Summary
Kritiska utmaningar för diabetesforskningen fältet är att förstå de molekylära mekanismer som reglerar ö β-cellreplikation och för att utveckla metoder för att stimulera β-cellförnyelsen. Häri en hög halt screening metod för att identifiera och bedöma β-cellreplikation främjande aktivitet av små molekyler presenteras.
Introduction
Diabetes omfattar en samling av sjukdomar som delar den gemensamma slutpunkten av sönder glukoshomeostas. Även de patogena mekanismerna för diabetes subtyper är olika, de delar en följd av minskad β-cellmassan, det vill säga förlust av insulinproduktionen kapacitet 1,2. För närvarande diabetes behandlingsstrategier lita på kronisk administrering av exogent insulin, farmakologisk stimulering av produktion eller förstärkning av insulininsulinkänslighet, och sällan, transplantation av pankreasöar eller hela bukspottkörteln 3,4. Tyvärr, är framgången för dessa strategier kortlivad och / eller underlåter att tillräckligt rekapitulera funktionen av insulinproduktion. Trots användbarheten av att utveckla en metod för att stimulera β-cellförnyelsen, existerar inget sådant tillvägagångssätt. Följaktligen är en stor diabetesforskningen mål att utveckla metoder för att generera nya p-celler eller att expandera endogen β-cellmassan 5 6,7. Viktigt är den dominerande källan till nya p-celler in vivo redan existerande p-celler snarare än specialiserade progenitorceller 8,9. Även p-celler verkar ha begränsad replikering kapacitet, en liten ökning av β-cellmassan (~ 30%) kan vara tillräcklig för att återställa glukoshomeostas i många diabetiker. Vidare in situ farmakologisk stimulering av β-cellmassan är en potentiellt billig och skalbar behandlingsstrategi. Häri en hög halt screening metod för att identifiera och karakterisera små molekyler som stimulerar β-celltillväxt presenteras.
Ett flertal in vitro experimentella metoder kan användas för att identifiera genprodukter och / eller molekyler that främja primär β-cellreplikation. Tidiga insatser för att mäta β-cellreplikation induktion används foster gnagare pancreata kultur eller intakta isolerade ö kulturer för att mäta [3 H] tymidininkorporering, BrdU inkorporering eller mitotiska kroppar i aldehyd-tionin eller insulin färgade befolkningen i svar på specifika behandlingsförhållanden 10, 11. Dessa in vitro metoder och nära varianter därav har flera begränsningar. Framstående brister inkluderar (1) användningen av fosterceller som till skillnad från mogna p-celler, visar en hög basal β-cellreplikation hastighet och är tillväxt regleras på ett tydligt sätt 12; (2) den subjektiva karaktär försöksberoende prövning av β-cellreplikeringshändelser; (3) arbets- och tidskrävande karaktär försöksberoende räkning av β-cellreplikeringshändelser fördröjer experimentell genomströmning; (4) användning av kärn inkorporering / bets / utseende för att identifiera replikering ävents och en icke-överlappande cytoplasmatisk fläck för att identifiera p-celler leder till felattribueringen av närbelägna icke-β-cellreplikeringshändelser till p-celler.
På senare tid mogna primära p-celler har använts för att bedöma effekten av transgen överuttryck samt genprodukt eller förening behandling på β-cellreplikation 13-16. Emellertid har dessa studier också åberopas subjektivt räkning av replikeringshändelser, cytoplasmiskt staining- eller icke-specifika metoder för identifiering β-cell och / eller arbetsintensiva steg som begränsar genomströmningen, t.ex. individuell glid väl plätering av celler eller intakta ö paraffininbäddning och bearbetning 17. Notably, en bildbaserad human β-cellreplikation screening metodologi, som liknar den som presenteras häri, har publicerat 18; har dock framgångsrik användning av denna analys inte påvisats och användningen av humana öar för primär screening kan inte vara i stort sett FEAligt.
En alternativ strategi för att identifiera replikationsbefrämjande substanser är att bedöma tillväxt induktion av β-cellinjer. Initiala ansträngningar används transformerade p-cellinjer såsom MIN6 celler eller INS 832/13-celler 14,19-21. Dessa cellinjer visar ohämmad tillväxt och bär föga likhet med väl differentierade p-celler 22. Följaktligen är tillväxtinduktionskapacitet minimal, av oklar relevans och ibland svårt att sammanfatta. En förbättrad strategi för cellinje baserad screening utnyttjar "reversibelt omvandlas" celler som tillväxt greps i frånvaro av tetracyklin (doxycyklin) -beroende SV40 T-antigen uttryck 23,24. Det är dock oklart om dessa celler återgår till en "normal" β-cell-liknande tillstånd vid doxycyklin bort. Tyvärr har användningen av dessa celler gav generaliserade tillväxtbefrämjande föreningar som inte verkar ha omedelbar nytta24. Sammanfattningsvis kan användningen av cellinjer för att studera tillväxtreglering av en celltyp som visar minimal spontan replikering aktivitet har begränsad användbarhet.
