Summary
diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.
Introduction
Diyabet bozulmuş glikoz dengesinin ortak uç noktasını paylaşan bozuklukların bir koleksiyon kapsar. Diyabet alt tiplerinin patojenik mekanizma belirgin olmasına rağmen, azalmış β-hücresi kütlesi, yani insülin üretim kapasitesi 1,2 kaybı sonucu paylaşır. Halen, diyabet tedavi stratejileri eksojen insülin, insülin üretimi veya insülin duyarlılığı geliştirme farmakolojik stimülasyon kronik idaresi itimat ve nadiren, pankreas adacık ya da tüm pankreas 3,4 nakli. Ne yazık ki, bu stratejilerin başarısı kısa sürelidir ve / veya yeterince endojen insülin üretiminin işlevini özetlemek için başarısız olur. β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için bir yöntem geliştirme programı olmasına rağmen, böyle bir yaklaşım var. Sonuç olarak, büyük bir şeker araştırma hedefi, yeni bir β-hücrelerinin üretilmesi için ya da endojen β-hücresi kütlesi 5 genişletmek için yöntemler geliştirmektir 6,7 dahil olmak üzere alternatif stratejileri, takip edin. Önemli olarak, in vivo olarak, yeni β-hücrelerinin baskın kaynağı önceden var olan β-hücrelerinin yerine özel bir progenitör hücreler 8,9 olan. β-hücrelerinin, sınırlı çoğaltma kapasitesine, β-hücresi kütlesindeki küçük bir artış sahip gibi görünmektedir, ancak (~% 30) pek çok diyabet hastası glukoz homeostazisin yeniden için yeterli olabilir. Ayrıca, β-hücresi kütlesi yerinde farmakolojik stimülasyon potansiyel olarak pahalı olmayan ve ölçeklenebilir bir tedavi stratejisidir. Burada β-hücresi büyümesini teşvik küçük molekülleri tanımlamak ve ayırt etmek için yüksek içerik tarama yöntemi sunulmaktadır.
In vitro deney yöntemleri çeşitli gen ürünlerini ve / veya molekülleri tha tanımlamak için kullanılabilirt birincil β-hücre çoğalmasını teşvik. Β-hücre replikasyonu indüksiyonunu ölçen ilk çabalar, belirli bir tedavi koşullarında 10 yanıt olarak aldehit tiyonin veya insülin lekeli nüfus içinde [3H] timidin eklenmesini, BrdU dahil ve mitotik organları ölçmek için, fetal kemirgen pankreası kültürü ya da dokunulmamış izole adacığı kültürleri kullanılan 11. Bunlar in vitro yaklaşımlar ve yakın varyantları birkaç sınırlamaları vardır. Tanınmış eksiklikler olgun β-hücrelerinin aksine, yüksek bazal β-hücre çoğaltma oranı görüntüleyebilir ve farklı bir şekilde 12 düzenlenen büyümesi, fetal hücrelerin (1) kullanımını içerir; (2) β-hücre çoğaltma olaylarının deneyci bağımlı yargı öznel doğası; (3) β-hücre çoğaltma olaylarının deneyci bağımlı sayım emek ve zaman yoğun doğa deneysel verim geciktirir; Nükleer kuruluş / leke / görünüm (4) kullanımı bile çoğaltma tanımlamak içints ve β-hücreleri belirlemek için bir üst üste binmeyen sitoplazmik leke hücreleri olan B için yakın olmayan β-hücre replikasyonu etkinlikleri yanlış atıf yol açar.
Daha yakın zamanda, olgun primer β-hücrelerinin β-hücresi çoğaltma 13-16 aşırı ifade transgenin etkisini hem de gen ürünü ya da bileşim tedavisi değerlendirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar, çoğaltma etkinlikleri, β-hücresi tanımlama ve / veya hacmini sınırlayan bağımlı adımlar, örneğin, hücre ya da sağlam adacık bir kayma oyuklu kaplama için sitoplazmik staining- veya spesifik olmayan yöntemlerin ilgili sayımı dayanmıştır parafin gömme ve işleme 17. Özellikle, burada sunulan birine benzer bir görüntü tabanlı insan β-hücre çoğaltma tarama yöntemi, 18 yayımlanmıştır; FEA Ancak, bu testin başarılı bir kullanımı ortaya konmamıştır ve birinci tarama için insan adacık kullanımı genel olarak olmayabilirsible.
replikasyon teşvik maddelerin belirlenmesi için alternatif bir strateji, β-hücresi çizgilerinin büyümesi indüksiyonunu değerlendirmek için. İlk çabaları dönüştürülmüş β-hücre hatları gibi min6 hücreleri ya da INS 832/13 hücreleri 14,19-21 kullanılır. Ancak, bu hücre hatları kontrolsüz büyüme gösteren ve iyi diferansiye β-hücreleri 22 az benzerlik taşımaktadır. Sonuç olarak, büyüme-indüksiyon kapasitesi, en az belirsiz alaka ve recapitulate bazen zordur. Hücre satırı tabanlı tarama için geliştirilmiş bir strateji tetrasiklin (doksisiklin) yokluğunda tutuklanan büyüme bağımlı SV40 T antijeni ifade 23,24 olan hücreler "geri dönülebilir dönüştürülmüş" kullanmaktadır. Ancak, bu hücrelerin doksisiklin kaldırılması üzerine "normal" bir β-hücre benzeri duruma dönmek belirsizdir. Ne yazık ki, bu hücrelerin kullanımı derhal kullanıma sahip görünmüyor genelleştirilmiş büyüme destekleyici bileşikler vermiştir24. Genel olarak, en az spontan replikasyon aktivitesi gösteren bir hücre tipi büyüme düzenleme çalışma hücre çizgilerinin kullanımı kısıtlı kullanımı olabilir.
