Summary
Para esclarecer o processo de várias etapas de difusão peritoneal de carcinoma dos ovários, o presente estudo apresenta um modelo experimental murino de desenvolvimento do tumor original e metástases através de inoculação peritoneal ortotópico com essas células tumorais.
Abstract
carcinoma epitelial do ovário (EOC) está associada a um prognóstico ruim porque mostra disseminação peritoneal. Para melhorar o prognóstico, é importante controlar a disseminação peritoneal. No entanto, ainda não está claro como as células tumorais separar de lesões primárias e anexar ao mesotélio. O estabelecimento de um modelo animal apropriado é necessário para obter uma compreensão do mecanismo de disseminação peritoneal in vivo. No estudo actual, introduz-se o processo a partir da injecção local de células EOC para dentro da superfície do ovário murino para o desenvolvimento de metástases, incluindo o peritoneu e os órgãos distantes. Foram utilizados ratinhos nus fêmea (BALB / c nu / nu) com 8 semanas de idade. Sob um campo de vista microscópico, células EOC (1 x 10 5 células / ml de matriz de médio extracelular (ECM) à base de hidrogel / ovário unilateral / mouse) foram injetados em ovários murino através de uma abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal. Este método proposto é um less procedimento invasivo para o mouse e minimiza os danos ao ovário. Aqui, descrevemos os passos metodológicos para o desenvolvimento da formação do tumor original e metastático do EOC.
Introduction
Carcinoma epitelial do ovário (EOC) representa a maior taxa de mortalidade relacionada ao câncer entre as doenças malignas ginecológicas 1. EOC está associada a um mau prognóstico, principalmente devido ao seu final sintomatologia, e é muitas vezes associado a várias disseminações intraperitoneal e metástases à distância 2-4. disseminação peritoneal é um processo multi-passo. Em primeiro lugar, as células de tumor a partir de separar as lesões primárias, e migrar para dentro da cavidade abdominal. Quando as células tumorais anexar ao mesotélio peritoneal, eles começam a invadir os tecidos através do mesotélio 5,6. A fim de melhor compreender a biologia do tumor (por exemplo, a progressão do câncer e resposta terapêutica), modelos de ratos fornecer uma riqueza de informações. Um xenoenxerto de cancro humano com células é amplamente utilizada para modelos de ratos em que as células de cancro humano são inoculados por via subcutânea, por via intraperitoneal, por via intravenosa, e ortotopicamente. Um modelo animal com um ortotopicamente grafted tumor pode gerar mais eficientemente e com precisão os resultados que reflectem o ambiente tumoral em seres humanos, em comparação com um modelo animal com um tumor heterotopicamente enxertado. Por isso, para muitos tumores humanos, os modelos de transplante ortotópico foram estabelecidas 7-11.
Aqui, descrevemos a inoculação ortotópico de células EOC humanos através de uma abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal, que tem capacidade de invasão limitada em comparação com a inoculação ventral. Esta técnica pode proporcionar uma variedade de informações úteis sobre EOC, particularmente o mecanismo de difusão intraperitoneal.
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Protocol
O protocolo de tratamento segue as orientações para a experimentação animal adotado pela Universidade de Nagoya.
1. Preparação de suspensões de células
- linha de células humanas ovário clara carcinoma de células.
- Manter ES-2 em células 12 meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina / estreptomicina (penicilina: 100 unidades / ml, estreptomicina: 0,1 mg / ml). As células de cultura a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5% humidificada.
- Recolher as células em fase de crescimento logarítmico em 0,05% de solução de EDTA de tripsina / 0,02% (tripsina / EDTA).
- Em primeiro lugar, retirar os meios de idade a partir do recipiente de cultura de células, em seguida, lavar as células uma vez com PBS (PBS sem Ca2 + / Mg2 +, 3 - 4 2 ml por 25 cm).
- Em seguida, adicione 1 ml por 25 cm 2 de tripsina / EDTA. Rodar o recipiente de cultura de células para cobrir a monocamada de células com tripsina / EDTA. Depois de retirar e descartar tripsina / EDTA, devolver o celularrecipiente de cultura na incubadora durante 3-5 minutos ou até que as células são separadas.
- Examinar as células sob um microscópio para assegurar que as células são separadas da superfície do recipiente de cultura de células e flutuante.
- Adicionar soro fresco contendo meio de crescimento para inactivar a tripsina (5 ml por cada 25 cm2), e re-suspender as células. Transferir as células ressuspensas a um tubo de 15 ml.
- Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Realizar centrifugação quer a 4 ° C ou à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e as células com meio de crescimento re-suspensão (5 ml por 25 cm2).
- Contagem de células (por exemplo, por exclusão de tripano azul), em seguida, re-suspender em meio de crescimento a uma densidade de 2 x 10 8 células / ml. Colocar as células em suspensão em gelo.
