniken zu verbessern, wurden verschiedene Verfahren entwickelt worden, in denenDie Reinheit dieser Zellen stark durch Differenzierung aus gereinigtem CD34 + Vorläuferzellen und Monozyten , isoliert aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) 27 erhöht werden kann. Wie vor erwähnt, ist ein weit verbreitetes und beliebte Methode für Monozyten - abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) Erzeugen der Fähigkeit der Monozyten zu untersuchen , um Glas oder Kunststoff (Adhärenz - Methode) 21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist eine schnelle und einfache Methode, die nicht die Verwendung von komplexer Ausrüstung erfordert. Jedoch enthalten einige Nachteile dieses Verfahrens Lymphozyt Kontamination, eine geringe Flexibilität und Monocyten transient Manipulation 28. Ein alternatives Verfahren zur Einhaltung Methode ist die magnetische Isolierung von Monozyten aus Gesamt PBMCs, insbesondere bei Verwendung eines menschlichen Monocyten - Anreicherungs Kit, der 26 Monozyten aus PBMCs durch negative Selektion isoliert ausgebildet ist. Während dieses Verfahrens werden unerwünschte Zellen zur Entfernung mit tetrameren gezielteAntikörper-Komplexe und Dextran-beschichtete magnetische Teilchen. Der Vorteil dieser Isolationsmethode besteht darin, daß die unerwünschten markierten Zellen mit Hilfe eines Magneten getrennt werden, während die Zielzellen frei, ohne dass Spalten aus in ein neues Röhrchen gegossen werden. Bis heute mit der Verfügbarkeit von spezifischen monoklonalen Antikörpern, die spezifisch Zellpopulationen, die magnetische Trenntechnik hat etikettieren kann nicht einfach eine zusätzliche Methode, sondern eine Notwendigkeit für die Isolierung von seltenen Zellen in dem Gebiet der Immunologie werden. Beispielsweise Techniken wie magnetische Zellsortierung mit handelsüblichen paramagnetischem MACS-Nanopartikel haben die Entwicklung neuer Ansätze für Forschung und klinische Anwendungen 22,29 erleichtert. Darüber hinaus haben die jüngsten Studien Forschung Vergleich DC Generation von Monozyten Adhärenz und MACS - Technologie Methoden eine höhere DC - Reinheit und Lebensfähigkeit nachgewiesen MACS getrennt Monozyten 22,30 verwendet.

Die aktuelle Studie präsentiertEin Vergleich zwischen den zwei Verfahren zur Herstellung von humanen DCs aus Monozyten aus PBMCs isoliert: 1) monocyte Isolierung durch Adhärenz und 2) monocyte Isolierung durch negative Selektion Kommerzielle menschlichen Monocyten Anreicherungs Kit. Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass die negative Selektion magnetische Trennverfahren Monozyten erzeugt die höchste Ausbeute an Monozyten keine signifikanten Unterschiede in Monozyten Lebensfähigkeit zu isolieren, wenn sie mit isolierten Monozyten durch die Einhaltung Methode verglichen. Wiederum nach sieben Tagen, die durch magnetische Trennung getrennt Monozyten in MDDCs differenziert mit deutlich höheren proliferative Kapazität und höhere Menge an Zellen, die doppelt positiven (+ CD11c / CD14 +) Phänotyp ohne MDDC Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Insgesamt unterscheidet sich die aktuelle Studie aus den bisherigen Studien oben Bezug genommen wurde, da es die Fähigkeit beider Techniken demonstriert gleichzeitig Monozyten erzeugen, die von wuchernden fähig sind und Differenzierung in CD11c +MDDCs (> 70%) nach sieben Tagen in Kultur ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Darüber hinaus bietet der derzeitige Ansatz zum ersten Mal Charakterisierung verschiedener CD11c / CD14 MDDCs Populationen von Abbildungs ​​Durchflusszytometrie.

Zusammengefasst, da DCs eine Brenn Rolle in Bezug auf die Forschung im Bereich der Immunologie spielen, müssen verschiedene Parameter berücksichtigt werden , wenn man bedenkt , wie sie abgeleitet sind und welche sind Methoden verwendet , um sie in vitro zu isolieren und Kultur. Daher zielt diese Studie Erkenntnisse über zwei verschiedene Methoden der Monozyten-Isolierung und wie diese Methoden unterschiedlich Monozyten Lebensfähigkeit und Ausbeute schließlich dendritischen Zellen Lebensfähigkeit, Proliferation zu beeinflussen, und Phänotyp beeinflussen. Diese Ergebnisse werden stark auf dem Gebiet der Immunologie beitragen und ein ausführliches Protokoll der DC-Isolierung, Reinigung und Charakterisierung liefern.