Burada sunulan β-hücre çoğaltma tarama platformu mümkün olduğu ölçüde, soy-kısıtlı büyüme destekleyici faaliyetlerin tanımlanmasını sağlamak için karma hücre tipi bileşiminin adacık hücre kültürleri, multi canlılarda büyüme yönetmelikte korumak için olgun birincil sıçan β-hücreleri kullanır eh verimlilik ve otomatik analiz maksimize etmek biçimlendirme önyargı ortadan kaldırmak ve verimi kolaylaştırmak için. Bu platformun başarılı kullanımı β-hücre çoğaltma 25,26 teşvik birkaç bileşiklerin belirlenmesini sağladı. Ayrıca, tahlil β-hücre çoğaltma moleküler regülasyonu içine mekanistik anlayış sağlamak için yapı-aktivite ilişkisi çalışmaları ve kimyasal epistasi deneyleri için kullanılır olmuştur. sunulan platformu başarıyla fo uyarlanmıştırβ-hücre çoğalmasının r lentiviral RNAi tabanlı soruşturma 25 yolaklarıyla. tahlilinde sınırlamaları (birincil hücre kullanımının) ölçeklenebilirlik Kısıtlı'dır yerine antikor bazlı görüntüleme ve primer adacık kullanım, kullanım ile bağlantılı (deney insan doku adacığı çalışmaları için adapte edebilir) insan doku adacığı hücrelerinden, giderleri daha kemirgen kullanımı görüntü elde etme ve analiz yeteneği ile otomatik mikroskop doluluk durumuna bağlı olarak otomatik görüntü toplama ve bağımlılığını kolaylaştırmak için dağınık adacıklar (bozulmuş adacık mimarisi). Gen ürünlerinin ya da in situ β-hücresi rejenerasyonunu teşvik eden bileşiklerin belirlenmesi için basit, in vivo bir tarama yöntemi ideal olacaktır, ancak bu platform yapılmamış 27 kullanılamaz. Sonuç olarak, açıklanan platformu β-hücre çoğalmasının en yönlerini araştıran ilgilenen araştırmacı için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Stanford Üniversitesi Tıp Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. adacık hücre replikasyonu değerlendirilmesi için 384 oyuklu plakanın 228 kuyu üretilmesi için yeterli olan - (9 haftalık 8) erkek Sprague Dawley sıçanlarında, 300 g - açıklanan protokol altı 250 doku adacığı izolasyonu ölçeklenir.
1. Malzeme Hazırlama
- 15 cm'lik bir doku kültürü kabı 28 3 gün birleştiği noktada muhafaza 804G fare mesane kanseri hücre koşullu ortam (RPMI-1640 20 mi) toplayarak doku adacığı izolasyonu başlatmadan önce kaplama ortamı hazırlar. Steril filtre ve mağaza (-20 ° C), daha sonra kullanılmak üzere koşullu ortam.
- cerrahi aletleri sterilize (bir 12 cm dişli doku forseps, bir 11.5 cm ince makas, bir 14.5 cm cerrahi makas, iki 16 cm kavisli forseps, bir 12 cm kavisli hemostat, bir 12 cm neşter sapı) ve init önce bir 30 gözlü doku elekadacık izolasyon iating.
- Bir% 60 eritilerek pankreatik sindirim çözeltisi hazırlayın: Saflaştırılmış sınıf I% 40 karışımı: sınıf II kollajenazlar (300.000 toplam kolajenaz aktivitesi - 400.000 birim), kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş 1 x Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS), 60 ml. Yük buz üzerinde 1 "22 G iğne ve yerine 10 ml şırınga (altı) olarak pankreas sindirim tamponu, 10 ml.
Not: sindirim çözeltisi, 10 ml sıçan başına enjekte edilmiştir. buna göre Scale. - ketamin 1.3 ml (100 mg / ml), ksilazin 0.2 ml (100 mg / ml) ve 3 mL PBS karıştırılarak bir havalandırılmış başlığı içinde anestezi kokteyl 4.5 ml hazırlayın. adacık izolasyonu başlatılması 1 saat içinde anestezik kokteyl hazırlayın.
- HBSS 500 ml yeni doğmuş dana serumu, 25 ml ekleyerek yıkama tamponu hazırlayın. daha sonra kullanmak için buz üzerinde yıkama tamponu yerleştirin.
- Düşük glukoz Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM), 5, 500 ml adacık ortamın 1 şişesi hazırlayın0 ml cenin sığır serumu (FBS), penisilin 5000 ünite / ml streptomisin 5.000 ug / ml olmuştur.
- % 2 FBS, 2 mM glutamin, 5 mM glukoz, penisilin 5000 ünite / ml streptomisin 5.000 ug / ml işlevsellik / canlılığı çözeltisi (500 mi) doku adacığı fonksiyonu orta hazırlayın. Daha sonra kullanmak üzere adacık fonksiyonu medya (4 ° C) saklayın.
- 1X fosfat tamponlu salin içinde 37.38 ml (PBS) 2.5 mi eşek serumu ve 0.12 ml Triton X-100 eklenmesi ile bloke edici tampon 40 mi hazırlayın. daha sonra kullanmak için mağazası bloke tamponu (4 ° C).
- protokolü başlamadan önce gerekli antikorları edinin.
Not: PDX-1 (TRITC), Ki-67 (FITC) eş boyama primer β-hücresi çoğaltma taranması için kullanılır. nükleer (DAPI), PDX (Cy5) ve KI-67 (FITC) boyama ile birlikte, soya özel çoğaltma analiz edilmesi için ilave hücre kimliği belirteçleri (TRITC insülin, glukagon, vimentin ya da somatostatin) için immünofloresan boyama yapar. alternatif temsilcisilication belirteçler, örneğin, PCNA, de kullanılabilir. - dört nüsha olarak gerçekleştirilen her tedavi koşulu ile bir 228-kuyu tedavi planı hazırlayın. (: 666 seyreltme DMSO 1) kuyular pozitif-(5-iyodotübersidindir [1 uM] veya dipiridamol [15 mM]) ve araç kontrolü ekleyin.