Den β-cellreplikation screening plattform presenteras här utnyttjar mogna primära rått p-celler att behålla in vivo tillväxtreglering i möjligaste mån, ö-cellkulturer av blandad celltyp komposition för att möjliggöra identifiering av linjebegränsade tillväxtbefrämjande aktiviteter, multi -Ja formatering för att maximera genomströmningen och automatiserad analys för att eliminera fördomar och underlätta genomströmningen. Framgångsrik användning av denna plattform har möjliggjort identifiering av flera föreningar som främjar β-cellreplikation 25,26. Dessutom har analysen använts för struktur-aktivitetssamband studier och kemiska epistasis experiment för att tillhandahålla mekanistiska insikter i den molekylära regleringen av β-cellreplikation. De presenterade plattformen framgångsrikt anpassat for Lentiviral RNAi-baserad undersökning av β-cellreplikation vägar 25. Begränsningar av analysen inkluderar begränsad skalbarhet (användning av primärceller), användning av gnagare snarare än mänskliga ö-celler (även om analysen kan anpassas för mänskliga ö studier), kostnader i samband med antikroppsbaserad avbildning och primär ö, användning av spridda öar (störs holme arkitektur) för att underlätta automatiserad bildtagning och beroende av tillgången på ett automatiserat mikroskop med bildtagning och analyskapacitet. Även om en enkel in vivo screening metod för att identifiera genprodukter eller föreningar som stimulerar β-cellförnyelsen in situ skulle vara perfekt, är en sådan plattform ännu inte tillgängliga 27. Följaktligen är lämpligt för forskare intresserade av att undersöka de flesta aspekterna av β-cellreplikation den beskrivna plattformen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll genomfördes i enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Stanford University School of Medicine. Den beskrivna protokollet skalas för ö-isolering från sex 250-300 g (8 - 9 veckor gamla) Sprague Dawley-hanråttor, som är tillräcklig för att alstra 228 brunnar i en 384-brunnsplatta för ö-cellreplikation bedömning.
1. Material Beredning
- Förbereda beläggningsmedier före initiering holmen isolering genom uppsamling av konditionerade media av 804G råttblåscancerceller som hölls vid sammanflytning under 3 dagar (20 ml RPMI1640) i en 15 cm vävnadsodlingsskål 28. Sterilt filter och lagra (-20 ° C) det konditionerade mediet för senare användning.
- Sterilisera kirurgiska instrument (en 12 cm tandade vävnads pincett, en 11,5 cm fina saxar, en 14,5 cm kirurgisk sax, två 16 cm böjda pincett, en 12 cm böjda hemostat, en 12 cm skalpell handtag) och en 30 mesh vävnadssikt före initiating holmen isolering.
- Förbereda pankreatisk digestion lösning genom upplösning av en 60%: 40% blandning av renat klass I: klass II kollagenaser (total koUagenasaktivitet på 300.000 - 400.000 enheter) i 60 ml 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med tillsats av kalcium och magnesium. Belastning 10 ml pankreas uppslutning buffert i 10 ml sprutor (sex) med en "22 G nål och placera på is.
Notera: 10 ml av uppslutningslösningen injiceras per råtta. Skala i enlighet därmed. - Förbereda 4,5 ml bedövningsmedel cocktail i en ventilerad huv genom att blanda 1,3 ml ketamin (100 mg / ml), 0,2 ml xylazin (100 mg / ml) och 3 ml PBS. Förbered bedövningsmedel cocktail inom en timme att initiera holme isolering.
- Förbered tvättbuffert genom tillsats av 25 ml av serum från nyfödd kalv till 500 ml HBSS. Placera tvättbuffert på is för senare användning.
- Förbereda en flaska av ö-medium, som är 500 ml låg glukos Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 50 ml fetalt bovint serum (FBS), 5000 enheter / ml av penicillin och 5000 | ig / ml streptomycin.
- Förbereda islet funktion medium från funktionalitet / viabilitet lösning (500 ml) med 2% FBS, 2 mM glutamin, 5 mM glukos, 5,000 enheter / ml penicillin och 5000 | ig / ml streptomycin. Förvara holmen funktionen media (4 ° C) för senare användning.
- Förbered 40 ml blockerande buffert genom att tillsätta 2,5 ml åsna serum och 0,12 ml Triton X-100 till 37,38 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Store blockeringsbuffert (4 ° C) för senare användning.
- Erhålla de nödvändiga antikropparna före start av protokollet.
Obs: PDX-1 (TRITC) och Ki-67 (FITC) co-färgning används för primär β-cellreplikation screening. För härstamning specifika replikering analys, utföra immunofluorescens färgning för ytterligare cellidentitetsmarkörer (insulin, glukagon, vimentin eller somatostatin, TRITC) tillsammans med nukleära (DAPI), PDX (Cy5) och Ki-67 (FITC) färgning. alternativa teknikerlication markörer, t.ex., PCNA, kan också användas. - Förbered en 228 brunnar behandlingsplan med varje behandlingsbetingelse utfördes i fyra exemplar. Inkludera positive (5-Iodotubercidin [1 iM] eller dipyridamol [15 iM]) och fordonskontrollsystem (DMSO 1: 666 utspädning) brunnar.
