Jämförelse av tre olika metoder för bestämning av cellproliferation i bröstcancercellinjer
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
Tumörsuppressorgenen, p53, är en viktig reglerare av ett antal cellulära processer, inklusive cellcykelstopp, apoptos och åldrande 1. Det är ansvarig för att upprätthålla genomisk stabilitet, och är därför av avgörande betydelse för att upprätthålla balansen mellan celldöd och celltillväxt. Mutationer i p53 är vanliga i cancer och är den största orsaken till p53 inaktive leder till okontrollerad cancercelltillväxt 2. Intressant nog mutationer i p53 endast står för cirka 25% av bröstcancer 3, vilket tyder på att andra mekanismer är ansvariga för förlusten av p53-funktion. De nyligen upptäckta p53-isoformerna har visats vara överuttryckt i ett antal humana cancerformer, och kan modulera p53-funktion 4,5. Vi har tidigare visat att p53 isoformen, Δ40p53, är den mest uttryckt isoformen i bröstcancer och signifikant uppregleras i bröstcancerceller, jämfört med normala intilliggande tissue 6. Efter detta, stabilt omvandlade vi human bröstcancer MCF-7 att överuttrycker Δ40p53 använda Lego-IG2-puro + vektor (GFP +) 7. Dessa celler användes för att undersöka om hög Δ40p53 expression ökar cellförökningshastigheter i bröstcancerceller.
Det finns många direkta och indirekta metoder för att mäta cellförökning av odlade celler in vitro 8,9. Dessa kan utföras antingen som kontinuerliga mätningar över tid, eller som endpoint analyser 10. Konventionella metoder är fortfarande användbara, såsom cellräkning med användning av en hemocytometer. Denna analys är en låg kostnad och direkt mått på antalet celler, men det förlitar sig på stora celler och högkvalificerad utbildning för att minimera fel och stor standardavvikelser från räknas. Behovet att utföra mätningar som är kompatibla med hög genomströmning format har lett till utvecklingen av flerkälls-plattanalyser. Dessa luminiscens-baserade analyser measure cellantalet baserat på ett luminiscent signal som är proportionell mot den metaboliska aktiviteten hos cellen 11,12. På senare tid har införandet av hög halt avbildningsplattformar tillåtet för nya verktyg som övervakar celltillväxt samtidigt som samling kvantitativa och kvalitativa fenotypiska data och innehåller en mängd olika system 13. Alla dessa metoder ger vägar för att mäta celltillväxt, antingen genom kontinuerlig mätning eller slutpunktsanalyser, och var och en har en rad fördelar och nackdelar med avseende på känslighet, genommatning av provnummer, och cellinformation, som alla kan vägas i enlighet därmed beroende på frågeställningen.
Detta protokoll beskriver tre olika metoder för att mäta cellproliferation in vitro, med varje förfarande som utnyttjar olika sortiment av känslighet, reproducerbarhet och flerbrunnsplattformat. Detta protokoll som syftar att jämföra användningen av en hemocytometer räknings chamber, en luminiscens-baserade cellviabilitet assay, och cell imager, i mätningen av cellproliferation under en 96 timmars tidsförlopp. För att göra detta, var tillväxten av vektor-transducerade celler (MCF-7-LEGO) jämfört med celler som transducerats för att överuttrycka Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), med användning av tre olika celldensiteter. Cellproliferation mättes varje 24 h under upp till 96 timmar. Varje metod befanns ha sina egna fördelar och nackdelar, och beroende på syftet med experimentet, ändå är varje en värdefull metod för att tillhandahålla information på hastigheten för proliferation.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll tre olika metoder för att mäta cellproliferation i odlade celler undersöktes. Varje metod kunde reproducerbara och noggranna mätningar av celltillväxt över 96 timmar, och resultaten var jämförbara mellan var och en av de testade metoderna (Figur 2 och 3). Både luminiscens-baserad analys och cellavbildningsmetod producerade de mest robusta resultat, som visar linjära ökningar i cellproliferation efter 96 h (figur 2b, c). Dessutom cell imaging…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
- . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
- Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
- Bastidas, O. . , (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).
