Introduction
Autismus - Spektrum - Störung (ASD) ist eine Erkrankung des Nervensystems , bestehend aus drei Kernsymptome: soziale Beeinträchtigung, Schwierigkeiten durch die Sprache zu kommunizieren, und sich wiederholende gemusterte Verhaltensweisen 1. Seit 2000 ist die Anzahl der Personen , die mit ASD diagnostiziert wurde , wurde von 1 in 150 bis 1 in 68 in der Spanne von zehn Jahren 2 erhöht. Obwohl die Prävalenz der Erkrankung weiter zu erhöhen, wird die Ursache der Erkrankung ist noch nicht bekannt. Es hat sich zu einem Anstieg der Bemühungen für den Kern und die damit verbundenen Symptome von ASD entsprechenden Mausmodelle zu identifizieren, da diese Modelle zu einem erhöhten Verständnis der zugrundeliegenden Symptome und Ursachen von ASD führen könnte. Es gibt mehrere Inzucht - Mausstämme , die drei Verhaltensweisen , die mit Augenscheinvalidität für die Kernsymptome von ASD, einschließlich repetitive Verhaltensweisen angezeigt erscheinen.
Beschränkt, sich wiederholende Verhaltensweisen (RRBs) sind ein Kernsymptom einigen psychiatrischen Störungen wie ASD.RRBs kann mit der Schwere der Erkrankung 4, erhöhen und den Lebensstil der Betroffenen drastisch stören können. RRBs werden üblicherweise in zwei Kategorien eingeteilt, niedrigerer Ordnung repetitive Verhaltensweisen, die bei Menschen von Aktionen bestehen wie Schaukeln und Hand flattern; und höherer Ordnung repetitive Verhaltensweisen, die der strikten Einhaltung bestehen , um Routine und Widerstand gegen Veränderungen 5-8.
Niedrigerer Ordnung repetitive Verhaltensweisen wurden bei Nagetieren umfassend untersucht , wo sie als Motor Stereotypien manifestieren, die sich leicht im Labor 9 beobachtet werden können. Diese Verhaltensweisen scheinen gute Augenscheinvalidität beim Menschen für RRBs haben und möglicherweise starke Konstruktvalidität sowie 10. Die Prüfung auf das Vorhandensein von niedrigerer Ordnung RRBs kann durch Video - Überwachung der Mausaktivitäten abgeschlossen werden , um die Kämpfe und die Dauer dieser Motor Stereotypien 11 zu studieren. Höherwertige repetitive Verhaltensweisen stellen eine Herausforderung für die grundlegende biomedizinische reSuche Nagetiere verwendet, da diese RRBs sind nicht so leicht durch einfache Beobachtung identifiziert. Aufgrund der Schwierigkeit, diese Verhaltensweisen zu identifizieren, gibt es weniger etablierte Assays für höherer Ordnung repetitive Verhaltensweisen. Traditionell wurden höherer Ordnung RRBs wurden bei Nagetieren mit einem Labyrinth Paradigma gemessen, wo das Versuchstier trainiert Kompetenz in Flucht zu erreichen. Die Escape - Standort wird dann eingeschaltet und die Anzahl der Versuche die Flucht Lage neu zu lernen erforderlich ist 12 aufgezeichnet. Diese Tests sind nicht ideal, da sie eine längere Einarbeitungszeit erfordern, die oft Angst hervorrufen und kann in sehr unterschiedlichen Ergebnissen führen. Loch-Board - Exploration ist auch verwendet worden höherer Ordnung 13,14 RRBs zu quantifizieren. Dieser Ansatz erfordert keine längere Trainingseinheiten, sondern verlässt sich auf die Lebensmittel Motivation und / oder olfaktorischen Diskriminierung. Assays für die höhere Ordnung RRBs, die nicht anxiogen sind oder erfordern Ausbildung eine schöne Ergänzung zum bestehenden Repertoire von Loch Bord explo wäre n und Labyrinth-basierte Assays derzeit im Einsatz.
Die C58 / J (C58) Inzuchtmausstamm ein Beispiel für stark ein hohes Maß an Stereotypien mit ASD verbunden sind , nämlich sich wiederholend, zwecklos Motor Stereotypien und erhöhten Selbst Grooming 3,11. Darüber hinaus zeigen die C58 Mäuse RRBs durch ein hohes Maß an Aufzucht, zurück Spiegeln und 11,14,16 krabbelten. Dieser Stamm beginnt diese Verhaltensweisen früh in der Neugeborenenperiode zeigt und setzt sie im Erwachsenenalter angezeigt werden soll. Es wäre ideal, um auf das Vorhandensein von erhöhten höherer Ordnung RRBs zu testen, die gut dokumentierten niedrigerer Ordnung RRBs in diesem Stamm sowie andere Mausstämme zu ergänzen. Das neue Objekt Exploration beschriebene Test hier bietet die Möglichkeit für Forscher niedrigerer Ordnung und RRBs höherer Ordnung gleichzeitig zu beobachten, da es die Möglichkeit gibt, strukturierte Verhaltensweisen sowie repetitive motorische Stereotypien zu messen.