2. Perfusion i bukspottkörteln
- Söva råttor genom ip-injektion av utspädd bedövningsmedel cocktail lösning (0,30 ml / 100 g kroppsvikt). När råttan är helt bedövad och svarar på skadliga stimuli, utföra halsdislokation.
- Placera avlivas råttan i ryggläge (kranial-caudal orientering) på en bunt papper handduk och spraya buken med 70% etanol.
- Öppna bukhålan med en U-snitt (bas vid blygd region) och dra huden i rostralt riktning över bröstet för att exponera bukhålan.
- ta försiktigt tolvfingertarmen med hjälp av två par böjda pincett, lokalisera duodenal inträde av den gemensamma bile kanal (sfinkter av Oddi) och klämma duodenal öppning papilla med en böjd hemostat.
- Lyft den böjda hemostat användes för att klämma den gemensamma gallgången papilla och ta gallgången nära levern med hjälp av en böjd pincett. Använd trubbig dissektion med böjda pincett för att isolera och exponera gallgången.
- Flytta råttan med huvudet proximala och fötter distalt.
- Cannulate gallgången (CBD) vid eller strax distalt korsningen av cystisk och gemensamma levertrummor med en pankreas uppslutning lösning -loaded 10 ml spruta och injicera långsamt 10 ml av pankreas matsmältningen lösning. Medan du injicerar, stödja CBD med en skalpell handtag. Flytta nålen om kanalen och bukspottkörteln inte blåsa.
- Ta bort de uppblåsta bukspottkörteln med hjälp av böjda pincett och fina sax för att skilja den från den nedåtgående kolon, tarmar, magsäck och mjälte. Placera uppblåsta bukspottkörteln på is i en 50 ml rör innehållande 5 ml
3. Dissociation i bukspottkörteln
- När alla pankreata uppsamlas, placera matsmältningen rören i ett 37 ° C vattenbad i 15 min. Snurra försiktigt rören var 3 min.
- Efter 15 minuter, Skaka (vertikalt) rören 10 gånger och tillsätt 10 ml kall tvättbuffert. Skaka rören ytterligare 5 gånger och placera på is.
- Fylla uppslutningsrören till 50 ml med kall tvättbuffert och blanda genom att vända rören 5 gånger.
- Centrifugera rören vid 97 xg vid 4 ° C under 1 min och häll bort supernatanten. Var noga med att inte rubba pellet vävnaden.
- Tillsätt 25 ml tvättbuffert och återsuspendera vävnaden genom att försiktigt vortexa. Upprepa steg 3,4 och 3,5 gånger mer.
- Placera en 30 mesh vävnads sikt över en sterile 250 ml bägare och häll vävnadssuspension på sikten. Skölj digere rör med ytterligare 20 ml tvättbuffert och häll ut på nätet. Osmält pankreas och fettvävnad tas bort i detta steg.
- Häll det filtrerade materialet i två färska 50 ml rör och pelletera vävnaden genom centrifugering vid 97 xg under 1 min vid 4 ° C. Dekan supernatanten och invertera rören rinna överflödig buffert.
4. Rening av cellöar
- Tillsätt 20 ml kall polysackaros / natrium diatrizoat lösning (1,119 g / ml densitet) till pelletpankreasvävnad. Homogent återsuspendera innehållet i varje rör genom att försiktigt pipettera upp och ned fem gånger.
- overlay försiktigt polysackaros / natrium diatrizoat lösning med 10 ml HBSS. Upprätthålla en skarp vätskegränsyta genom att långsamt tillsätta HBSS längs rörväggen.
- Centrifugera den digere pancreata vid 560 xg under 15 min (4 ° C) med långsam acceleration och ingen broms.
- collect holmen skiktet från gränssnittet med hjälp av en 10 ml pipett och placera öar i färska 50 ml rör. Inte pool öar i detta skede.
- Tillsätt 40 ml tvättbuffert till varje 50 ml rör och centrifugera under 1 min vid 140 xg vid 4 ° C.
- Häll av supernatanten och återsuspendera poolade cellöar i 50 ml tvättbuffert genom att vända rören flera gånger. Centrifugera rören under 1 min vid 97 xg vid 4 ° C för uppsamling av cellöar i en pellet.
- Häll av tvättbuffert och upprepa tvätten. Föra cellöar in i vävnadsodling huva och aspirera supernatanten.
- Återsuspendera varje rör av cellöar i 6 ml holmen medium.
- Överföra cellöarna från varje 50 ml rör i en brunn i sex-brunnars vävnadsodlingsplatta. Snurra 6-brunnsskål för att samla cellöar in i mitten av brunnen och observera holmen kvalitet och renhet under ett mikroskop.
- samla manuellt holmar med hjälp av en 1 ml pipett och överföra plockade öarna i den intilliggandebrunn innehållande 6 ml av ö-medier. Upprepa holme virvlande och plocka fram> 90% renhet uppnås.