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Protocol

Insgesamt menschlichem Blut Studien wurden von der Institutional Review Board (IRB) der FIU, IRB-Protokoll Genehmigung # IRB-13-0440, geprüft und genehmigt. Menschliche leukopaks wurden aus der Gemeinschaft Blutbank in Miami, FL gekauft.

1. Isolierung von PBMCs durch Standarddichte Gradiententechnik

  1. Durchführen einer 1: 1-Verdünnung von Blut mit 1x-phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einem T75-Kolben.
  2. Pipette 15 ml Dichtegradient-Lösung in 50 ml Zentrifugenröhrchen und Schicht sorgfältig (25 bis 30 ml / Röhrchen) des verdünnten Blut über diesen Gradienten.
  3. Zentrifuge für 20 min bei 1200 × g mit einer Beschleunigung von 1 und Verzögerung von 0.
  4. Nach dem Zentrifugieren sammeln, um die Grenzschicht (weiße Blutkörperchen) in eine neue 50 ml Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (3 min bei 1.080 × g). Entsorgen Sie jedes Mal den Überstand.
  5. Behandlung von Zellen mit Ammoniumchlorid-Kalium Lysieren (ACK) Puffer (zur Lyse der roten Blutzellen). 10 ml Puffer und incubate für 15 min bei 4 ° C.
  6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, Zentrifuge 3 min bei 1.080 x g und verwerfen jedes Mal Überstand.
  7. Speichern Sie das Pellet, das die PBMCs enthalten wird.
  8. Fahren Sie mit Monozyten- Reinigungsverfahren der Wahl.

2. Monozyt Reinigung durch Adherence-Methode

  1. Bereiten vollständige Zellkulturmedium, das L-Glutamin (300 mg / ml) und supplementiert mit Penicillin (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) und 10% fötalem Rinderserum.
  2. Erlauben PBMCs für etwa 2 Stunden anhaften , indem sie in einem T75 - Kolben bei einer Konzentration von 5 x 10 7 Zellen pro 10 ml vollständigem Medium bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator kultiviert werden .
  3. Nach der Inkubation Entfernen nicht-adhärenten Zellen aus den Kulturkolben schwimmend und sanft adhärenten Zellen zweimal mit PBS waschen.
  4. Inkubieren adhärenten Zellen in Komplettzellkulturmedium, supplementiert mit 2 & mgr; l / ml von humanem Granulozyten-macrophage Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin 4 (IL-4) in einer Stammkonzentration von 10 ug / ml gelagert.
  5. Ändern Sie die Hälfte des Mediums und füllt Zytokine alle 48 Stunden.
  6. Lassen Sie 5 - 7 Tage die für die Differenzierung von Monozyten in MDDCs.

3. Monozyt Reinigung durch magnetische Trennung Methode

  1. Sammeln Sie PBMCs von Standarddichte Gradiententechnik, gießen Sie in ein 5 ml Polystyrolröhrchen und resuspendieren in PBS-Puffer bei einer Konzentration von Zellen / ml.
  2. In menschlichen Monozyten Anreicherung Cocktail 50 & mgr; l / ml Zellen, gut mischen und Inkubation bei 4 ° C für 10 min.
  3. Nach der Inkubation hinzufügen magnetischen Teilchen 50 & mgr; l / ml Zellen, gut mischen und bei 4 ° C für 5 min inkubiert.
  4. Bringen Zellsuspension auf ein Gesamtvolumen von 2,5 ml bis durch Zugabe von PBS-Puffer, gut mischen durch Pipettieren auf und ab 2 - 3 mal.
  5. Legen Sie das Polystyrolröhrchen ohne Kappe in die Magnetvorrichtung und zur Seite bei RT-Set für 2.5 Minuten.
  6. Nach der Inkubation und in einer kontinuierlichen Bewegung, um den Magneten aufzunehmen und die gewünschte gereinigte Monocyten-Fraktion in ein sauberes 50 ml Zentrifugenröhrchen gießen.
  7. Inkubieren adhärenten Zellen in Komplettzellkulturmedium, supplementiert mit 2 & mgr; l / ml von humanem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin 4 (IL-4) in einer Stammkonzentration von 10 ug / ml gelagert.
  8. Jede 48 Stunden, ändern Sie für 5 min bei 1.080 xg Hälfte des Mediums, des Abschaltens und erneut zu suspendieren Pellet mit neuen Medien (cRPMI) und Zytokinen.
  9. Lassen Sie 5 - 7 Tage die für die Differenzierung von Monozyten in MDDCs.

4. Trypanblauausschluß Viability Assay

Hinweis: Verwenden Sie diese Technik Zellausbeute und die Lebensfähigkeit von PBMCs zu erhalten, Monozyten und MDDCs.