e_content "> Verwendung von neuartigen Objekt Exploration als ein Test für eine höhere Ordnung repetitive Verhaltensweisen wurde von Pearson et al. 17. Diese neue Einschätzung ist eine Erweiterung der etablierten offenen Feldtest 18-21 mit dem Zusatz von vier neuen Objekte die Arena. die Mäuse wurden diese unbekannten Objekten und die Anzahl und Reihenfolge der Objekt Untersuchungen aufgespürt wurde frei untersuchen erlaubt. die Objekt Untersuchungen dann auf das Vorhandensein von Mustern analysiert wurden, mit BTBR Mäuse unter den Objekten erhöhten Zahlen von gemusterten Untersuchungen angezeigt werden. mit dieser Assay, Mäuse können höherer Ordnung wiederholend und gemusterten Verhalten anzuzeigen, während die Notwendigkeit beseitigt Verhaltensweisen sowie die Beseitigung unnötiger Reize zu lernen. Neuartige Objekt Exploration induziert höherer Ordnung RRBs, wie es die Mäuse können Muster und Form Sequenzen durch ihre natürliche Exploration zu schaffen . Unter Verwendung dieses Tests die Ermittler ermöglicht das Vorhandensein dieser höherer Ordnung RRBs zu quantifizieren.Pearson et al. dieses Assays entwickelt und verwendet es 17 für die Anwesenheit von potentiellen höherer Ordnung wiederholender Verhaltensweisen in der BTBR Inzuchtmausstamm mit interessanten Ergebnisse zu testen. Wir haben vor kurzem eine Follow-up-Studie Blick auf die Verhaltensweisen der C58, C57BL / 6J (C57) und FVB / NJ (FVB) Stämme, sowie eine detailliertere Untersuchung in potentielle Störvariablen in diesem Test und mögliche veröffentlicht statistische Ansätze , die Daten zu analysieren 22 erzeugt.
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Protocol
Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Redlands genehmigt. Die C58, C57 und FVB-Mäuse in diesen Studien verwendet wurden an der University of Redlands Vivarium gezüchtet ab Lager vom Jackson Laboratory ursprünglich (Bar Harbor, ME). Sentinels von diesem Vivarium wurden alle sechs Monate überprüft und gefunden Erreger frei zu sein.
1. Ausstattung und Rauminstallation
Hinweis: Wir haben zwei verschiedene Arenen für neuartige Objektprüfung: eine klare Kunststoff-rechteckigen Käfig (45 cm x 24 cm x 20 cm) oder ein undurchsichtiger Kreis Käfig mit einem Basisdurchmesser von 41 cm; Es kann jedoch jeder Käfig verwendet werden. Pearson et al. Verwendet , um einen kleineren rechteckigen Käfig (20 cm x 30 cm x 20 cm) in ihrer Assay. Einzelheiten von diesem spezifischen experimentellen Design sind unten aufgeführt, aber die Neuheit dieses Tests gegeben, gibt es keine anerkannten Standards im Bereich der Verhaltens Phänotypisierung für jede der beschriebenen Variablen.
- Wählen Sie vier verschiedene neue Objekte. Wählen vier Objekte, die in etwa gleich groß sind, mit hoher Dichte Kunststoff aufgebaut Reinigung zu erleichtern und zu widerstehen Kau- und voneinander verschieden in Form und Farbe. Wichtig ist, sicherzustellen, dass die Testmäuse auf diese Objekte nicht ausgesetzt werden, bis in dem Test ausgeführt wird.
Hinweis: Zum Beispiel, ein rosa Spielzeug Ziegel, ein roter Affe, eine weiße Fliese mit blauer Schrift und ein Standard-weißen Würfel wurden hier verwendet. - In der rechteckigen Arena, legen Sie diese Objekte in etwa 3 cm von den Ecken. In der Runde Arena, legen Sie die Objekte, so dass sie in gleichen Abständen zueinander und etwa 10 cm von den Seiten sind. Zeichnen Sie die Platzierung jedes Objekt als eine andere Zahl, 1-4 (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Gegenstände in einer zufälligen oder ausgeglichen, um während des Tests angeordnet sind.
- Positionieren Sie eine Kamera direkt über dem TestArena die gesamte Arena während der Akklimatisierung und Testperioden aufzuzeichnen.
Hinweis: Ermittler im selben Raum mit den Mäusen zu haben, kann potenziell Aktivitätsniveau beeinflussen und Exploration während des Tests.
2. Novel Object Exploration-Test
- Test am Anfang des Lichtzyklus in einem Raum mit fluoreszierendem Licht bei etwa 100 lux beleuchtet. Stellen Sie sicher, dass die Beleuchtung über das Testfeld gleichmäßig ist Aussehen, während Videoaufzeichnung zu standardisieren.
- Legen Sie eine Notecard mit bekannten Abmessungen in der Unterseite der Testarena und Videoaufzeichnung beginnen.