- Överför renade holmar till en 10 cm vävnadsodlingsskål innehållande 20 ml holme medium.
- Place cellöar i en vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2) över natten (Figur 1A).
- I framställningen av utstrykning öceller, täcka brunnarna i en 384-brunnsplatta med 40 | il av 804G konditionerade media per brunn. Inkubera över natten i en vävnadsodlingsinkubator.
5. Dispersion och plätering av ö-celler
- Följande dag, försiktigt loss cellöar från den 10 cm skålen med en cellskrapa och överföra cellöarna i ett 50 ml rör.
- Pelletera cellöarna genom centrifugering under 1 min vid 22 xg vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten.
- Tvätta holmar med 20 ml varm PBS och dekantera enligt ovan.
- Återsuspendera öar i 0,25% trypsin (150 pl per råtta bukspottkörteln) Och inkubera vid 37 ° C under 10 min. Pipett cellöar upp och ner 10 gånger med användning av 1 ml pipett efter 5 och 10 min av inkubation.
- Efter 10 minuter, utvärdera ett urval av de trypsiniserade öarna under mikroskop 20 ^ för att säkerställa fullständig digestion och att räkna cellöar med hjälp av en hemocytometer. Om osmält cellöar kvar, fortsätter inkuberingen under ytterligare 3-5 min och pipettera upp och ner 10 gånger. Upprepa vid behov.
Obs! Typiskt utbyte är ~ 125.000 - 150.000 ö-celler per råtta. - Ta 804G konditionerat medium belagda 384-brunnar från inkubatorn och ta bort media med en 12-väl grenrör aspirator.
- Suspendera öceller vid en densitet av 45.000 celler per ml i Islet funktion mediet och plattan 70 pl (3.150 celler) per brunn med en multikanalpipett (Figur 1B).
Obs: Eftersom P-celler placerade i de yttre brunnarna tenderar att migrera i riktning mot omkretsen av plattan använda rader C-N och kolumnerna 4till 21 till plattan 228 brunnar med ö-celler som isolerats från 6 råttor. - Placera plattan i vävnadsodlingsinkubator under 48 timmar för att tillåta cellvidhäftning.
6. Islet-cellodling behandling, fixering och infärgning
- Förbered 200 l fordons och föreningar (behandlingsförhållanden utförs fyrfaldigt) vid en 2x koncentration i Islet funktion medium. Ordna föreningar i en steril 96-brunnars platta för att underlätta flerbrunns pipettering.
- Försiktigt bort holme medium med en 12-väl grenrör sug och ersätta med holme funktion medium (35 | il / brunn) med hjälp av en 12-brunn pipett. Ta bort och ersätta media från en rad i taget för att begränsa risken för torkning (Figur 1C).
- Påbörja behandling genom att överföra 35 | j, l / brunn av de 2x föreningslösningar. Återgå plattan till inkubatorn för 48 h behandlingstid.
- Efter 48 timmar av behandling, dekantera behandlingsmedia genom att vända plattan. </ Li>
- tvätta försiktigt cellöar med 50 fil per brunn av 1 x PBS (1 min). Tillsätt PBS med användning av en multikanalpipett.
- Dekantera PBS och fixera cellerna genom tillsats av 50 pl per brunn av kall 4% paraformaldehyd (PFA) utspätt i 1x PBS. Inkubera cellerna under 15 min vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna tre gånger (5 min vardera) genom att vända på plattan för att ta bort PFA och försiktigt tillsätta 60 | il av PBS per brunn som ovan.
- Förbered 15 ml antigenåtervinning lösning genom blandning av 14,25 ml formamid och 0,75 ml 0,15 M natriumcitrat (pH 6). Gör antigenhämtning lösning omedelbart före användning.
- Ta bort PBS från brunnar genom att vända plattan och tillsätt 60 pl antigenåtervinning lösning till varje brunn. Värm plattan i 70 ° C vattenbad i 45 min. Placera ett värmeblock på toppen av plattan under denna inkubation för att förhindra skevning av platta med flera brunnar.
Obs: Vattnet bör vara halvvägs upp plattan kjol; plattan bör inte vara nedsänkt. - Tvätta cellerna med 60 | j, l per brunn av 1 x PBS tre gånger (5 min vardera). Lägga till PBS med en flerkanalig pipett och dekan PBS genom att vända plattan.
- Använd en multikanalpipett för att lägga till 40 fil per brunn av blockeringsbuffert och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur. Ta bort blockerande buffert genom att vända plattan och dekantering.
- Tillsätt 40 | il mus-anti-human-Ki-67 (1: 200) och get-anti-human-PDX-1 (1: 100) antikroppar utspädda i blockeringsbuffert till varje brunn och inkubera vid 4 ° C över natten.
- Nästa dag, dekantera antikroppen lösningen och tvätta cellerna med 1 x PBS tre gånger (5 min vardera) såsom beskrivits ovan. Häll PBS.