  1. Ernten Sie die Zellen unter Verwendung von Standard-Trypsin-EDTA und führen Sie wäscht der Kolben und das Zellpellet unter Verwendung von PBS. Abhängig von der Größe des Pellets wiederin 5 bis 10 ml PBS suspendieren das Pellet aufzulösen.
  2. In einem Mikrozentrifugenröhrchen, führen Sie eine 1: 1-Verdünnung von Trypanblau Reagenz mit verdünnter Zellpellet.
  3. Aus dieser Mischung aliquote 10 ul in eine Zelle zu zählen Rutsche und Leseergebnisse eine automatische Zellzähler mit dem Protokoll des Herstellers nach. Wenn eine automatische Zellzähler nicht verfügbar ist, eine ähnliche Zellzahl ist möglich, eine Hämozytometer oder einen manuellen Zähler verwenden.

5. MTT Assay

  1. Platten Zellen bei einer Konzentration von 4 x 10 4/100 & mgr; l Vollmedium in jede Vertiefung in einer 96-Well - Platte. Erlauben Sie 24 h für Zellen zur Kultur anzupassen.
  2. Inkubieren und führen Messungen bei 0 (Tag 0), 36 (Tag 3) und 84 (Tag 7) hr sind.
  3. Nach Beendigung der gewünschten Inkubation entfernen Medien und ersetzen mit 100 ul PBS allein.
  4. Bereiten 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid-Lösung (MTT) (5 mg / ml) durch 10 ml dimeth ZugabeSulfoxid yl (DMSO) bis 1 g Natriumdodecylsulfat (SDS).
  5. Zugabe von 10 & mgr; l (5 mg / ml) MTT-Lösung in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 2 weitere Stunden.
  6. Nach der Inkubation entfernen Stände, die PBS und nicht umgesetzten MTT Mischung (gelb-Farblösung) enthalten.
  7. 100 l SDS-DMSO-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für eine weitere Stunde.
  8. Lesen Sie die Absorption bei 540 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader.

6. Zeiloberflächenfärbung Analyse von Imaging Durchflusszytometrie

  1. Nach 7 Tagen der Differenzierung von gereinigten Monozyten, verzichtet werden 1x10 6 Zellen Aliquots der Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in die entsprechende Anzahl von 1,5 - ml - Röhrchen.
  2. Beginnen Zelloberflächenfärbung durch Blockieren Zellen unter Verwendung von 50 ul hitzeinaktiviertem (HALLO) Humanserum, Inkubation bei 4 ° C für 10 min.
  3. Nach der Inkubation Zentrifugen Zellen bei 720 xg für 5 min, Überstand verwerfen.
  4. Zu Zelle pellet, fügen jeweiligen Fluorochrom-konjugierte Antikörper (zB Anti-CD11c oder anti-CD14) und lichtgeschützt für 20 min bei 4 ° C inkubieren. In getrennten Röhren, bereiten einzelne fluorochromgefärbt Proben / ml), da sie für die Kompensation benötigt werden.
  5. Nach der Inkubation, Waschen zweimal Zellen in 1 ml PBS-Puffer und zentrifugieren jedes Mal bei 720 × g für 5 min.
  6. Halten geschützten Zellen aus Licht, resuspendieren in PBS-Puffer bei einer Konzentration von Zellen / 100 & mgr; l für die Durchflusszytometrie-Analyse.
  7. Um auf lebende Zellen zu Gate, fügen 1 ul DAPI zu jedem Röhrchen vor, um die Zellen auf Einzelzell Imaging Durchflusszytometrie Instrument erwerben den Anweisungen des Herstellers nach.

7. Statistische Analyse

  1. Input alle Daten in einer Tabellenkalkulation.
  2. Vergleichen Sie die Ergebnisse der Schüler t-Test und / oder Einweg-ANOVA als angemessen.
  3. Betrachten Unterschiede statistisch signifikant zu sein, wenn p <0,05.

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Representative Results

Monozyten Ausbeute durch magnetische Trennung höher zu Monozyten Ausbeute nach der Adherence - Methode im Vergleich

Die präsentierten Daten in Abbildung 1 Anzeige PBMC und Monozyten - Zellzahl durch den Trypanblau-Ausschluss - Verfahren am Tag der Isolierung von PBMCs und Trennung von Monozyten. Im Durchschnitt durch die Einhaltung Methode isoliert Monozyten entfielen etwa 6,2 Prozent der gesamten PBMCs während durch magnetische Trennung getrennt Monozyten für bis zu 25 Prozent der PBMCs entfielen. Die statistische Analyse ergab, dass der Prozentsatz der Monozyten durch magnetische Trennung ergab waren signifikant höher (≥ 4-fach). Die Daten werden als Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Analyse der t mit ihrem Studenten -Test einen signifikanten Unterschied von Monozyten Ausbeute zeigte , wenn beide Methoden verglichen (p ≤ 0,0005).