- Übertragen Sie die Test Maus in eine leere Testfeld für 10 min als Eingewöhnungszeit zu dienen. Videoaufzeichnung der Eingewöhnungszeit.
- Nach der Eingewöhnungszeit, lassen Sie die Maus in der Arena, die vier neue Objekte in die Test Arena schnell hinzufügen und das Mausverhalten für weitere 10 Minuten aufzeichnen.
- Sobald die volle 20 Minuten Akklimatisierung / Prüfung peRIOD verstrichen ist, kehren Sie den Test Maus in seinen Käfig zu Hause und gründlich zu reinigen und zu trocknen, die die neuen Objekte und Testfeld mit unscented Spülmittel und Wasser.
3. Video-Scoring
- Füllen Sie alle Verhaltensscoring mit Video-Zuverlässigkeit zu erleichtern.
Hinweis: Die Verhaltenserfassungssoftware Noldus Der Observer verwendet wurde , um die Schritte auszuführen , 22 , wie hier beschrieben, aber ein spezielles Programm ist nicht erforderlich:- Vor dem ersten Video-Scoring, stellen Sie das Projekt Codierungsschema in der Verhaltens-Logging-Software, indem Sie ein neues Projekt erstellen oder eine vorhandene, ähnliches Projekt bearbeiten.
- Im Setup-Box-Projekt festgelegt Datenerfassung auf 'Offline Beobachtung. " Innerhalb des Verhaltens Codierung, Programm "Scrabble", "Graben", "Aufzucht", "Grooming" und "Sniff Objekt 1, 2, 3 und 4" als "staatliche Events". Programm "Springen" als "Punkt-Ereignis". Hinweis: Definitions für diese Verhaltensweisen sind im Detail an anderer Stelle 11 beschrieben.
Hinweis: State Events einen Start haben und die Zeit stoppen, während Point Events einfach Zähldaten sammeln. Die Tastenanschläge für jede diskrete Verhalten werden von der Software erzeugt und diese entsprechenden Tastenanschläge werden in einen Sekundär Tastatur (Schritt 3.1.2) programmiert. - Um die Sekundär Tastatur programmieren, die Tastatur-Software öffnen, klicken Sie auf die entsprechende Sekundär Tastatur-Taste auf dem Bildschirm, geben Sie in der entsprechenden Tastenkombination angezeigt wird, und klicken Sie auf OK. Sobald die sekundäre Tastatur programmiert ist, schließen Sie die Software als das Programm im Hintergrund des Computers ausgeführt werden.
- Im Setup-Box-Projekt festgelegt Datenerfassung auf 'Offline Beobachtung. " Innerhalb des Verhaltens Codierung, Programm "Scrabble", "Graben", "Aufzucht", "Grooming" und "Sniff Objekt 1, 2, 3 und 4" als "staatliche Events". Programm "Springen" als "Punkt-Ereignis". Hinweis: Definitions für diese Verhaltensweisen sind im Detail an anderer Stelle 11 beschrieben.
- Sobald das Projekt und wurde eingerichtet, die Verhaltens-Logging-Software verwenden, um die Anzahl und Dauer der bäumt punkten (definiert als beide Vorderpfoten auf einer Wand der Arena platziert wird), gräbt (definiert als zwei Vorderpfoten der Maus Wühlen in die Betten der Arena), selbst Bräutigame (als m definiertOuse jede Region ihren eigenen Körper zu lecken und / oder mit der Maus einen beliebigen Teil des Gesichts mit den Vorderpfoten) zu berühren, und springt (wie eine Maus Haltung definiert und springt dann so, dass alle vier Meter über dem Boden sind gleichzeitig).
- Um ein Video zu erzielen, gehen Sie zu Datei> Projekt öffnen und dann Beobachten> Beobachtung> Neu. Das Programm fragt nach einem Dateinamen. Sobald benannt, wählen Sie die entsprechende Videomediendatei.
- Beginnen Sie den Torreigen auf die Schaltfläche Start Beobachtung durch einen Klick.
Hinweis: Wenn die Maus sich wiederholende Verhalten Scoring, alle staatlichen Ereignisse erfordern zwei Tastenanschläge, die erste auf die Einleitung des Verhaltens entspricht, und die zweite bis zum Ende des Verhaltens entspricht. Point Events nur einem Tastendruck erfordern.
- Ergebnis die Anzahl der Male der Maus jedes Objekt schnupperte. Sniffs werden als jederzeit definiert eine Maus die Nase bewegt sich innerhalb von 0,5 cm eines Objekts. Messen Sie schnüffeln Dauer Verhaltens-Logging-Software auf die gleiche Weise verwenden, die Repetitive Verhalten Dauern wurden gemessen (Schritt 3.1.2).
- Jedes Mal , wenn eine Maus ein Objekt schnüffelt, notieren Sie die entsprechenden Positionsnummer, die zu einer Reihe von Zahlen , die durch das Ende der 10 Minuten Testzeit (zB 1243421 ...) führen wird. Aufzeichnung manuell diese Daten.