- Tillsätt 40 | il per brunn av utspätt (1: 200) biotinylerat åsne-anti-mus-IgG och Rhodamine-konjugerad åsne-anti-get-IgG i blockeringsbuffert. Inkubera under 1 hvid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med 1 x PBS tre gånger, 5 min vardera. Tillsätt 40 pl av utspätt (1: 400 i blockeringsbuffert) fluorescein-konjugerat streptavidin till varje brunn. Inkubera 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med 1 x PBS tre gånger, 5 min vardera. Tillsätt 40 | il per brunn av DAPI (300 nM i blockerande buffert) och inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med 1 x PBS två gånger och lämnar celler i 40 ^ il 1 x PBS. Plattan är nu klar för att analyseras.
7. β-cellreplikation Analys
Obs: Ett analysprotokollet måste upprättas för hög halt screening mikroskop används för att mäta β-cellreplikation. I sin enklaste sammansättning, är detta protokoll ett två-färgsanalys där en identitetsmarkör används för att definiera P-celler (PDX-1 + -celler) och ett replikationsmarkör (Ki-67) användes för att definiera celldelnings händelser.
- Identifiera föremål (P-celler) baserat på den average fluorescensintensiteten hos PDX-1-färgning (549 nm filter) inom en approximativ cirkel (längd: bredd <1,6) inom det förväntade pixelområde av en β-cellkärna (Figur 2A).
- Därefter etablera inställningar för att identifiera replikeringshändelser (Ki-67-positivitet) baserat på den genomsnittliga fluorescensintensiteten (485 nm filter) inom PDX-1 + området (Figur 2B).
Obs: Exponeringstiderna måste fastställas för att möjliggöra pixelintensitets jämförelser mellan bilderna. Analysprotokollparametrar justeras så att maskin samtal konsekvent utesluta ospecifik färgning, skräp och cellaggregat som skulle kunna påverka kvaliteten på uppgifterna. - Analysera minst 500 p-celler per brunn för att maximera noggrannheten och begränsa variabilitet.
Obs: Den basala β-cellreplikation index i råtta ö kulturer förväntas vara 0,5-3%. Typiskt, 40 bilder per brunn är mer än tillräckligt för att identifiera 500 p-celler. - Innan analyserahela plattan, analysera vald med negativ (DMSO-behandlade) och positiv kontroll (5-iodotubercidin [1 iM] eller dipyridamol [15 iM]) -behandlade brunnar för att bedöma giltigheten av analysprotokollet. När analysen korrekt etablerat, positiva kontrollföreningar inducerar åtminstone en två-faldig ökning av den procentuella andelen av replikerande p-celler.
- Läs hela plattan när analysprotokollet valideras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att bedöma β-cell eller α-cellreplikation, är en fyra-färganalysprotokoll erfordras. Först objekt identifieras med DAPI färgning (Kanal 1, 386 nm). Därefter p-celler (händelse 1) räknade: objekt som samuttrycker PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) och peri-nukleär insulin (kanal 3, 549 nm). Därefter replikerande p-celler (händelse 2) räknas: p-celler (händelse 1) som co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (Figur 3). Den procentuella andelen av replikerande p-celler beräknas: (händelse 2 / händelse en) x 100. För att kvantifiera α-cellreplikation, är den totala föremål identifieras med DAPI-färgning (kanal 1) och därefter a-celler (händelse 1) är uppräknade genom frånvaro av PDX-1-färgning (kanal 2) och närvaron av perinukleära glukagon färgning (kanal 3). Replikerande a-celler (händelse 2) är antalet a-celler som samuttrycker Ki-67 (kanal 4) (Figur 4).Procentandelen repliker a-celler beräknas: (händelse 2 / händelse 1) x 100.
Före initiering av försöket, är en förening behandlingsplan görs (tabell 1A). Här var en liten skala analys köras med negativ kontroll (DMSO-behandlade) och positiv kontroll (dipyridamol behandlade [15 pm]) villkor för att bedöma PDX-1, β-cell och α-cell-replikation i en 384-brunnsformat ( 49 bilder per brunn). Experimentella data visar dipyridamol att selektivt främja PDX-1 + -cell och β-cell replikering men inte α-cellreplikation. Det genomsnittliga antalet identifierade PDX-1-celler per brunn var 5541 ± 555 för DMSO-behandlade och 6439 ± 363 för dipyridamol behandlade betingelser (p <0,01); vilket visar en dipyridamol-beroende ökning av PDX-1 cellantal (Tabell 1B, överst). Den genomsnittliga procent PDX-1 + -cell replikation (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) är 3,35 ± 0,50% för DMSO-behandlade och 10,10 ± 0,98% för dipyridamol behandlade betingelser (p <0,01) (Tabell 1B, nederst). Viktigt, det finns liknande PDX-1 + -cell replikeringshastigheter i brunnar analyserades därefter för β-cell (rader CF) och α-cellreplikering (rader GJ): DMSO = 3,3 ± 0,66 (rader CF) och 3,4 ± 0,23 (rader GJ) (p = 0,80); dipyridamol = 9,8 ± 0,86 (rader CF) och 10,4 ± 0.1.1 (rader GJ) (p = 0,43). Därför är dessa brunnar, även färgade för olika cell härstamning markörer (insulin och glukagon), svarade på samma sätt som läkemedelsbehandling.