Pankreas 2. perfüzyon
- seyreltilmiş anestezik kokteyl çözeltisi (0.30 mL / 100 g vücut ağırlığı) IP enjeksiyonu ile sıçanlarda anestezisi. Sıçan tam anestezi ve ağrılı uyarılara tepkisiz sonra, servikal dislokasyon gerçekleştirin.
- kağıt havlu bir yığın yatar pozisyon (kranial-kaudal yönde) ötenazi sıçan yerleştirin ve% 70 etanol ile karın bölgesini püskürtün.
- U-kesi (kasık bölgesinde baz) ile karın boşluğuna açın ve karın boşluğuna maruz göğüs üzerinde rostral yönde cildi geri çekin.
- Dikkatle, kavisli bir forseps iki çift kullanarak duodenum kapmak ortak b duodenum girdisini bulunile kanal (Oddi sfinkter) ve kavisli hemostatla papillada duodenum açılış kelepçe.
- koledok papilla kelepçe ve kavisli bir forseps kullanarak karaciğere yakın safra kanalı kapmak için kullanılan kavisli hemostat kaldırın. yalıtmak ve safra kanalı ortaya çıkarmak için kavisli bir forseps ile künt diseksiyon kullanın.
- Baş proksimal ve ayak distal ile sıçan yerleştirin.
- Bir pankreas sindirim çözeltisi ile kistik ve hepatik kanalların birleştiği ortak safra kanalı da (MİA) ya da sadece uzak cannulate 10 ml şırınga -yüklü ve yavaş yavaş pankreas sindirim çözeltisi 10 ml enjekte edilir. enjekte ederken, bir neşter sapı ile CBD destek. kanal ve pankreas şişirmek için başarısız olursa iğne yerleştirin.
- inen kolon, bağırsak, mide ve dalak ayırmak için kavisli bir forseps ve ince makas kullanarak şişirilmiş pankreas kaldırın. 5 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içinde buz üzerinde, şişirilmiş pankreas yerleştirin
Pankreas 3. Ayrışma
- Bir kez tüm pankreata, toplanan 15 dakika süreyle 37 ° C su banyosu içine sindirim tüpü yerleştirmek edilir. Tüpleri yavaşça her 3 dk girdap.
- 15 dakika sonra, şiddetle boruları (dikey) 10 kez sallayın ve soğuk yıkama tamponu 10 ml ekleyin. Şiddetle boruları ek 5 kez sallayın ve buz üzerine yerleştirin.
- Tüpler, 5 kez ters yüz edilerek gibi soğuk yıkama tamponu ile bir karışımı, 50 ml sindirim tüpü doldurmak.
- 1 dakika boyunca 4 ° C'de 97 x g'de tüpler santrifüj ve süpernatant dökün. pelet haline doku çıkarmak için dikkatli olun.
- 25 ml yıkama tamponu ekleyin ve hafifçe karıştırın doku yeniden askıya. Tekrarlayın iki kez daha 3.4 ve 3.5 adımları tekrarlayın.
- Bir st üzerinde 30 gözlü doku elek yerleştirin250 ml beher erile ve elek üzerine doku süspansiyonu dökün. Yıkama tamponu ilave 20 ml ile sindirim borusunu yıkayın ve örgü üzerine dökün. sindirilmemiş pankreas ve yağ dokuları bu aşamada çıkarılır.
- İki yeni bir 50 ml'lik tüplere süzüldü malzeme dökün ve 4 ° C'de 1 dakika için 97 x g'de iplik doku topağı. Durusu süpernatant ve invert tüpleri aşırı tampon süzün.
Adacık 4. saflaştırılması
- tanelenmiş pankreas dokusu soğuk polisükroz / sodyum Diatrizoate çözeltisinin 20 ml (1.119 ug / ml yoğunlukta) eklenir. Homojen hafifçe yukarı pipetleme ve beş kat aşağı her tüpün içeriğini yeniden askıya.
- Yavaşça 10 ml HBSS ile polisükroz / sodyum diatrizoate çözümü kaplaması. yavaş yavaş tüp duvarı boyunca HBSS ekleyerek keskin bir sıvı arayüzü koruyun.
- Yavaş hızlanma ve hiçbir fren 15 dakika (4 ° C) 560 xg'de sindirilmiş pancreata santrifüj.
- CoTaze 50 ml tüpler içinde 10 ml pipet ve yer adacıklar kullanarak arayüzü adacık katmanı llect. Bu aşamada adacıklar havuz yok.
- 4 ° C'de 140 x g'de 1 dakika boyunca, her bir 50 ml tüp ve spin yıkama tamponu 40 ml ekleyin.
- Süpernatantı dökün ve boruları birkaç kez ters yüz edilerek yıkama tamponu 50 ml toplanmış adacıklar yeniden askıya. Bir pelet adacıklar toplamak için 4 ° C'de 97 x g'de 1 dakika için tüpler santrifüjleyin.
- Yıkama tamponu dökün ve yıkama tekrarlayın. doku kültürü kaputu içine adacıklar getirin ve süpernatant aspire.
- Adacık orta 6 ml adacıkların her tüp yeniden askıya.
- Altı oyuklu doku kültürü kabına her bir 50 ml tüp adacıklar aktarın. Kuyunun ortasına adacıklar toplamak ve bir mikroskop altında adacık kalite ve saflıkta gözlemlemek için 6-çukurlu bir tabak döndürülür.
- El ile 1 ml pipet kullanarak adacıklar toplamak ve bitişik içine aldı adacıklar transferide doku adacığı ortam 6 ml ihtiva etmektedir. Tekrarlayın adacık dönen ve 90> kadar% saflık toplama elde edilir.
- Adacık ortamı 20 ml içeren 10 cm'lik bir doku kültürü kabı saflaştırılmıştır adacıklar aktarın.
- Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde yer adacıklar (37 ° C,% 5 CO2), gece boyunca (Şekil 1A).
- Adacık hücrelerinin, her kat de 804G koşullu ortamın 40 ul 384 gözlü bir levhanın gözleri kaplama hazırlanmasında. bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin.
5. Dağılma ve adacık hücresi Kaplama
- Ertesi gün, nazikçe hücre kazıyıcı ile 10 cm çanak adacıklar ayırmak ve 50 ml'lik bir tüp içine adacıklar aktarın.
- Oda sıcaklığında 22 xg'de 1 dakika için santrifüjleme ile adacıklar Pelet. süpernatant aspire.
- ılık PBS, 20 ml adacıklar yıkanır ve yukarıdaki gibi süzün.
- % 0.25 tripsin adacıklar (sıçan pankreas başına 150 ul yeniden askıya10 dakika için 37 ° C 'de) ile inkübe edilir. Pipet adacıklar ve aşağı 10 kat inkübasyondan 5 ve 10 dakika sonra 1 mL pipet kullanılarak.
- 10 dakika sonra, tam bir sindirim sağlamak ve bir hemositometre kullanılarak adacık hücreleri saymak için mikroskop altında tripsinize adacık 20 ul örnek değerlendirir. 5 dakika ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez daha - sindirilmemiş adacıklar kalırsa, ek 3 inkübasyon devam ediyor. Gerektiği kadar tekrarlayın.
Not: Tipik verim ~ 125.000 olan - sıçan başına 150.000 adacık hücreleri. - inkübatör 804G klimalı ortam kaplı 384-plaka çıkarın ve bir 12-iyi manifoldu aspiratörü kullanarak ortamı çıkarın.
- Adacık fonksiyonu ortamı içinde ml başına 45.000 hücre yoğunluğunda doku adacığı hücre askıya alma ve çok kanallı bir pipet (Şekil 1B) ile oyuk başına 70 ul (3.150 hücre) plaka.
Not: Dış kuyularda bulunan β-hücrelerinin N ve sütunlar 4 plaka kullanım satırlar C çevresine doğru göç eğilimi nedeniyle21 6 sıçanlardan izole edilen adacık hücreleri ile 228 kuyu plaka. - hücre yapışmasını sağlamak için 48 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde plaka koyun.
6. Adacık hücre Kültür Tedavi Tespit ve Boyama
- Adacık fonksiyonu ortamında 2x konsantrasyonda (muamele koşulları dört kez yapılır) araç ve bileşik 200 ul hazırlayın. Çok-çukurlu pipetleme kolaylaştırmak için bir steril 96 oyuklu plaka içinde bileşikleri düzenlemek.
- Dikkatli bir şekilde 12 oyuklu manifoldu aspiratör adacık orta kaldırmak ve 12 oyuklu bir pipet kullanarak doku adacığı fonksiyonu ortamında (35 ul / oyuk) ile değiştirin. Çıkarın ve (Şekil 1C) kuruma riskini sınırlamak için bir defada bir satır ortamı değiştirin.
- 35 ul / transfer kuyunun 2x bileşik çözeltileri ile muamele başlatın. 48 saat tedavi süresi için inkübatör plaka dönün.
- Tedavinin 48 saat sonra, plakayı baş aşağı çevirerek işleme ortamı süzün. </ Li>
- Yavaşça 1 x PBS (1 dakika) oyuk başına 50 ul adacık hücrelerinin yıkayın. Çok kanallı bir pipet kullanılarak PBS ekleyin.
- PBS süzün ve 1 x PBS içinde seyreltilmiş, soğuk% 4 paraformaldehit (PFA), oyuk başına 50 ul ilave edilerek hücrelerin tespit. 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
- PFA çıkması için plakayı baş aşağı çevrilerek ve yavaşça yukarıdaki gibi göz başına PBS 60 ul ekleyerek hücreleri üç kez (her biri 5 dakika) yıkanır.
- formamid 14.25 ml ve 0.75 mL, 0.15 M sodyum sitrat (pH 6) karıştırılarak 15 mi antijen alma çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce hemen antijen alma çözüm olun.
- plakayı baş aşağı çevirerek oyuklardan çıkarın PBS ve her bir oyuğa 60 ul, antijen alma çözeltisi ilave edilir. 45 dakika süre ile 70 ° C su banyosu içinde plaka ısıtılır. Çok-çukurlu plaka kırışmayı önlemek için Bu kuluçka sırasında plaka üzerine bir ısıtıcı blok yerleştirin.
Not: Su yarım yukarı plaka etek olmalıdır; Plaka batık edilmemelidir. - 1x PBS üç kez oyuk başına 60 ul (her biri 5 dakika) ile hücrelerin yıkayın. Çok kanallı bir pipet ile PBS ilave edin ve plakayı baş aşağı çevirerek PBS süzün.
- Bloke edici tamponun oyuk başına 40 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek çok kanallı bir pipet kullanın. plakayı baş aşağı ve aktarma yoluyla Bloklama tamponunu çıkarın.
- ve keçi anti-insan PDX-1 (1: 100): Fare Ki-67 (200 1) anti-insan 40 ul ekle her oyuğa blokaj tamponunda seyreltilmiş antikor ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bir sonraki gün, yukarıda tarif edildiği gibi üç kez (her biri 5 dakika), anti-vücut çözeltisi süzün ve 1 x PBS ile yıkama hücreleri. PBS Durusu.
- bloke edici tampon içinde (200 1) biyotinile edilmiş eşek anti-fare IgG ve rodamin-konjüge edilmiş eşek anti-keçi IgG seyreltilmiş oyuk başına 40 ul ekle. 1 saat süre ile inkübeoda sıcaklığında.
- 1x PBS ile üç kez, her biri 5 dakika hücreleri yıkayın. Her kuyucuğa Flüoresanla Birleşik streptavidin (bloke edici tampon içinde 400 1) ile seyreltildi ve 40 ul ekle. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkalayın.