Hinweis: Zur Erleichterung der Effizienz und Konsistenz während Scoring-Videos, die Zahlen immer zu einer bestimmten Position entsprechen, nicht widersprechen. - Wenn eine Maus ein Objekt schnüffelt, schaut weg, dann wieder das Objekt schnüffelt, doppelt so viele zählen.
- Sobald die volle 10 min Video erzielt wurde, zu visualisieren, die Daten mit einem Klick auf Analysieren> Behavior Analysis> Neu. Einmal werden die Daten auf dem Bildschirm, Export oder Kopieren und Einfügen in eine separate Tabelle.
- Jedes Mal , wenn eine Maus ein Objekt schnüffelt, notieren Sie die entsprechenden Positionsnummer, die zu einer Reihe von Zahlen , die durch das Ende der 10 Minuten Testzeit (zB 1243421 ...) führen wird. Aufzeichnung manuell diese Daten.
- Notieren Sie die Gesamtstrecke der Maus in der Arena während des Tests gereist.
Hinweis: Die Video-Tracking-Software, kalibriert, um die Test-Maus zu verfolgen und die Gesamtdistanz in Zentimeter bewegt aufzunehmen, wurde verwendet,um diesen Schritt auszuführen. Alle von der Video-Tracking-Software erzielte Videos hatte eine Notecard mit bekannten Dimensionen in der Arena zu Beginn des Videos platziert.- Verwenden Sie die Notiz ein Video innerhalb der Software zu kalibrieren, indem eine Kalibrierungslinie entlang jedem Ende der Notecard Einstellung und Eingabe der entsprechenden Länge innerhalb der Kalibrierungsbildschirm der Software. Sobald die Linien gezogen sind, geben die bekannte Länge und Breite der die Notiz, die jeder Zeile entsprechen.
- Im Arena-Einstellungen, die gesamte Arena wählen.
Hinweis: Getrennte Bereiche der Arena können in der Software differenziert werden , wenn zum Beispiel die Mausbewegung entlang der Wände gegen die durch den Mittelpunkt des Interesses stand. - Im Teststeuerungseinstellungen, wählen Sie eine von zehn Minuten Dauer. In Erkennungseinstellungen, ein dunkles Objekt auf einem hellen Hintergrund wählen.
Anmerkung: Diese müsste geändert werden, wenn Albino-Mäuse wurden verwendet oder wenn der Hintergrund war ein dunkler Schatten. - Sobald die Einstellungenprogrammiert wurden, um die Videos punkten. Klicken Sie auf Acquisition> Öffnen Acquisition. Im Feld Acquisition Control auf Neuer Versuch und dann Test starten. Nach zehn Minuten vergangen sind, kann das Programm stoppt und die Daten visualisiert werden.
- Klicken Sie auf Analysieren> Statistik berechnen. Einmal werden die Daten auf dem Bildschirm, Export oder Kopieren und Einfügen in eine separate Tabelle.
- Vor dem ersten Video-Scoring, stellen Sie das Projekt Codierungsschema in der Verhaltens-Logging-Software, indem Sie ein neues Projekt erstellen oder eine vorhandene, ähnliches Projekt bearbeiten.
4. Statistische Analysen, Sequencing
- Innerhalb der Reihe von Zahlen entsprechenden Untersuchungen jeder Maus erzeugt Objekt, identifizieren die Gesamtzahl aller möglichen Ziffernkombinationen 3 ohne Wiederholungszahl (zB 121, 123, 124 , aber nicht 112 oder 122).
Hinweis: Ein Programm, geschrieben in Python Programmiersprache verwendet wurde, die Anzahl der jeweils mögliche Sequenz in der Zahlenfolge angezeigt zu identifizieren. Es ist nicht notwendig , eine externe Programm zu verwenden, und dieser Schritt viele verschiedene Weisen durchgeführt werden könnte (beispielsweise unter Verwendung voneine Suche-Funktion in Microsoft Word oder Excel). - Aufzeichnen der Anzahl der Male jede Sequenz auftritt und zu identifizieren, die drei am häufigsten wiederholten Sequenzen für jede Maus.
Anmerkung: Einzelsequenzen variiert , indem die Maus und die tatsächliche Sequenz von geringerem Interesse als die Anzahl , wie oft eine Sequenz wiederholt (dh Einhaltung eines Muster wichtiger als das Muster selbst). - Da die Gesamtzahl der Sequenzen, die eine Maus wiederholt positiv Aktivitätsniveau korreliert wird, diese Werte zu korrigieren, indem die Menge der am häufigsten Muster durch die Gesamtanzahl von Mustern für jede einzelne Maus, geteilt wird. Dies wird eine Sequenz wiederholen Index ergeben, die unabhängig von Gesamtaktivität ist.
- Vergleichen Sie die Anzahl , wie oft jede Maus ihrer häufigsten Sequenzen wiederholt (für Aktivitätsniveau korrigiert) zwischen den Gruppen eine entsprechende ANOVA, multiple Vergleichsverfahren (Dunnett-Test, für zB) und Post-hoc - Tests.