Nästa replikationshastigheter av p-celler och a-celler beräknades från rådata (tabell 2). Det genomsnittliga antalet p-celler (händelse 1) ökades till följd av dipyridamol behandling: DMSO 3930 ± 488 vs. dipyridamol 4589 ± 218 (p <0,05). Det finns till en betydande minskning av antalet P-celler (3930 ± 488) jämfört med PDX-1-celler (5541 ± 555) (p <0,01). Detta är ett resultat av undantag PDX-1 + -celler som insulin - från β-celltal, t.ex. δ-celler eller β-cell progenitorceller, och ytterligare stringens att kräva p-celler att vara insulin +. Särskilt gjorde antalet a-celler (händelse 1) inte öka med dipyridamol behandling (DMSO 1465 ± 123 mot dipyridamol 1467 ± 74,7; p = 0,93). Hence, ökar dipyridamol selektivt β-cellantal. Antalet repliker p-celler (händelse 2) ökas som svar på dipyridamol behandling (DMSO 131 ± 31 vs. dipyridamol 476,5 ± 39,6; p <0,01), men antalet repliker a-celler (händelse 2) är inte (DMSO 10,25 ± 3 vs. dipyridamol 9,0 ± 1,6; p = 0,5). Slutligen den procentuella andelen av replikerande β-cells och a-celler beräknas ((händelse 2 / händelse 1) x 100). I själva verket ökar dipyridamol andelen replikerande p-celler men inte a-celler (som sammanfattas i figur 5). Viktigt är basal β-cellreplikation hastigheten för en sund kultur varierar mellan experiment (0,5-3%), men bör vara mycket konsekvent över brunnar inom ett experiment. Eftersom den basala replikation är variabel, är föreningen-inducerad β-cellreplikation hastighet också variabel tvärs experiment; är dock fold-induktion av β-cellreplikation konsekvent mellan experiment och gör det möjligt för föreningen effekt tillförlitligt jämföras mellan experiment. Noterbart är den α-cellreplikation hastighet ~ 5 gånger lägre än β-cellreplikation hastighet och kulturer innehåller ~ 1/3 så många a-celler såsom p-celler; följaktligen de α-cellreplikation index displayer ökad variabilitet jämfört med β-cellreplikation index. För att begränsa variationen, bilderna per brunnökas från 49 (används här) till maximalt 81.
Figur 1: Isolerad och spridda råttöar. (A) En mikrograf av friska isolerade råttöar; 100 pm skala bar visas. (B) Mikro (5X och 10X mål) av spridda råttöar en timme efter plätering; 100 | j, m (vänster) och 200 | j, m (höger) skala staplar som visas. (C) Mikro (5X och 10X mål) av spridd råttöar 48 timmar efter plätering; 100 pm (till vänster) och 200 m (höger) skalstaplar som visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Automatiserad Identifiering av PDX-1 + + ö-celler. (A) Förening behandlade spridda rått cellöar färgade för PDX-1. PDX-1 + objekt inringad i blått; uteslutna objekt inringade i orange. Skala bar på 150 um visas. (B) Samma fält av ö-celler färgade för Ki-67. PDX-1 + ki-67 + dubbel-positiva celler är inringade i grönt. Skala bar på 150 um visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Automatiserad Identifiering av Replikera p-celler Replikera p-celler identifieras genom DAPI (vänster-övre hörnet, blå cirklar), PDX-1 (höger-övre hörnet, gröna cirklar), insulin (vänster nedre hörn, magenta cirklar) och Ki-67 (höger nedre hörnet, röda cirklar) co-eXpression. Den sammanslagna bilden (till höger) visar flera replikerande p-celler. Skala bar på 150 um visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Automatiserad Identifiering att replikera a-celler Replikera a-celler identifieras genom DAPI (vänster övre hörn, blå cirklar), avsaknad av PDX-1 (höger-övre hörn, gröna cirklar), glukagon (vänster nedre hörn, magenta cirklar) och Ki-67 (höger nedre hörnet, röd cirkel) co-uttryck. Den sammanslagna bilden (till höger) visar en sällsynt replikerande dubblett av a-celler (gul pil). Skala bar på 150 um visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Dipyridamol Inducerar PDX-1 + - och β-cell-replikering men Inte α-cell-replikering Grafisk representation av PDX-1-cell (uppe till vänster), β-cell (överst till höger) och α-cell (nederst till vänster) replikering i DMSO och dipyridamol behandlade brunnar visas. Staplar representerar medelvärdet av oberoende behandlade brunnar (PDX-1-replikation, n = 8; β-cell och α-cellreplikering, n = 4). Felstaplar indikerar standardavvikelsen (* p <0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| EN. | Behandling: | färgning: | |
| 4 | 5 | ||