- 1x PBS ile üç kez, her biri 5 dakika hücreleri yıkayın. DAPI oyuk (bloklama tamponu içinde 300 nM) başına 40 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
- 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve PBS 1x 40 ul hücreleri bırakın. Plaka hemen analiz için hazırdır.
7. β-hücre çoğaltma Analizi
Not: Bir deney protokolü β-hücre çoğaltma ölçmek için kullanılan yüksek içerik tarama mikroskop için oluşturulmalıdır. En basit bileşim, bu protokol, bir kimlik markör β-hücrelerinin tanımlamak için kullanılan bir iki-renkli deneyidir (PDX-1 + p-hücreleri) ve bir çoğaltma işaret (Ki-67), hücre bölünmesi olayları tanımlamak için kullanılır.
- ORTALAMA dayanan nesne (β-hücreleri) belirlenmesiBir β-hücresi çekirdeğine (Şekil 2A) beklenen piksel alanı içinde: (genişlik <1.6 uzunluğu) yaklaşık daire içinde PDX-1 boyama (549 nm filtre) e flüoresans şiddeti.
- Sonraki, PDX-1 + alanda (Şekil 2B) içinde ortalama floresan yoğunluğu (485 nm filtresi) dayalı çoğaltma olayları (Ki-67-pozitifliği) tanımlamak için ayarları oluşturmak.
Not: Pozlama süreleri görüntüler arasında piksel yoğunluğu karşılaştırmalar izin sabitlenmelidir. Deney protokol parametreleri makine çağrıları sürekli olumsuz veri kalitesini etkileyecek spesifik olmayan boyama, enkaz ve hücre agrega hariç şekilde ayarlanır. - doğruluğu ve limit değişkenliği en üst düzeye çıkarmak için, göz başına 500 β-hücrelerinin en az analiz edin.
Not: Sıçan adacık kültürlerde bazal β-hücre replikasyonu indeksi 0.5 olması beklenmektedir -% 3. Tipik olarak, kuyu başına 40 resim 500 β-hücreleri tanımlamak için fazlasıyla yeterli. - analiz öncesindetüm plaka, seçilen negatif-(DMSO-tedavi) ve pozitif kontrol analiz (5-iyodotübersidindir [1 uM] veya dipiridamol [15 mM]) tahlil protokolü geçerliliğini değerlendirmek için kuyu ile tedavi edilen. Deney doğru kurulduğunda, pozitif kontrol bileşikleri, β-hücrelerinin replike yüzdesi en az iki kat artışa neden olur.
- tahlil protokolü doğrulandıktan sonra tüm plaka okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
β-hücre ya da α-hücresi çoğalmasını değerlendirmek için, dört renkli bir deney protokolü gereklidir. İlk olarak, nesnelerin DAPI lekelemesi (kanal 1, 386 nm) ile belirlenmiştir. Sonraki, β-hücreleri (olay 1) sayılır: nesneleri PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) ve peri-nükleer insülin (kanal 3, 549 nm) co-ifade eder. Daha sonra, kopyalayan β-hücreleri (olay 2) sayılır: (olay 1) co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (Şekil 3)-hücreleri ß. β-hücreleri çoğaltılıyor yüzdesi hesaplanır: (olay 2 / olay 1) α-hücre çoğaltma ölçmek için 100. x, toplam nesneler DAPI boyama ile tanımlanır (kanal 1) ve daha sonra α-hücreleri (olay 1) tarafından numaralandırılan PDX-1 boyanma olmaması (kanal 2) ve perinükleer glukagon boyanma varlığı (kanal 3). Kopyalayan α-hücreleri (olay 2) Ki-67 (kanal 4) (Şekil 4)-express birlikte α-hücrelerin sayısı vardır.kopyalayan α-hücrelerinin yüzdesi hesaplanır: (Olay 2 / olayı 1) x 100.
Denemeyi başlatmadan önce, bir bileşik tedavi planı (Tablo 1A) yapılır. Burada, küçük ölçekli deney negatif kontrol (DMSO-muamele edilmiş) ve pozitif kontrol kullanılarak yürütülmüştür (dipiridamol ile tedavi edilen [15 uM]) koşullar PDX-1, 384 oyuklu formatta β-hücre ve α-hücresi çoğalmasını (değerlendirmek kuyu başına 49 resim). Deneysel veriler seçici PDX-1 + cell ve β-hücre çoğaltma değil α-hücre çoğalmasını teşvik etmek dipiridamol göstermektedir. oyuk başına tespit PDX-1-hücrelerin ortalama sayısı dipiridamol ile tedavi edilen koşullar için DMSO ile tedavi edilen ve 6.439 ± 363 (p <0.01) için 5,541 ± 555 idi; PDX-1 hücre sayısı (Tablo 1B, üst) bir dipiridamol bağımlı bir artış göstererek. ortalama yüzde PDX-1 + cell çoğaltma (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) için 3.35 ± 0.50% ve dipiridamol-tedavi koşulları (p <0.01) (Tablo 1B, alt) için DMSO ile tedavi edilen ve 10.10 ± 0.98%. DMSO = 3.3 ± 0.66 (satırlar CF) ve 3.4 ± 0.23 (satır: önemlisi, sonradan β-hücre (satır CF) ve α-hücre çoğaltma (satır GJ) için analiz kuyulara benzer PDX-1 + cell çoğaltma oranları vardır GJ) (p = 0.80); dipiridamol = 9.8 ± 0.86 (satırlar CF) ve 10.4 ± 0.1.1 (satırlar GJ) (p = 0.43). Bu nedenle, farklı hücre soyundan belirteçleri (insülin ve glukagon) boyanmış, ancak, bu kuyu, ilaç tedavisine benzer biçimde karşılık verdi.