- Unter Verwendung der gleichen Reihe von Zahlen über (Schritt 3.1.3.1) erzeugt wird, identifizieren die neue Objekt bevorzugt jeder Maus durch die Gesamtzahl der Male zählt jedes Objekt untersucht wurde, oder in anderen Worten, die Gesamtzahl von 1 sec Zählen, 2 sec 3 s und 4 s in der Zeichenkette der Daten. Richtige für Aktivität und vergleichen über ANOVA, wie oben beschrieben (Schritte 4,3-4,4).
Hinweis: Diese Methoden veröffentlicht von unserem Labor 22 und hier beschrieben basieren stark auf Pearson et al 17.
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Representative Results
Die repräsentative Daten 22 zeigen , dass weibliche C58 / J - Mäuse eine höhere Anzahl an sequenzierten Muster als die anderen Stämme in der runden Arena angezeigt (Abbildung 2, Feld A), aber nicht in der rechteckigen Arena (Abbildung 2, Panel C). Keine der drei männlichen voneinander unterschieden Stämme (2, Platten B und D). Die repräsentativen Daten zeigen , dass sowohl männliche als auch weibliche C58 / J - Mäuse für ihre meist besuchten Objekt (und in der Folge eine geringere Präferenz für ihre am wenigsten besuchten Objekt) in der Runde Arena (3, Feld A und C) eine stärkere Präferenz anzeigen , aber nicht in dem rechteckigen Arena (3, Feld B und D).
Abb . 1: rechteckige und runde Arena Set-up für Novel Object Testing Ter Zahlen stellen die Position jedes Objekts, das für jede Maus wurden randomisiert. Diese Zahl hat sich von der Referenz 22 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Repräsentative Daten zeigen die Anzahl der Male die drei häufigsten 3-Mustersequenzen wurden wiederholt, als Prozentsatz der Gesamtzahl Aufgenommen von Patterns in drei Inzucht - Mausstämmen Die C58 Weibchen zeigten eine starke Haftung an ihre bevorzugten investigatory Muster in die runde Arena (A) , aber nicht die rechteckige Arena (C). Die drei Stämme von männlichen Mäusen unterschied sich nicht voneinander in entweder dem runden (B) oder rechteckig (D) sindnas. Die Daten sind als Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts * p <0,05 vs. C57 und FVB ** p <0,01 vs. C57 und FVB ausgedrückt. Diese Zahl hat sich von der Referenz 22 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Repräsentative Daten Veranschaulichung der Präferenz für einzelne Novel Objekte in drei Inzucht - Mausstämmen Die Daten werden als Prozentsatz der Gesamtobjekt Untersuchungen angezeigt, mit Auswahl 1 , die die am meisten bevorzugte Objekt für jede einzelne Maus und Auswahl 4 die am wenigsten bevorzugte Objekt. Male (A) und weiblichen (B) C58 Mäuse in der Runde Arena zeigten eine stärkere Präferenz für ihre am meisten bevorzugten Objekt als die beiden anderen Stämme taten. Männlich(C) und weiblichen (D) Mäuse zeigten keine Dehnungsunterschiede für die Objekt Präferenz in der rechteckigen Arena. Die Daten sind als Mittelwert + Standardfehler des Mittelwerts * p <0,05 vs. C57 und FVB # p <0,05 vs. FVB ausgedrückt. Diese Zahl hat sich von der Referenz 22 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzenden Code Datei:. Python Equivalent - Code Bitte hier klicken , um das Programm auszuführen.
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Discussion
Hier präsentieren wir eine kürzlich entwickelte Test, der für höhere Ordnung repetitive Verhaltensweisen beim Menschen für die Quantifizierung von Auslösern mit Augenscheinvalidität nützlich sein kann. Im Gegensatz zu etablierten Assays wie die Barnes oder T-Labyrinth, das neue Objekt Exploration Assay benötigt keine Maus Ausbildung noch ist es besonders zu provozieren Angst. Darüber hinaus erfordern neue Objekt Exploration keine Nahrung oder soziale Reize, auf das Verhalten von Interesse, RRBs für mehr Fokus ermöglicht, und die Wahrscheinlichkeit einer Störvariablen abnehmend die Ergebnisse verfälscht. Darüber hinaus haben verschiedene Mausstämme Differentialverhalten in diesem Test zeigen, mit Stämmen erhöht niedrigerer Ordnung RRBs zeigen auch erhöhte strukturierte Exploration und Objekt bevorzugt im neuen Objekt Exploration Assay 17,22 zeigt. Als solches wird dieser Test eine gute Augenscheinvalidität zu RRBs beim Menschen zu besitzen. Wenn der Test durch zukünftige Forscher modifiziert wird, wäre es vorteilhaft, zu bleiben,Erwägung der oben, nämlich der Mangel an Ausbildung aufgeführten Vorteile erforderlich, und die Minimierung von Angst-induzierende Stimuli. Auswahl der neuen Objekte (Abschnitt 1.2) im Assay verwendet wird, ist von entscheidender Bedeutung. Die Gegenstände sollten leicht zu reinigen sein, aber in Aussehen und eine ähnliche Größe unterscheiden. Mit Hilfe einer Kamera den Test (Abschnitt 1.4) und ermöglicht die Mäuse aufnehmen zum Testfeld (Abschnitt 2.3) sind ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da die Neuheit der Arena oder das Vorhandensein eines Experimentator im Raum akklimatisieren kann das Verhalten des Aufpralls Mäusen. Dies sind wichtige Aspekte des Protokolls beschrieben.