| C | DMSO | dipyridamol | Insulin, DAPI, PDX-1 Ki-67 |
| D | DMSO | dipyridamol | Insulin, DAPI, PDX-1 Ki-67 |
| E | DMSO | dipyridamol | Insulin, DAPI, PDX-1 Ki-67 |
| F | DMSO | dipyridamol | Insulin, DAPI, PDX-1 Ki-67 |
| G | DMSO | dipyridamol | Glukagon, DAPI, PDX-1 Ki-67 |
| H | DMSO | dipyridamol | Glukagon, DAPI, PDX-1 Ki-67 |
| jag | DMSO | dipyridamol | Glukagon, DAPI, PDX-1 Ki-67 |
| J | DMSO | dipyridamol | Glukagon, DAPI, PDX-1 Ki-67 |
| B. | Antal PDX-1 + -celler | ||
| DMSO | dipyridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 5158 | 6249 | |
| D | 6365 | 6795 | |
| E | 4830 | 6974 | |
| F | 5988 | 6408 | |
| G | 5574 | 6532 | |
| H | 5939 | 6411 | |
| jag | 5612 | 6387 | |
| J | 4862 | 5759 | |
| Procent av PDX-1 + Ki-67 + celler | |||
| DMSO | dipyridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3,04 | 9,99 | |
| D | 3,91 | 10,57 | |
| E | 2,51 | 8,58 | |
| F | <td> 3,7710,14 | ||
| G | 3,44 | 10,1 | |
| H | 3,06 | 10,69 | |
| jag | 3,58 | 9,07 | |
| J | 3,52 | 11,74 | |
Tabell 1: representant försöksplan och PDX-1 + -cell replikering Data. (A) En översikt av behandlingsplan visas. Brunnar behandlades med DMSO (kolumn 4) eller dipyridamol (kolumn 5). Färgning utfördes med DAPI, anti-PDX-1, anti-insulin (normal bokstäver) eller anti-glukagon (kursiv text) och Ki-67 (B) Totalt antal PDX-1 + celler (topp, DAPI +PDX-1 +) per brunn och den procentuella andelen av replikerande PDX-1-celler (botten, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + x 100) per brunn är visade.
| Händelse 1: | |||
| DMSO | dipyridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3557 | 4352 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) |
| D | 4387 | 4542 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) |
| E | 3462 | 4879 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) |
| F | 4315 | 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) | |
| G | 1594 | 1567 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) |
| H | 1477 | 1439 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) |
| jag | 1491 | 1390 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) |
| J | 1298 | 1474 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) |
| Händelse 2: | |||
| DMSO | dipyridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 113 | 425 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+) |
| D | 152 | 511 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+) |
| E | 97 | 466 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+) |
| F | 163 | 504 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+) |
| G | 13 | 9 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) Ki-67 (+) |
| H | 10 | 9 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) Ki-67 (+) |
| jag | 6 | 11 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) Ki-67 (+) |
| J | 12 </ Em> | 7 | # DAPI (+) PDX-1 (+) Glukagon (+) Ki-67 (+) |
| % Replication: | |||
| DMSO | dipyridamol | ||
| 4 | 5 | ||
| C | 3,18 | 9,77 | |
| D | 3,47 | 11,25 | |
| E | 2,8 | 9,55 | |
| F | 3,78 | 10,99 | |
| G | 0,82 | 0,57 | |
| H | 0,68 | 0,63 | |
| jag | 0,4 | 0,79 | |
| J | 0,92 | 0,48 | |
Tabell 2: Representant β-cell och α-cell replikering Data Det totala antalet p-celler (Händelse 1: DAPI + PDX-1 + insulin +; top tabellrader CF, normal bokstäver).), Α-celler (Händelse 1 : DAPI + PDX-1 + glukagon +; top tabellrader GH, kursiv text), replikerande p-celler (Händelse 2: DAPI + PDX-1 + insulin + Ki-67 +, mitt tabellrader CF, normal bokstäver) och α -celler (Händelse 2: DAPI + PDX-1 + glukagon + Ki-67 +, mitt tabellrader GH, kursiv text)per brunn är visade. Dessutom, den procentuella andelen av replikerande p-celler (DAPI + PDX-1 + insulin + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insulin + x 100; bottom tabellrader CF, normala bokstäver) och a-celler (DAPI + PDX -1 + glukagon + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + glukagon + x 100, bottentabellrader GJ, kursiv bokstäver) per brunn visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentella metoder för att studera de molekylära vägar som kontrollerar β-celltillväxt och förnyelse är viktiga verktyg för diabetesforskare. Häri till en råtta-ö-baserad screening plattform identifiera och karakterisera småmolekylära stimulatorer av β-cellreplikation presenteras.