Β-hücreleri ve α-hücrelerinin replike sonraki ham veriler (Tablo 2) hesaplandı. Β-hücrelerinin (Olay 1) ortalama sayısı dipiridamol tedaviye yanıt olarak yükseltilmiştir: DMSO vs 3.930 ± 488. dipiridamol 4,589 ± 218 (p <0.05). Özellikle, PDX-1 hücreleri (5,541 ± 555) (p <0.01) ile karşılaştırıldığında β-hücrelerinin (3.930 ± 488) sayısında belirgin bir azalma vardır. Β-hücresi sayısı, örneğin, ö-hücreleri veya β-hücresi progenitör hücrelerin ve insülin + olduğu β-hücrelerinin gerektiren ek sıkılık arasında - Bu insülin PDX-1 +-hücreleri hariç bir sonucudur. Özellikle, α-hücre sayısı (Olay 1) (dipiridamol 1.467 ± 74.7 v DMSO 1,465 ± 123; p = 0.93) dipiridamol, tedaviden artmamıştır. Bu nedenle, dipiridamol seçici β-hücre sayısını artırır. Ancak α-hücreleri (olay 2) replike sayısı değil (DMSO; β-hücrelerinin (olay 2) replike sayısı (p <0.01 dipiridamol 476.5 ± 39.6 genel DMSO 131 ± 31) dipiridamol tedaviye yanıt olarak artar dipiridamol 9.0 ± 1.6 genel 10.25 ± 3, p = 0.5). kopyalayan β-ce nihayet yüzdesirf ve α-hücreleri hesaplanır ((olay 2 / olay 1) 100 x). Gerçekten de, dipiridamol β-hücrelerinin değil (Şekil 5'te özetlenmiştir) α-hücreleri çoğaltma oranını arttırır. (-% 3 0,5), ancak bir deney içinde kuyuların arasında son derece tutarlı olmalıdır önemlisi, sağlıklı bir kültürün bazal β-hücre çoğaltma oranı deneyler arasında değişir. Bazal çoğaltma değişken olduğundan, bileşik kaynaklı β-hücre çoğaltma oranı da deneyler arasında değişkendir; Bununla birlikte, β-hücresi çoğalmasının kat İndüksiyon deneyleri tutarlı olduğunu ve bileşiğin etkinliği güvenilir deneyde karşılaştırılmasına olanak tanır. Özellikle, α-hücre çoğaltma oranı β-hücre çoğaltma oranı daha ~ 5 kat daha düşüktür ve kültürler ~ 1/3 gibi birçok α-hücreleri β-hücreleri içeren; dolayısıyla, α-hücre çoğaltma endeksi görüntüler β-hücre çoğaltma endeksine göre değişkenlik arttı. değişkenliği sınırlandırmak için, kuyu başına görüntüleri81 maksimum (burada kullanılan) 49 arttırılır.
Şekil 1: İzole ve Dağınık Rat adacıklarım içerir. (A) Sağlıklı izole sıçan adacık bir mikrografı; 100 mikron ölçekli çubuğu gösterilir. 1 saat sonra kaplama dağılmış sıçan adacık (B) Mikrograflan (5X ve 10X hedefleri); 100 (solda) um ve 200 mikron (sağ) gösterilen barlar ölçek. Dağınık sıçan (C) Mikrograflan (5X ve 10X hedefleri) kaplama sonrası 48 saat adacıklar; 100 (solda) um ve 200 mikron (sağ) gösterilen barlar ölçek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: PDX-1 otomatik tanımlanması + + adacık hücresi. PDX-1 için boyanmış (A) bileşiği ile tedavi edilen dağılmış sıçan adacık hücresi. PDX-1 + nesneleri mavi circled; dışlanan nesneleri turuncu circled. 150 mikron ölçekli çubuğu gösterilir. (B) Ki-67 için boyanan adacık hücrelerinin aynı alan. PDX-1 + ki-67 + çift pozitif hücreler yeşil circled. Gösterilen 150 mikron ölçekli bar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Β-hücreleri çoğaltılıyor otomatikleştirilmiş Kimlik β-hücreleri çoğaltılıyor DAPI (sol üst köşesi, mavi daireler), PDX-1 (sağ-üst köşesinde, yeşil çevrelerinde), insülin ile tanımlanır (sol alt köşesi, eflatun daireler) ve Ki-67 (sağ-alt köşesinde, kırmızı daireler) eş-eXPression. Birleştirilen görüntü (sağda) birkaç kopyalayan β-hücreleri gösterir. Gösterilen 150 mikron ölçekli bar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Α-hücreleri çoğaltılıyor otomatikleştirilmiş Kimlik α-hücreleri çoğaltılıyor DAPI (sol üst köşesi, mavi daireler), PDX-1 yokluğunda (sağ-üst köşesinde, yeşil çevrelerinde), glukagon ile tanımlanır (sol alt köşesi, eflatun daireler) ve Ki-67 (sağ-alt köşesinde, kırmızı daire) eş-ifadesi. Birleştirilen görüntü (sağ) α-hücrelerinin nadir kopyalayan dublet (sarı ok) görülmektedir. Gösterilen 150 mikron ölçekli bar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. Dipyridamol İndükler PDX-1 + - β-hücre çoğaltma ancak PDX-1 hücre değil α-hücre çoğaltma grafiksel gösterimi (sol üst), β-hücre (sağ üstte) ve α-hücre ve (sol altta) DMSO ve dipiridamol işlenmiş oyuklarda çoğaltma gösterilmiştir. Çubuklar, bağımsız olarak işlenmiş olan gözeneklerden ortalamasını temsil etmektedir (PDX-1 replikasyonu, n = 8; β-hücresi ve α-hücre replikasyonu, n = 4). Hata çubukları standart sapmayı (* p <0.01) göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| A. | Tedavi: | Boyama: | |
| 4 | 5 | ||