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Monozyten Isolation durch Einhaltung und durch magnetische Trennung Nicht Monozyt Viability Affect

Nach Isolierung von Monocyten durch die zwei oben beschriebenen verschiedenen Techniken wurden Lebensfähigkeitstests durchgeführt, um sicherzustellen, dass die verwendeten Methoden nicht zytotoxisch und beeinträchtigt die Lebensfähigkeit der Zellen. Die Daten in Abbildung 2 zeigen den Mittelwert der Prozent lebender Monozyten isoliert entweder durch Anhaften Verfahren oder durch magnetische Trennung dargestellt. Lebensfähige Zellen wurden unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussmethode am Tag der Isolierung gezählt. Vergleichen prozentuale Lebensfähigkeit der Monozyten zwischen den beiden Isolationsmethoden ergeben, dass der Unterschied zwischen beiden Gruppen war statistisch nicht signifikant. Zusätzlich wurde der Mittelwert der prozentualen lebender Monozyten isoliert durch Adhärenz 91,75% ± 1,66 und der Mittelwert der Prozent der lebenden Monozyten isoliert durch magnetic Trennung war 87,4% ± 2.75. Diese Lebensfähigkeit Daten wurden aus mindestens drei unabhängigen Experimenten untersucht. unter Verwendung von Student-t-Test statistische Signifikanz wurde bestimmt.

Die Zellen aus Monozyten durch magnetische Trennung zeigen einen signifikanten Anstieg der Zellproliferation im Vergleich zu Zellen stammen aus Monozyten Erworben von Adherence Verfahren isoliert Abgeleitet

MTT wurde als farbmetrischen Assay verwendet Zellproliferation zu messen. In lebenden Zellen wird die gelbe Farbe von Tetrazol MTT zu purpurroten Formazan reduziert, was leicht ein Spektrophotometer gemessen wird. Die Daten in Abbildung 3 zeigen , dass beide Prozesse von Monozyten Isolierung zu höheren Zellproliferation über einen Zeitraum von 7 Tagen führen , wie durch eine erhöhte Absorptions am Tag 0 (Adhärenz Methode gemessen: 0,22 ± 0,02 vs. Magnetmethode: 0,38 ± 0.02), Tag 3 (Einhaltung Methode: 0,28 ± 0,02, magnetische Verfahren: 0,55 ± 0,05) und am Tag 7 (Einhaltung Methode: 0,36 ± 0,01, magnetische = 0,66 ± 0,006). Jedoch im Gegensatz zu dem XTT-Assay (Daten nicht gezeigt) zeigte die MTT-Assay eine signifikante Erhöhung der Zellproliferation von MDDCs aus durch magnetische Trennung getrennt Monozyten gegenüber MDDCs von Monozyten durch Adhärenz Verfahren am Tag erworben 0 (p = 0,003), Tag 3 (p = 0,006) und Tag 7 (p = 0,002). Die Zellproliferation wurde auch zwischen den Tagen 0 und 3 (p = 0,003) und zwischen den Tagen 0 und 7 (p <0,001) innerhalb der Gruppe von MDDCs aus Monozyten gereinigt durch magnetische Trennung signifikant erwiesen. Weiterhin gereinigt ein signifikanter Unterschied in der Zellproliferation zwischen Tag 0 und Tag 7 in MDDCs von Monocyten durch Adhäsion (p = 0,008) beobachtet. MTT-Assay wurde unter Verwendung MDDCs aus drei verschiedenen Experimenten gewonnen durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von ANOVA und Student-t-Test, p ≤ 0,05 bestimmt wals signifikant angesehen, und p-Werte sind in dem Diagramm festgestellt, es sei denn, keine statistische Signifikanz gefunden wurde.