Trotz dieser Vorteile, gibt es andere Faktoren, die berücksichtigt werden sollten, wenn auf einen geeigneten Assay für höherer Ordnung RRBs entscheiden. Die größte Herausforderung , die Daten bei der Analyse durch diesen Test erzeugt wird , ist die Korrelation zu Aktivitätsniveaus, die 23,24 erheblich zwischen verschiedenen Mausstämmen unterscheiden können. Eine Möglichkeit für Controlling Aktivität leve unterschiedlichenls unter Vergleichsgruppen wurde diskutiert; kann es andere, geeignetere oder elegante Lösungen entweder mit experimentellen Design oder statistische Analyse zu berücksichtigen. Sorgfältig wählen Kontrollstämme mit ähnlichen Aktivitätsniveaus wie der Stamm von Interesse eine Möglichkeit ist. Alternativ auf einer statistischen Analyse nur eine Teilmenge der Daten (die ersten 50 neue Objekt Untersuchungen, zum Beispiel) ist eine weitere Möglichkeit.
Obwohl dieser Test induziert nicht von Natur aus Angst ist, können die natürliche Angst Ebenen von jeder Sorte zu Unterschieden in den gesammelten Ergebnissen führen. Sehr besorgt Mäuse bevorzugen typischerweise entlang den Wänden und Ecken eines offenen Feld Arena 23,25 und wenn die neuen Objekte in diesem Test gestellt werden zu bewegen , um den Kanten oder Ecken zu schließen, künstlich hoch neuartige Objektuntersuchungen können in ängstlicher Stämme aufgezeichnet werden. Wir haben versucht, für diese verwirrende Variable zu korrigieren, indem eine runde Testfeld mit und die Objekte weg von t bewegener Wände, zusätzlich 10 min Akklimatisierungsperiode vor dem Test zu verwenden. Andere mögliche Korrekturen könnten unter abgedunkelten Bedingungen zu testen, die im Heimatkäfig Maus oder durch die Eingewöhnungszeit variiert. Angst konnte sich innerhalb der neuen Objektexplorationsdaten quantifiziert werden, indem die Latenzzeit auf die erste Untersuchungs Messung sowie durch die Anzahl der wiederholten Untersuchung desselben Objekts ohne Unterbrechung zu messen.
Vision und olfaktorische Defizite konnten die Leistung in diesem Test beeinträchtigen auch. Die Unfähigkeit, zu riechen oder die neuen Objekte sehen Desinteresse oder der Unfähigkeit verursachen kann ein bestimmtes Muster zu etablieren, um Daten führenden was darauf hindeutet, dass eine Maus nicht anzeigt höherer Ordnung repetitive Verhaltensweisen. Einige Inzuchtstämme (Albino-Stämme im Besonderen) haben deutlich Sehschärfe beeinträchtigt, vor allem im fortgeschrittenen Alter. Dies schien nicht Verhalten zu beeinflussen in dieser Prüfung als Erwachsener FVB und C57-Mäuse (ein Albino und pigmentierte Stamm bzw.ektiv) zeigten keine konsistenten Unterschiede im Verhalten (Figuren 2 und 3). Allerdings könnte vernünftigerweise irgendwelche Beeinträchtigungen oder Anomalien in entweder Vision oder olfaction werden erwartet, um die Leistung der Mausstamm in diesem Test und Screening für grundlegende sensorische Fähigkeit für jede neue Belastung in dem neuen Objekt Exploration Assay verwendet empfohlen würde zu beeinflussen.
RRBs oft entstehen früh in der Kindheit der betroffenen Personen, und als solche ein Test, der das Vorhandensein von höherer Ordnung RRBs in jungen Mäusen Gesicht für den Aufbau und die Gültigkeit der potentiellen Mausmodelle konstruieren wäre von Vorteil messen könnte. Bisher wurde dieser Test nur auf erwachsene Mäuse verwendet. Novel Objekt Exploration für jüngere Mäuse schwierig sein kann, wie sie Schwierigkeiten haben, 10. Zusätzlich unabhängig vor etwa postnatalen Tag bewegen, Mäuse jünger als postnatalen Tag 14-16 können zögern, in neuartigen Arenen zu bewegen. Die Verkleinerung der Größe der Tests sindna verwendet hier und machen die Arena vertrauter (durch einen eigenen Käfig, zum Beispiel unter Verwendung) einige dieser Probleme verbessern könnte, aber es ist unklar, ob diese neuartige Objekt Exploration Assay zum Testen jüngere Mäuse geeignet ist.