| C | DMSO | dipiridamol | İnsülin, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| D | DMSO | dipiridamol | İnsülin, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| E | DMSO | dipiridamol | İnsülin, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| F | DMSO | dipiridamol | İnsülin, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| G | DMSO | dipiridamol | Glukagon, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| H | DMSO | dipiridamol | Glukagon, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| ben | DMSO | dipiridamol | Glukagon, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| J | DMSO | dipiridamol | Glukagon, DAPI, PDX-1, Ki-67 |
| B. | PDX-1 + hücrelerinin sayısı | ||
| DMSO | dipiridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 5158 | 6249 | |
| D | 6365 | 6795 | |
| E | 4830 | 6974 | |
| F | 5988 | 6408 | |
| G | 5574 | 6532 | |
| H | 5939 | 6411 | |
| ben | 5612 | 6387 | |
| J | 4862 | 5759 | |
| PDX-1 + Ki-67 + hücrelerinin yüzdesi | |||
| DMSO | dipiridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3.04 | 9.99 | |
| D | 3.91 | 10.57 | |
| E | 2.51 | 8.58 | |
| F | <td> 3.7710.14 | ||
| G | 3.44 | 10.1 | |
| H | 3.06 | 10.69 | |
| ben | 3.58 | 9.07 | |
| J | 3.52 | 11.74 | |
Tablo 1: Temsilci Deneysel Planı ve PDX-1 + -Hücre Çoğaltma Verileri. (A) tedavi planının ana hatları gösterilmektedir. Wells DMSO (sütun 4) ya da dipiridamol (sütun 5) ile muamele edildi. Boyama + DAPI, anti-PDX-1, anti-insülin (normal harfler) ya da anti-glukagon (italik yazı) ve KI-67 (B), PDX-1 + hücrelerinin toplam sayısını (üst, DAPI ile gerçekleştirildiPDX-1 kuyu başına oyuk ve PDX-1 hücreleri kopyalayan yüzdesi (alt, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x 100) başına +) gösterilmiştir.
| Olay 1: | |||
| DMSO | dipiridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3557 | 4352 | # DAPI (+) PDX-1 (+) İnsülin (+) |
| D | 4387 | 4542 | # DAPI (+) PDX-1 (+) İnsülin (+) |
| E | 3462 | 4879 | # DAPI (+) PDX-1 (+) İnsülin (+) |
| F | 4315 | 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) İnsülin (+) | |
| G | 1594 | 1567 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) |
| H | 1477 | 1439 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) |
| ben | 1491 | 1390 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) |
| J | 1298 | 1474 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) |
| Olay 2: | |||
| DMSO | dipiridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 113 | 425 | # DAPI (+) PDX-1 (+) İnsülin (+) Ki-67 (+) |
| D | 152 | 511 | # DAPI (+) PDX-1 (+) İnsülin (+) Ki-67 (+) |
| E | 97 | 466 | # DAPI (+) PDX-1 (+) İnsülin (+) Ki-67 (+) |
| F | 163 | 504 | # DAPI (+) PDX-1 (+) İnsülin (+) Ki-67 (+) |
| G | 13 | 9 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) Ki-67 (+) |
| H | 10 | 9 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) Ki-67 (+) |
| ben | 6 | 11 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) Ki-67 (+) |
| J | 12 </ Em> | 7 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) Ki-67 (+) |
| % Çoğaltma: | |||
| DMSO | dipiridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3.18 | 9.77 | |
| D | 3.47 | 11.25 | |
| E | 2.8 | 9.55 | |
| F | 3.78 | 10.99 | |
| G | 0.82 | 0.57 | |
| H | 0.68 | 0.63 | |
| ben | 0.4 | 0.79 | |
| J | 0.92 | 0.48 | |
Tablo 2: Örnek β-hücresi ve α-hücre çoğaltma veri β-hücrelerinin toplam sayısı (Olay 1: DAPI + PDX-1 + insülin +; üst tabloda satırları CF normal yazı).), Α-hücreleri (olay 1 : DAPI + PDX-1 + glukagon +; üst tablo satırları GH, italik yazı), β-hücrelerinin (Olay 2 kopyalayan: DAPI + PDX-1 + insülin + Ki-67 +; orta tablo satırları CF normal yazı) ve α p-hücreleri (Olay 2: DAPI + PDX-1 + glukagon + Ki-67 +; orta tablo satırları GH, italik yazı)kuyu başına gösterilir. Ayrıca, β-hücrelerinin (DAPI + PDX-1 + insülin + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insülin + x 100; alt tablo satırları CF normal yazı) kopyalayan yüzdesi ve α-hücreleri (DAPI + PDX -1 + glukagon + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x 100 glukagon; oyuk başına alt tablo satırları GJ, italik yazı) gösterilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
β-hücre büyümesini ve yenilenmesini kontrol moleküler yollarını inceleyerek için deneysel yöntemler diyabet araştırmacılar için önemli araçlardır. Burada, bir fare-adacık bazlı tarama platformu sunulmuştur β-hücresi çoğalmasının küçük moleküllü uyarıcıları belirlemek ve karakterize etmek.