Charakterisierung von MDDCs von CD11c und CD14 Zeiloberflächenfärbung

Nach der Kultivierung Monozyten für sieben Tage mit IL-4 und GM-CSF, erhalten MDDCs von isolierten Monozyten durch die Einhaltung und magnetische Isolierung Methoden wurden in Abbildung 4 gekennzeichnet. Die Charakterisierung niedrigen CD14 + / CD11c- Phänotyp oder rein monozytären Bevölkerung in beiden Verfahren ergab, Einhaltung = 1% ± 1,0 im Vergleich zu magnetischen = 1% ± 0,0 und eine hohe Gesamt CD11c + Phänotyp, die Einhaltung = 72% ± 11 im Vergleich zu magnetischen = 79% ± 19 wenn jedoch die Gesamt CD14 + Population weiter analysiert wurde, gab es eine hohe Ausbeute an Zellen doppelt positiv für CD11c und CD14 in beiden Verfahren mit magnetischer Trennung eine höhere Anzahl von CD11c und CD14 doppelt positive AngabeBevölkerung, wenn sie die Einhaltung Methode verglichen, die Einhaltung = 49% ± 7 im Vergleich zu magnetischen = 73% ± 15. Obwohl gab es eine höhere Ausbeute an MDDCs mit doppelt positiven Phänotyp über magnetische Trennung, die CD11c positive und CD14 negativen Population von MDDCs höher war in der Einhaltung Methode; Einhaltung = 23% ± 7 im Vergleich zu magnetischen = 6% ± 7. In 4B ist die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) jedes einzelnen Marker an in der gated Bevölkerung sah waren und zeigte eine hohe Intensität von CD14 in CD14 + Population, das entspricht Intensität beider CD11c und CD14 in doppelt positiven Bevölkerung und hohe CD11c Intensität in CD11c + und CD14 Bevölkerung. Zusammenfassend, obwohl magnetische Isolierung ergibt einen höheren Prozentsatz von CD11c + / CD14 + Zellen, die frühzeitig differenziert MDDCs sein kann, die noch nicht die monozytären Marker fallen gelassen haben (CD14), gibt die Einhaltung Methode einen höheren Anteil an CD11c + / CD14, die kann ein Spätstadium sein MDDC Bevölkerung differenziert. in additIon wurde DAPI-Färbung durchgeführt Lebensfähigkeit Ergebnisse zu bestätigen und Charakterisierung von lebenden MDDCs durchgeführt, um sicherzustellen, wurde. Der prozentuale Anteil der DAPI negativ / lebenden Zellen (Einhaltung = 76 ± 7 im Vergleich zu magnetischen = 67 ± 1) unterscheiden sich nicht signifikant zwischen den beiden Methoden, beide Methoden zu bestätigen nicht die Lebensfähigkeit der MDDCs nach sieben Tagen in der Kultur beeinflussen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Monozyt Ausbeute durch magnetische Trennung ist höher im Vergleich zu Monozyten Ausbeute nach der Adherence - Methode. Etwa 6,2% der Monozyten wurden aus PBMCs mit der Einhaltung Methode isoliert , während ~ 25% der Monozyten wurden unter Verwendung der magnetischen Trennverfahren erhalten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Analyse unter Verwendung von Student-t-Test zeigte einen signifikanten Unterschied von Monozyten Ausbeute, wenn beide Methoden zu vergleichen(p = 0. 00005). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Monozyten Isolation durch Einhaltung und durch magnetische Trennung wirken sich nicht auf Monozyten Viability. Der Mittelwert der Prozent der lebenden Monozyten durch die Einhaltung isoliert war 91,75% ± 1,66 und der Mittelwert der Prozent der lebenden isolierten Monozyten durch magnetische Trennung war 87,4% ± 2.75. Die Daten werden als Mittelwert ± SD Prozentsatz der lebensfähigen Zellen von mindestens drei unabhängigen Experimenten. War kein signifikanter Unterschied in der Lebensfähigkeit der Zellen beobachtet , wenn beide Reinigungsmethoden zu vergleichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Die Zellen von isolierten Monozyten durch magnetische Trennung Abgeleitet zeigen einen signifikanten Anstieg der Zellproliferation im Vergleich zu Zellen , die aus Monozyten Acquired von Adherence Methode. Ein signifikanter Anstieg der Absorption wurde für beide Methoden beobachtet sowohl bei Tag 3 und 7 Tage , wenn die Werte zu vergleichen gegen ihre jeweiligen Kontrollen von Tag 0 Zusätzlich ANOVA und zeigte einen signifikanten Unterschied in der Absorption der MTT-Aufnahme auch t-Test nach Student, wenn beide Methoden zu vergleichen (p ≤ 0,05). Die Daten werden als Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Charakterisierung von MDDCs durch CD11c und CD14 Zeiloberflächenfärbung. A) Balkendiagramm , die die verschiedenen Populationen (% gated aus einzelnen Zellen). Zunächst wurden DAPI- (lebend) Zellen, die aus insgesamt einzelnen Zellen gated. Dann CD14 + / CD11c-, CD11c +, CD11c + / CD14 + und CD11c + / CD14 wurden aus DAPI- (lebend) Bevölkerung gated. CD11c + Bevölkerung ist die Summe von zwei Bereichen CD11c + / CD14 + und CD11c + / CD14-. B) Repräsentative Graphen für die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) -Werte sowohl CD11c und CD14 in jeder Subpopulation von Zellen. C) Repräsentative Streudiagramme von Zellen zeigt markiertem mit CD11c-APC und CD14-APCcy7 auf DAPI negativ (lebend) Zellpopulation gated für sowohl magnetische als auch die Einhaltung Methoden. Repräsentative Bildgalerie von Einzelzellen (in Blau in den Streudiagramme ausgewählt), die zu jeder Subpopulation von Zellen, CD11c + / CD14 (gated in orange), CD11c + / CD14 + (gatedin rot) und CD14 + (in lila gated). In der Fotogalerie von einzelnen Zellen, stellt die rote Farbe markiert CD11c mit APC und gelbe Farbe steht für CD14 mit APCcy7 markiert. In den Streudiagramme, die zum Tor gewählten Farben die Populationen sind zufällig und nicht den tatsächlichen Zellbildern korrelieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Basierend auf den bekannten Schwierigkeiten bei der Isolierung und MDDCs aus menschlichem Blut, ist die vorliegende Studie zielte darauf ab, um einen umfassenden Vergleich von zwei etablierte Methoden zur Erzeugung von MDDCs erzeugen. Das erste Verfahren ist im Vergleich eine gut etablierte traditionelle Methode zur Erzeugung MDDCs durch die Fähigkeit der Monozyten Ausnutzen auf Glas oder Kunststoff (Adhärenz - Methode) 21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist schnell und kostengünstig, und erfordern nicht die Verwendung komplexer Geräte. Allerdings enthalten einige Nachteile dieses Verfahrens Lymphozyten - Kontamination, geringe Flexibilität, Monozyten transiente Manipulation 22,30,31. Das zweite alternative Verfahren verglichen ist die magnetische Isolierung von Monozyten aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) eines menschlichen Monocyten - Anreicherungs Kit 26, die ausgelegt ist Monozyten aus PBMCs durch negative Selektion zu isolieren. Der Vorteil dieser Isolationsmethode besteht darin, daß die unerwünschten Zellengekennzeichnet sind und getrennt einen Magneten, während die Zielzellen verwendet werden, ohne die Notwendigkeit von Spalten in ein neues Röhrchen frei abgegossen und ohne direkt die Zellen mit Antikörper-Targeting. Unabhängig von Monocyten Isolationsmethode (adhärente vs. magnetische Trennung) nach beiden Verfahren, einer der kritischen Schritte in dem Protokoll ist das in vitro - Stimulation von Monozyten mit Granulozyten - Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin-4 ( IL-4), die erforderlich sind, MDDCs zu erzeugen. Dies ist ein gemeinsames und gut etablierten Protokoll MDDCs aus einkernigen Blutzellen zu erzeugen , ohne 32 - Antigen Erfassung und Verarbeitung Kapazität charakteristisch für unreife MDDCs zu beeinträchtigen. Eine der Haupteinschränkungen der Techniken , die üblicherweise für die in vitro Erzeugung von DCs verwendet wird , ist die geringe Ausbeute von Vorläuferzellen, wie Monozyten. Wie oben berichtet, durch die Einhaltung Methode isoliert Monozyten entfielen etwa 6,2 Prozent der gesamten P-BMCs, Während durch magnetische Trennung getrennt Monozyten entfielen bis zu 25 Prozent von PBMCs. Nach der Literatur reicht für differentielle Anzahl der weißen Blutkörperchen in normalen Erwachsenen für Monocyten ist 2 bis 1% der gesamten Blut mononukleäre Zellen 20-10% 31 während nur DCs 0,1 bilden. Daher ist die hohe Ausbeute an Monozyten (~ 25%) nach der magnetischen Trennung erhalten konnte wegen Verunreinigung der Zellpopulation und der Mangel an Antikörper und / oder magnetische Teilchen, um unerwünschte Zellen bindend.