- Descongelar matriz extracelular congelado (ECM) à base de alíquotas de hidrogel num banho de gelo.
- Adicionar a suspensão de células com ali quotas de hidrogel à base de ECM, na proporção de 1: 1 (célula C definitivaoncentration: 1 x 10 5 células / ml de hidrogel baseado em médio ECM) e misture bem. Coloque as suspensões de células preparadas num banho de gelo até à sua utilização.
2. ortotópico inoculação com suspensões de células
NOTA: A cirurgia não requer um conjunto dedicado. A cirurgia pode ser executada em uma bancada de laboratório em uma área do quarto que é separado e possui uma actividade mínima. Um capuz laminar também pode ser usado. instrumentos cirúrgicos esterilizados devem ser utilizados e as tesouras não deve ser usado para fazer incisões na pele.
- Use camundongos nu feminino (BALB / c nu / nu) com 8 semanas de idade, para este modelo de inoculação ortotópico.
- Em primeiro lugar, anestesiar o rato usando inalação com isoflurano (2-4%). Verifique a profundidade da anestesia, verificando a falta de retirada mediante pitada dedo do pé firme. Após o rato é anestesiado, aplique uma pomada oftálmica estéril branda para os olhos para evitar a secagem, se necessário.
- Coloque o rato anestesiado em um operating barriga do lado do palco para baixo. Desinfectar a área cirúrgica várias vezes com álcool e uma esfoliação à base de clorexidina à base de iodo ou.
- Faça um ~ 2 cm de incisão vertical perto da espinha entre o arco costal direito e fêmur. Usar uma cobertura cirúrgica esterilizada em torno do local da incisão. Fixar as superfícies da pele incisão com grampos para manter a abertura.
Nota: Os retractores pode ser usado em vez das braçadeiras. - Em seguida, fazer uma segunda incisão (aproximadamente 1 cm) no peritoneu parietal sob a primeira incisão para abrir a cavidade abdominal. Fixar as superfícies abdominais incisão. Clipe da gordura do tecido que rodeia o tubo falópico e ovário ipsilateral com uma braçadeira para remover o ovário a partir da cavidade abdominal. Com cuidado, coloque o ovário e trompa de Falópio em gaze. Em seguida, coloque barriga para o lado do mouse para baixo sob o microscópio de dissecação.
- Colocar a suspensão de células em uma seringa de insulina (1/2 cc, 29 g) imediatamente antes da injecção. Cuidadosamente injectar a suspensão de células preparada (1- 2 ul) para o ovário. Para vários segundos, reter a agulha dentro do ovário para garantir a gelificação do hidrogel à base de ECM. Depois de a gelificação, as células de tumor injectadas no interior do ovário.
- voltar cuidadosamente o ovário no corpo. Suturar a segunda incisão com seda médica estéril e, em seguida, selar a pele com grampos de sutura.
- Após a cirurgia, os ratos serão administradas uma a analgesia (por exemplo, o meloxicam, intramuscular (IM) ou subcutânea (SC), 0,2 mg / kg) durante um período de 24 h inicial.
Tratamento 3. pós-cirúrgica
- Coloque cada rato em uma gaiola separada em papel limpo, com um pacote quente para manter o mouse morna até que recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Em seguida, retornar os animais para suas gaiolas de criação e de monitoramento. Monitorar os ratos por dia durante 3 - 7 dias após o tratamento cirúrgico.
- Monitoramento de ratos pós-operatória
- Em caso de sinais de dor, administrar analgesiasics diária (por exemplo, o meloxicam, IM ou SC, 0,2 mg / kg).
- Se os ratos têm sinais de infecção (por exemplo, vermelhidão, inchaço, secreção), administrar a injecção diária com um reagente anti-infeccioso (por exemplo, penicilina, im, 100.000 UI / kg).
- Remover materiais fechamento da pele 10 - 14 dias após o tratamento pós-cirúrgico.
4. Análise de tumores e metástases
NOTA: O tumor será formada nas injectados ovário de 2 - 3 semanas após a inoculação.
- Sacrificar os ratos por dióxido de carbono, e depois recolher as amostras (por exemplo, tumores, metástases e órgãos) 13-15 para posterior análise 14,16-20.
NOTA: Se um sistema de imagem in vivo está disponível, células portadoras de enzimas que produzem bioluminescência (por exemplo, a luciferase) ou a proteína fluorescente (por exemplo, GFP) pode ser utilizado no presente protocolo. Este protocolo modificado irá fornecer informações úteis paraa dinâmica da disseminação de células de cancro a partir do tumor primário.