Medan de flesta aspekterna av detta protokoll är lätt utföras av erfarna forskare, bara några steg kräver särskild teknik. Först under holme isolering, kanyle av galla-kanal utan att störa dess integritet kräver övning. En hjälpsam strategi är att minimalt blåsa gallgången för att säkerställa korrekt positionering av nålen innan fullt dispense bukspottkörtelns matsmältningen lösning. För det andra, effektiv holme isolering från exokrin vävnad kräver stor uppmärksamhet åt matsmältningen varaktighet och lämplig agitation. Försiktighet bör vidtas för att säkerställa en jämn värme i hela sammandraget genom intermittent virvlande. För det tredje, experimentell framgång berors på skickliga diskriminering mellan kobbar och exokrin skräp vid manuell holme plockning; denna färdighet förbättras med praxis. För det fjärde är ö-dispersion och plätering gjort så att alla cellöarna är dispergerade i en blandning av enkelceller och små kluster av två eller tre celler. Över- och under digestion av cellöar före plätering störa experimentell prestanda. Freshly pläterade ö-celler bör vara ungefär 50% sammanflytande före spridning och fick fästa över 48 h utan att bli störd. Figur 1 visar utseendet av framgångsrika islet cellkulturer vid olika tidpunkter efter utstrykning. För det femte är medie förändringar för ö-cellkulturer göras noggrant för att undvika störningar av svagt vidhäftande celler. Sjätte måste antigenåtervinning göras försiktigt för att undvika skevhet i flera brunnar men tillräckligt för att möjliggöra framgångsrik Ki-67 färgning som är känslig för både under- och överexponering för temperaturhöjning; skeva plattor kan inte användas förautomatiserad bildförvärv. Observera överdriven bukspottkörteln matsmältningen, exponering för exokrin vävnad skräp och / eller trypsinering är vanliga orsaker till ö-cellodling misslyckande.
En begränsning av detta protokoll är att det bygger på specifika uttryck markörer för β-cellidentitet och replikeringshändelser. Användning av enskilda markörer har potential att bli missvisande. Till exempel är PDX-1 uttrycks av p-celler, en delmängd av somatostatin-uttryckande ö-celler och β-cellstamfäder 29,30; hence, kan föreningar som ökar PDX-1-cellreplikation vara specifikt verkar på ett icke-β-cellpopulationen. Följaktligen bekräftande studier som använder alternativa β-cellmarkörer är nödvändiga. På samma sätt är Ki-67 uttryck inte en perfekt markör för replikering och ytterligare indikatorer såsom BrdU och fosfor-histon 3 bör användas 31. En andra begränsning med denna analys är att föreningar som inducerar β-cellreplikation kan simultanegare öka β-cell apoptos eller de-differentiering. Därför är det viktigt att utvärdera huruvida en förening inducerar en absolut ökning av β-cellantal och / eller inducerar β-cellapoptos och huruvida föreningsbehandlade p-celler bibehålla normal funktion (glukosstimulerad insulinutsöndring) 32. En tredje begränsning av denna analys är den blygsamma genomströmning i samband med användning av primära ö-celler; öar från sex råttor genererar 228 experimentella brunnar som gör ~ 55 föreningar som skall screenas i fyra exemplar (plus positiva och negativa kontroller). En ytterligare begränsning av den beskrivna β-cellreplikation screening plattform är användningen av råttöar snarare än humana öar. Skillnader mellan människa och råtta öar är tillräckliga för att kräva att alla replikeringsfrämjande föreningar identifierades med användning av råttöarna kulturer bekräftas med mänskliga ö kulturer. Med tanke på den begränsade tillgången, och höga kostnader för mänskliga öar, primärscreening med humant islets är opraktiskt för de flesta forskare.
De främsta fördelarna med detta protokoll är: 1) användningen av nyisolerade primära holmar att upprätthålla begränsningar normala tillväxten i största möjliga utsträckning, 2) användning av en 384-brunnar för att tillåta måttlig screening (typiskt öar isolerade från sex råttor är tillräckliga för 228 brunnar) och 3) användningen av automatisk bildtagning och analys för att öka takten i experiment och för att begränsa partiskhet. Däremot vanligen använda alternativa metoder förlitar sig på manuell bildtagning och subjektiv bedömning av β-cellreplikeringshändelser eller hela ö inkorporeringen av radioaktivt tymidin som inte diskriminerar mellan cell linages, exempelvis fibroblaster kontra β-cellreplikation 15,17. Därför utgör den presenterade protokollet en viktig och förbättrat verktyg för att undersöka tillväxt regleringen av p-celler.
Vi föreställer oss en mängd anpassadanvänder för denna screening plattform. För det första kan en absolut ökning av β-cellantal mätas genom att räkna antalet PDX-1 + - eller insulin + -celler. Att ta hänsyn till variationer i antalet celler utstrukna per brunn ett högre antal replikat per betingelse kan inkluderas (typiskt n = 8). För det andra, kan plattformen anpassas för lentivirus-baserad överuttryck eller knock-out / ned experiment för att identifiera vägar som är involverade i β-cellreplikation. Sammanfattningsvis är den beskrivna experimentella tekniken i stort sett användbara för att identifiera föreningar och de molekylära vägar som reglerar β-cellreplikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 ml | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 ml | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
- Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
- Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
- Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
- Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
- Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
- Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
- Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
- Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
- Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
- Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
- Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
- Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
- Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
- Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
- Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
- Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
- Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
- Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
- Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
- Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
- Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).
- Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
- Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
- Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
- Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).