Um eine hohe Ausbeute und Reinheit der isolierten Monozyten, alle kritischen Schritte in dem Protokoll erreichen, sollte unbedingt beachtet werden. Bei der Isolierung von PBMCs von Blut durch Standard Dichtegradientenzentrifugation, gibt es ein paar wichtige Schritte. Zuerst Pipettieren und sorgfältig Schichtung von Blut über Dichtegradient-Lösung in 50 ml Zentrifugenröhrchen ein Schritt, der hart Praxis erfordert, da Pipettieren das Mischen dieser Lösung und Blut verursachen können,das kann zu einer schwachen PBMC Schicht führen, die schwer zu isolieren, oder es kann in der Gesamtmischung von roten Blutkörperchen mit PBMCs führen. In diesem Schritt ist es wichtig, eine konstante und relativ langsamen Fluß des Pipettierens zu halten eine wohldefinierte Schicht aus Blut und eine deutliche PBMC Schicht. Zweitens Zentrifugation in dem nächsten Schritt mit der Beschleunigung und Abbremsung 1 0 ist sehr kritisch. Wenn diese Einstellungen nicht zum ersten Zentrifugationsschritt verwendet werden, wird es mit dem Dichtegradientenlösung erratisch zu Mischen des Blutes führen und wird nicht die PBMCs aus dem Rest der Blutkomponenten zu trennen. Drittens ist es wichtig, die PBMCs mit Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer für nicht länger als die optimierte Zeit zu inkubieren (10 bis 15 min), da längere Inkubation mit ACK kann zusammen mit roten Blutzellen zu einer Reduktion der lebensfähigen PBMCs führen . Darüber hinaus ist es auch wichtig, die PBS Waschungen nach ACK Inkubation durchzuführen. Jedoch werden, wenn die roten Blutzellen nicht mit dem ersten lysiertACK Schritt und sie noch weiter nach Wäschen zu erscheinen, wird eine weitere Runde der ACK Lysiereinrichtung sehr zu empfehlen.