Ein möglicher Satz von statistischen Analysen wurde hier diskutiert. In Anbetracht erzeugt die einzigartige Natur der Sequenzierungsdaten dieser Test, ist es durchaus möglich, dass alternative analytische Strategien zusätzliche Informationen entnehmen könnte, dass dieser relativ einfachen Ansatz aufdecken nicht. Die repräsentative Daten , die analysiert wurde und die hier enthalten zeigte bescheidene Anzeichen von gemusterten Sondierungs Verhaltensweisen , die als weibliche C58 Mäuse in der kreisförmigen Testfeld (2A) größer Wiederholung zeigte. Es gab keine Anzeichen einer Steigerung Wiederholungs Ebenen des C58 in dem rechteckigen Arena (2C) vorzuschlagen, sowie keinen Beweis , dass Männer jedes Muster in entweder Arena gezeigt (2B, 2D). there gibt derzeit keine Erklärung für den Unterschied in Verhalten zwischen den männlichen und weiblichen Probanden. Eine mögliche Erklärung könnte die inhärenten Verhalten dieser Mausstamm sein. Es hat sich gezeigt , dass männliche C58 sind in der Regel 11 mehr sich wiederholende und ängstliche Verhalten als ihre weiblichen Kollegen anzuzeigen. Dieser Unterschied in der ängstliche Verhalten könnte zu weniger Interesse führen eine Präferenz für ein bestimmtes Objekt und mehr Interesse in einfach die Erforschung dieser potenziell Angst induzieren neue Objekte bei der Bildung. Es ist durchaus möglich, dass auch andere Mausstämme auch Geschlechtsunterschiede in diesem Test zeigen.
Sowohl männliche als auch weibliche C58 Mäuse zeigten eine spezifische Objekt bevorzugt im Kreistestfeld , wie sie ihre bevorzugte neue Objekt häufiger sowie besucht ihre am wenigsten bevorzugte Objekt signifikant seltener als die anderen Stämme (3A, 3B) revisited. Die C58-Stamm zeigte auch Präferenz für ein Objekt über den anderen in die kreisförmige Bühne, aber nicht in dem rechteckigen Arena (3C, 3D). Dies ist wahrscheinlich auf einige hervorstechendes Merkmal der Runde Testfeld wie das Fehlen von Ecken, die größere Fläche Fläche für die Exploration zur Verfügung oder die erhöhte Entfernung der Objekte von den Wänden. Zukünftige Arbeiten auf diesem Test sollten die Auswirkungen dieser Variablen auf die Maus Exploration untersuchen.
Der primäre Fokus hier wurde auf höherer Ordnung repetitive Verhaltensweisen, aber da alle Verhaltensweisen in dem neuen Objekt-Test sind Video aufgezeichnet, es ist auch möglich, andere Verhaltensweisen zu messen. Niedrigerer Ordnung wiederholende Verhaltensweisen wie Aufzucht, Springen, Pflege und Graben sind in offenen Feld Assays wie diese häufig gesehen. Bei einigen Mäusen, kann dieses Verhalten mit dem Vorliegen von höherer Ordnung repetitive Verhaltensweisen konkurrieren und wäre wichtig, sowohl während der Akklimatisierung und Testzeit zu messen und zu quantifizieren.
Trotz der Tatsache, dass nurzwei Studien neuartige Objekt Exploration in Mäusen wurden bisher 17,22 veröffentlicht worden ist , hat dieser Test das Potenzial , einen bestehenden Bedarf für einen Test zu füllen , die höherer Ordnung wiederholendes Verhalten schnell und mit minimalem Störvariablen misst. Ein solcher Test würde ergänzen schön bestehenden Tests höherer Ordnung RRBs wie Lochbord Exploration und Umkehr Lernen. RRBs sind eine Kernfunktion von ASD und möglicherweise für das Leben der betroffenen Personen schwächend. Validierte Mausmodelle für Unter- und höherer Ordnung RRBs wäre extrem wertvoll sein für die Prüfung potenzielle pharmakologische und verhaltenstherapeutische Maßnahmen. Das neue Objekt Exploration beschriebene Test hier hat das Potenzial für eine sehr wichtige Notwendigkeit in grundlegenden biomedizinischen Forschung dienen.
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Acknowledgments
Die Autoren möchten die Sommer Wissenschaftliche Programm, das akademische Technologie User Group, das Center for Digital Lernen, und das Science Center an der University of Redlands anzuerkennen.
Die Autoren möchten sich dieses Papier auf den Speicher von Lou Yango zu widmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Polycarbonate Rodent Cage (45 cm x 24 cm x 20 cm) | Multiple cages are desirable to facilitate testing of multiple mice | ||
| Plastic Opaque Circular Testing Arena (41 cm base diameter) | United States Plastic Corp. | 13931 | Multiple arenas are desirable to facilitate testing of multiple mice |
| Standard Corn-Cob Rodent Bedding | |||
| Novel Object - red monkey | Hasbro, Pawtucket RI | from Barrel of Monkeys | |
| Novel Object - rectangular 2 x 4 LEGO | |||
| Novel Object - tile | Thinkfun Inc., Alexandria VA | from Toot and Otto | |
| Novel Object - standard white die | |||
| Video Camera | |||
| Behavioral Logging Software - The Observer | Noldus, Wageningen, The Netherlands | other programs may be used | |
| Video Tracking Software - EthoVision | Noldus, Wageningen, The Netherlands | other programs may be used | |
| X-Keys input keyboard | P.I. Engineering, Williamstown MI | 829484 | |
| MacroWorks II | P.I. Engineering, Williamstown MI |
References
- American Psychological Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders. , 5th edn, American Psychological Association. Washington, D.C. (2013).