Bu protokolün en yönlerini kolaylıkla deneyimli araştırmacılar tarafından yerine getirirken, bir kaç adım belirli teknik gerektirir. İlk olarak, adacık izolasyonu sırasında, kendi bütünlüğünü bozmadan safra kanalının kanülasyon pratik gerektirir. A yararlı bir strateji minimal tam pankreas sindirim çözümü dağıtma önce iğnenin doğru konumlandırma sağlamak için safra kanalı şişirmek etmektir. İkincisi, ekzokrin doku verimli adacık izolasyon sindirim süresi ve uygun ajitasyon yakın ilgi gerektiriyor. Bakım aralıklı dönen yoluyla sindirmek boyunca bile ısıtma sağlamak için önlemler alınmalıdır. Üçüncü olarak, deney başarılı bağlıdıradacıklar ve manuel adacık toplama sırasında ekzokrin enkaz arasında yeterli ayrım üzerine s; Bu beceri uygulama ile geliştirir. Dördüncü olarak, doku adacığı dispersiyonu ile kaplama, tüm adacıklar tek hücreler ve iki ya da üç küçük hücre kümeleri içeren bir karışım içerisine dağılmış şekilde yapılır. Aşırı ve yetersiz sindirim adacıklar önce deneysel performansı ile müdahale kaplama için. Taze kaplama adacık hücreleri. Yayma ve rahatsız edilmeden 48 saat boyunca bağlanmaya bırakılmıştır önce yaklaşık% 50 konfluent 1 kaplama sonra çeşitli zamanlarda başarılı bir adacık hücresi kültürlerinin görünümünü göstermektedir gerekir. Beşinci olarak, adacık hücre kültürleri için ortam değişiklikleri zayıf yapışık hücrelerin bozulmasını önlemek için dikkatli yapılır. Altıncı olarak, antijen alma, çok oyuklu plakanın deforme olmaması dikkatli yapılmalıdır fakat yeterince düşük ve hem de hassas olan başarılı bir Ki-67 renklendirme için ısı yükselmesine maruz kalma üzerine, bükülmüş plakalar kullanılamazotomatik görüntü elde etme. Not aşırı pankreas sindirim, ekzokrin doku artıkları ve / veya trypsinization maruz kalma adacık hücre kültürü başarısızlık için ortak bir nedenidir.
Bu protokolün bir sınırlama β-hücre kimliği ve çoğaltma olaylar için özel anlatım belirteçleri üzerine güven olduğunu. Tek belirteçlerin kullanılması yanıltıcı olma potansiyeline sahiptir. Örneğin, PDX-1 β-hücrelerinin, somatostatin salgılayan δ hücreleri ve β-hücre progenitörlerinin 29,30 bir alt kümesi ile ifade edilir; Bu nedenle, PDX-1-hücre çoğalmasını arttırmak bileşikler, özel olmayan bir β-hücre popülasyonu üzerinde etkili olabilir. Sonuç olarak, alternatif β-hücre belirteçleri kullanabilirsiniz doğrulayıcı çalışmalara ihtiyaç vardır. Benzer şekilde, Ki-67 ekspresyonu çoğaltma ve BrdU gibi fosfo-histon 3 31 kullanılmalıdır örneğin daha fazla göstergeleri için mükemmel bir belirteci değildir. Bu deneyde bir ikinci sınırlama β-hücresi çoğalmasını indükleyen bileşikler simultane olmasıdırsöndükten β-hücresi apoptozunu veya de-farklılaşma artmaktadır. Nedenle, bir bileşiğin β-hücresi sayısındaki mutlak artışı teşvik edip etmediğinin değerlendirilmesi için önemlidir ve / veya β-hücresi apoptosisi teşvik ve bileşik ile tedavi edilen β-hücrelerinin, normal fonksiyonunu (glukoz ile uyarılmış insülin salgılanması) 32 muhafaza olup. Bu testte üçüncü bir kısıtlama primer adacık hücrelerinin kullanımı ile ortaya çıkan mütevazı çıkışı olduğu; Altı sıçanlardan alınan adacıklar ~ 55 bileşikler dörtlü (artı pozitif ve negatif kontroller) gösterime sağlar 228 deneysel kuyuları oluşturur. tarif edilen β-hücre replikasyonu tarama platformu üzerinde ek bir sınırlama Sıçan Adacıklarından yerine insan adacık kullanılmasıdır. insan ve sıçan adacıkları arasındaki farklar tüm çoğaltma teşvik bileşikler sıçan adacık kültürleri, insan adacık kültürleri kullanılarak teyit kullanılarak tespit gerektirir için yeterlidir. Ancak, insan i ile sınırlı kullanılabilirlik ve insan adacıklar yüksek maliyeti, birincil tarama verilenslets çoğu araştırmacı için pratik değildir.
Bu protokolün başlıca avantajları şunlardır: 1) yeni izole edilen primer adacıklar kullanımı mümkün olduğu kadar normal büyüme kısıtlamaları korumak için, 2), 384-gözlü formata kullanımı, orta veri akışı taramasını sağlamak için (tipik olarak altı sıçan izole adacıklar ) 228 kuyular için yeterli ve 3) otomatik görüntü toplama ve analiz kullanımı deney hızlandırma ve önyargı sınırlamak için. Buna karşılık, yaygın olarak kullanılan alternatif yaklaşımlar manuel görüntü elde etme ve β-hücre çoğaltma 15,17 karşı hücre linages, örnek fibroblast arasında ayrım yapmaz β-hücre çoğaltma olayları veya radyoaktif timidin tüm adacık eklenmesi öznel değerlendirmesine dayanır. Bu nedenle, sunulan protokol β-hücrelerinin büyümesi düzenlenmesinin araştırılması için önemli ve geliştirilmiş bir aleti gösterir.
Biz uyarlanmış çeşitli öngörülüyorBu tarama platformu için kullanır. Veya insülin + p-hücreleri - İlk olarak, β-hücresi sayısında bir mutlak artış PDX-1 + sayısının sayılmasıyla ölçülebilir. durum başına replika de daha yüksek bir sayısı başına plakalanan hücre sayısı arasındaki farklılıkları hesaba dahil edilebilir (tipik olarak n = 8). İkinci olarak, bir platform lentivirüs-bazlı aşırı ekspresyonu için adapte edilebilir veya knock-out / aşağı deneyler β-hücresi çoğalmasında yer yolları tespit etmek. Özet olarak, tarif edilen tekniktir bileşikleri ve β-hücresi çoğalmasını düzenleyen moleküler yollar belirlenmesi için genel olarak yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 ml | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 ml | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
- Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
- Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
- Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
- Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
- Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
- Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
- Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
- Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
- Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
- Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
- Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
- Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
- Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
- Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
- Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
- Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
- Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
- Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).
- Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
- Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
- Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
- Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).