Nach der Isolierung von weißen Blutkörperchen, gibt es ein paar wichtige Schritte im Auge zu behalten, wenn die Einhaltung Durchführung dieses Verfahrens Monozyten zu erzeugen. Erstens ist die schwimmenden Lymphozyten nach zwei Stunden PBMCs Inkubation Abwaschen sehr wichtig, da das Vorhandensein von Floating-Lymphozyten führen kann weniger Monozyten auch zu haften und kann in niedrigeren MDDC Reinheit führen. Obwohl diese Waschschritte kritisch, übermäßige und harte Waschen sind (mehr als empfohlen, dh zweimal) kann Waschen verursachen die anhaftenden Monozyten zu aus, was zu niedrigeren Monozyten Ausbeute führt. Zweitens wird die Zellen mit komplettem Medium und Zytokine Inkubieren kritisch, da die Zytokinen zur Differenzierung von Monozyten in MDDCs verantwortlich sind. In Ergänzung, Medien und Auffüllen der Zytokine alle 48 Stunden zu ändern ist wichtig für die Differenzierung und das Überleben der Zellen. Während Medien ändern, ist es auch entscheidend, um die schwimmenden MDDCs zu speichern und sie zusammen mit frischen Medien und Zytokine wieder in Kultur zurückkehren, da es einige MDDCs sind, die von der Oberfläche während des Prozesses der Differenzierung lösen kann. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die Monozyten in der empfohlenen Konzentration ausgesät werden, angebracht und eng beieinander liegenden, weil sie von Zelle zu Zelle Kontakt brauchen, um zu wachsen. Wenn die magnetischen Trennverfahren durchführt Monozyten zu erzeugen, gibt es einige wichtige Schritte, um eine gute Ausbeute und hoher Reinheit von Monozyten zu erhalten. Erstens ist es wichtig, die Zellkonzentration vom Hersteller empfohlenen aufrechtzuerhalten. Es ist auch wichtig, nicht das Polystyrolröhrchen stören, wenn in dem Magneten angeordnet ist, wie es zu geringeren Ausbeute und geringeren Reinheit führen. Wie oben dargestellt, führt diese Technik zu einer wesentlich höheren Ausbeute Monocyten (Abbildung 1) , wenn auf die Einhaltung Verfahren verglichen, die auf die Anwesenheit anderer c in Beziehung gesetzt werden kannells. Ferner wird, wenn die Zellen durch Durchflusszytometrie charakterisiert wurden, die magnetische Verfahren zeigt einen höheren Anteil an doppelt positiven Zellen (CD11c + / CD14 +), die mit der Anwesenheit von anderen Zellen oder kann auch sein, aufgrund der Anwesenheit von unterschiedlichen Stufen von MDDC korrelieren Differenzierung.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der in vitro MDDC Generation unabhängig von Ausbeute und Reinheit ist die Fähigkeit , lebensfähig und proliferative MDDCs zu erzeugen. Die vorliegende Studie belegt , zu zeigen , dass beide Reinigungsverfahren Proliferation von MDDCs (Abbildung 3) induzieren , wie durch die Zunahme der Zellstoffwechselaktivität während sieben Tage in Kultur gezeigt. Darüber hinaus zeigte die Erzeugung von MDDCs aus Monozyten gereinigt durch magnetische Trennung eine deutlich höhere Proliferationsrate zu MDDCs aus Monozyten gereinigt durch Adhäsion (Figur 3) erzeugt vergleichen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit früheren Literatur zeigt, daß generation von DCs von CD34 + Zellen ist eine proliferative Prozess aufgrund des Vorhandenseins von proliferativen DC - Vorläufern in menschlichem Blut 27, 33. Allerdings gibt es kontroverse Erkenntnisse zeigen , dass Monozyten auch in DCs ohne Nachweis der Proliferation 34,35 unterscheiden kann. Es ist wichtig , darauf hinzuweisen , dass es eine Menge Kontroversen über die in vitro - Erzeugung von DCs ist und darüber , ob DCs aus wuchernden Vorstufen erzeugt werden oder aus der Differenzierung von Monozyten. Zum Beispiel in - vitro - Produktion von DC von anhaftenden peripheren Blutzellen wurden nach dem Belichten der Proliferation fähig sind , zu GM-CSF 27 und es gibt auch demonstriert Beweise gezeigt , auch für Vorläuferzellen anreichern , die die Ausbeute an DCs in der Gegenwart abgeleitet von GM-CSF und IL-4 nicht über die Anzahl der Ausgangs Monozyten 33 erweitert werden. Insgesamt zeigt die aktuelle Studie eine der Proliferation von mon erhöhtocytic Zellen in Kultur, die in einer Gesamt MDDCs Bevölkerung mit> 70% CD11c + Phänotyp (Einhaltung = 72% ± 11 im Vergleich zu magnetischen = 79% ± 19) um sieben Tage zur Folge haben. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass, wenn eine weitere phänotypische Analyse durchgeführt wurde, wenn auch nicht signifikant, die durch die magnetische Trennverfahren isoliert Monozyten ergab MDDCs mit einem höheren doppelt positiven Phänotyp (Adhärenz = 49% ± 7 CD11c + / CD14 + Vergleich zu magnetischen = 73% ± 15 CD11c + / CD14 +), während die durch Adhäsion isoliert Monozyten in MDDCs mit einem höheren einzigen positiven Phänotyp (Einhaltung = 23% ± 7 CD11c + / CD14 gegen CD11c magnetische = 6% ± 7 geführt + / CD14). MDDCs mit einem höheren doppelt positiven Phänotyp (CD11c + / CD14 +) unter frühen Stadien der Differenzierung während MDDCs mit einem höheren einzigen positiven Phänotyp unter späten Stadien der Differenzierung sein kann.