- Baio, J. Prevalence of Autism Spectrum Disorder Among Children Aged 8 Years - Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network, 11 Sites, United States. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 63 (SS02), 1-21 (2010).
- Moy, S. S., et al. Social approach and repetitive behavior in eleven inbred mouse strains. Behav. Brain Res. 191 (1), 118-129 (2008).
- Bodfish, J. W., Symons, F. J., Parker, D. E., Lewis, M. H. Varieties of repetitive behavior in autism: comparisons to mental retardation. J. Autism Dev. Disord. 30 (3), 237-243 (2000).
- Lewis, M. H., Kim, S. The pathophysiology of restricted repetitive behavior. J. Neurodev. Disord. 1 (2), 114-132 (2009).
- Lewis, M. H., Bodfish, J. W.
- Lam, K. S. L., Bodfish, J. W., Piven, J. Evidence for three subtypes of repetitive behavior in autism that differ in familiarity and association with other symptoms. J. Child Psychol. Psychiatry. 49 (11), 1193-1200 (2008).
- Bishop, S. L., et al. Subcategories of Restricted and Repetitive Behaviors in Children with Autism Spectrum Disorders. J. Autism Dev. Disord. 43 (6), 1287-1297 (2013).
- Lewis, M. H., Tanimura, Y., Lee, L. W., Bodfish, J. W. Animal models of restricted repetitive behavior in autism. Behav. Brain Res. 176 (1), 66-74 (2007).
- Korff, S., Stein, D. J., Harvey, B. H. Stereotypic behaviour in the deer mouse: Pharmacological validation and relevance for obsessive compulsive disorder. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32 (2), 348-355 (2008).
- Ryan, B. C., Young, N. B., Crawley, J. N., Bodfish, J. W., Moy, S. S. Social deficits, stereotypy and early emergence of repetitive behavior in the C58/J inbred mouse strain. Behav. Brain Res. 206 (1), 178-188 (2010).
- Moy, S. S., et al. Mouse behavioral tasks relevant to autism: phenotypes of 10 inbred strains. Behav. Brain Res. 176, 4-20 (2007).
- Moy, S. S., Nadler, J. J., Poe, M. D., Nonneman, R. J., Young, N. B., Koller, B. H., et al. Development of a mouse test for repetitive, restricted behaviors: relevance to autism. Behav. Brain Res. 188 (1), 178-194 (2008).
- Moy, S. S., et al. Repetitive behavior profile and supersensitivity to amphetamine in the C58/J mouse model of autism. Behav. Brain Res. 259, 200-214 (2014).
- Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PLoS ONE. 3 (8), e3067 (2008).
- Muehlmann, A. M., et al. Further characterization of repetitive behavior in C58 mice: developmental trajectory and effects of environmental enrichment. Behav. Brain Res. 235, 143-149 (2012).
- Pearson, B. L., et al. Motor and cognitive stereotypies in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. Genes Brain Behav. 10 (2), 228-235 (2011).
- Belzung, C. Measuring exploratory behavior. Handbook of molecular genetic techniques for brain and behavior research (techniques in the behavioral and neural sciences). Crusio, W. E., Gerlai, R. T. , Elsevier. Amsterdam. 739-749 (1999).
- Kalueff, A. V., Keisala, T., Minasyan, A., Kuuslahti, M., Tuohimaa, P. Temporal stability of novelty exploration in mice exposed to different open field tests. Behav. Process. 72, 104-112 (2006).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur. J. Pharmacol. 46, 3-33 (2003).
- Walsh, R. N., Cumins, R. A. The open-field test: a critical review. Psychol. Bull. 83 (3), 482-504 (1976).
- Blick, M. G., Puchalski, B. H., Bolanos, V. J., Wolfe, K. M., Green, M. C., Ryan, B. C. Novel object exploration in the C58/J mouse model of autistic-like behavior. Behav. Brain Res. 282, 54-60 (2015).
- Crawley, J. N., et al. Behavioral phenotypes of inbred mouse strains: implications and recommendations for molecular studies. Psychopharmacol. 132, 107-124 (1997).
- Logue, S. F., Owen, E. H., Rasmussen, D. L., Wehner, J. M. Assessment of locomotor activity, acoustic and tactile startle and prepulse inhibition of startle in inbred mouse strains and F1 hybrids: implications of genetic background for single gene and quantitative trait loci analyses. Neurosci. 80 (4), 1075-1086 (1997).
- Lamprea, M. R., Cardenas, F. P., Setem, J., Morato, S.