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Representative Results
Seis ratinhos nus tinham os seus ovários inoculados com a linha de células de carcinoma de células claras humano ES-2, tal como descrito no presente protocolo. Como mostrado na Figura 1A, após 2 semanas, 5 dos 6 ratos tinha um tumor no ovário inoculados com células ES-2, mas não havia nenhum tumor no ovário contralateral sem inoculação (utilizado como um controlo). Além disso, 2 dos 5 camundongos mostraram várias disseminações peritoneal com ascite. Células metastizar para o fígado (Figura 1B). Os ovários, tanto com a massa do tumor no local da inoculação e no lado de controlo, foram dissecados, seccionadas, coradas com hematoxilina-eosina (HE), analisados e sob um microscópio (Figura 2). Um grande número de células de cancro do ovário foram observados no ovário inoculado, mas não sobre o lado contralateral. A morfologia das células foi o mesmo que o do tumor parental.
"Figura 1" src = "/ files / ftp_upload / 54353 / 54353fig1.jpg" />
Figura 1: formação de tumores por Ortotópico inoculação com claras humano, carcinoma celular de células ES-2. A e B, o / c nu / nu foram submetidos ratinho BALB ortotópico inoculação com células ES-2. Após 2 semanas, o rato foi sacrificado para necropsia. B, células metastizar para o fígado (como indicado pelas setas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Hematoxilina-eosina de Ovário com Ortotópico inoculação com claras humano, carcinoma celular de células ES-2. A e B, ovário com a inoculação de células ES-2, corados com hematoxilina-eosina (HE). coloração semelhante foi observada em comparação com a de carcinoma de células clarasno ovário humano. C e D, a coloração HE do ovário sem inoculação como controlo. As barras de escala, de 100 um (A, C), 20 | iM (B, D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os modelos animais são essenciais para analisar os mecanismos de desenvolvimento de tumores, progressão, metástase, e a eficácia do fármaco contra as células cancerosas. Os ratinhos portadores de células cancerosas do ovário humano, também têm sido usados como um modelo animal. Aqui, descrevemos um procedimento menos invasivo para a administração de células tumorais de ovário em um sítio ortotópico. Usando este procedimento, a inoculação para o ovário através de uma abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal oferece vantagens significativas sobre outras técnicas comumente usadas. Em primeiro lugar, a inoculação ortotópico pode fornecer resultados mais eficientes e precisos que refletem o ambiente tumoral em humanos 13,21. Em segundo lugar, esta abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal só precisa de uma pequena dissecção (<1 - 2 cm) por isso é um procedimento rápido em comparação com a abordagem peritoneal. Portanto, esta abordagem retroperitoneal é menos invasiva para os ratos. Em terceiro lugar, o ovário murino é muito pequena, e portanto incapaz de aceitar uma grande quantidade de áreasenhores. Neste procedimento apresentado, utilizar suspensões de células altamente concentradas (1 x 10 5 células / ml) e um baixo volume de inoculação (1-2 ul / injecção) como um tiro único; portanto, minimiza os danos ao ovário. Também evita a fuga de células inoculadas a partir do ovário. Embora mais investigação é essencial, a inoculação ortotópico de murino descrito pode ser uma abordagem útil para ajudar a desenvolver novas terapias para o tratamento de EOC no futuro.
Existem dois pontos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, as células são utilizadas na fase de crescimento logarítmica. Em segundo lugar, as células em suspensão com hidrogel à base de ECM são colocadas em gelo até à sua utilização. Quando o hidrogel à base de ECM começa a aquecer, o processo de gelificação começará. Para evitar a gelificação do hidrogel à base de ECM, as células ressuspensas com o hidrogel e instrumentos (por exemplo, tubos, seringas e agulhas) à base de ECM são mantidos em gelo até à sua utilização. Há uma limitação desta técnica.O volume de injecção da suspensão de células é inferior a 3 ul, porque o ovário do rato não pode aceitar um grande volume de inoculo.
Este protocolo pode ser modificado em alguns pontos. Se um sistema de imagem in vivo está disponível, as células que produzem enzimas tendo bioluminescência (por exemplo, a luciferase) ou a proteína fluorescente (por exemplo, GFP) pode ser utilizado no presente protocolo. Este protocolo modificado irá fornecer informação útil para a dinâmica da disseminação de células de cancro a partir do tumor primário. Além disso, este protocolo utiliza células ES-2 para a inoculação com ovário mouse. As células ES-2 são derivados de carcinoma de células claras, e esta linha celular apresenta crescimento agressivo no ratinho nu. Outras linhas de células (por exemplo, carcinoma seroso) também pode ser usado este protocolo, em vez de células ES-2.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem os membros do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Biologia do Câncer para suas discussões úteis e assistência técnica. Este estudo foi apoiado por uma Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) Grant-in-Aid para a Investigação Científica (15K15604; a H. Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
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