Zusammenfassend liefert diese Studie Hinweise darauf, dass die negative Selektion magnetische Trennung procedur zu unterstützene Monozyten erzeugt die höchste Ausbeute an Monozyten keine signifikanten Unterschiede in Monozyten Lebensfähigkeit zu isolieren, wenn sie mit isolierten Monozyten durch die Einhaltung Methode verglichen. Wiederum nach sieben Tagen, die durch magnetische Trennung getrennt Monozyten in MDDCs differenziert mit deutlich höheren proliferative Kapazität und höhere Menge an Zellen, die doppelt positiven (+ CD11c / CD14 +) Phänotyp ohne MDDC Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Wenn beide Verfahren zu vergleichen, wurden die Ergebnisse die Fähigkeit beider Techniken demonstriert gleichzeitig Monozyten erzeugen , das von proliferierenden fähig sind (Bild 3) und Differenzieren (Abbildung 4) in CD11c + MDDCs nach sieben Tagen in Kultur , da beide Methoden ergab> 70% CD11c + MDDCs . Doch eine weitere Analyse bei der Reifung Marker suchen kann nützlich sein, um voll und ganz die funktionelle MDDC Bevölkerung charakterisieren. Abschließend werden beide Methoden vorteilhaft, Alternativen zur Isolierung von CD11c + MDDCs und proveine ausreichende Ausbeute für Forschungsanwendungen IDE- und auch für zukünftige klinische Anwendungen nützlich sein kann. Das Labor konzentriert sich derzeit auf die Erzeugung von MDDCs die Auswirkungen von Alkoholmissbrauch und andere Substanzen des Missbrauchs auf das angeborene Immunsystem zu studieren, insbesondere die Fähigkeit dieser Substanzen MDDC Phänotyp und Funktion zu ändern. Daher wird die aktuelle Studie eine Baseline von MDDC Charakterisierung bieten und die Fähigkeit zu verbessern durch weitere Experimente, um fortzufahren, die molekularen Mechanismen vermittelnde Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellfunktion im Zusammenhang mit Substanzmissbrauch aufzuklären.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque GE Healthcare 17-5442-03 Must be used at RT
Phosphate-buffered saline (PBS) Life Technologies 10010-023
ACK Lysing buffer Quality Biological 118-156-101
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Antibiotic-Antimycotic (100x) Life Technologies 15240-062
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000-044
RoboSep buffer StemCell 20104
EasySep Human monocyte enrichment kit StemCell 19059
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0101
FITC-Dextran Sigma Aldrich FD4-100MG
Trypan blue stain (0.4%) Life Technologies 15250-061
Synergy 2 multi-mode reader Biotek 7131000
XTT Sodium salt bioreagent (XTT) Sigma Aldrich X4626-100MG
Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) Sigma Aldrich D8418-500ML
Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Sigma Aldrich m5655-500MG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0302
Phenazine Methosulfate (DMSO) Sigma Aldrich P9626-1G
Inactivated (HI) Human Serum Chemicon S1-100ML
Accuri C6 Flow Cytometer BD Accuri 653119
FlowSight Amnis Flow Cytometer EMD Millipore 100300

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References

  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  4. Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
  5. Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
  6. Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
  7. Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
  8. Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
  9. Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
  10. Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
  11. Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
  12. Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
  13. Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
  14. Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
  15. Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
  16. Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
  17. Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
  18. Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
  19. Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
  20. Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
  21. Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
  22. Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
  23. Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
  24. Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
  25. Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
  26. Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
  27. Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
  29. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  30. El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
  31. Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
  32. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
  33. Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
  34. Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
  35. Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
  36. Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
  37. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
  38. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
  39. Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
  40. Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).

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